Parametry chemii klinicznej

3.5.6.1. Oznaczanie aktywności aminotransferaz - ALT i AST

Aminotransferazy są katalizatorami odwracalnych reakcji, w wyniku których następuje przeniesienie grupy aminowej z aminokwasu na ketokwas. Produktami tej rekcji są nowy ketokwas i nowy aminokwas. Aktywność obu enzymów oznaczano za pomocą testu firmy POINTE SCIENTIFIC.

Zasada oznaczenia aminotransferazy alaninowej (ALT)

Oparta jest na następujących reakcjach enzymatycznych:

1. L-alanina + α-ketoglutaran pirogronian + L-glutaminian

2. pirogronian + NADH + H⁺ L-mleczan + NADH⁺ + H2O

W pierwszej reakcji katalizowanej przez aminotransferazę alaninową (ALT) następuje przeniesienie grupy aminowej z L-alaniny na α-ketoglutaran, w wyniku czego powstaje pirogronian, który w następnej rekcji przy udziale dehydrogenazy mleczanowej (LDH) ulega redukcji do mleczanu. Reakcji towarzyszy utlenienie NADH do NAD. Równocześnie następuje spadek absorbancji przy długości fali 340 nm, który jest proporcjonalny do zmian aktywności ALT.

Zasada oznaczania aminotransferazy asparaginowej (AST)

1. L-asparaginian + α-ketoglutaran szczawiooctan + L-glutaminian

2. Szczawiooctan + NADH⁺ + H⁺ L-jabłczan + NAD⁺ + H₂O

W pierwszej reakcji katalizowanej przez aminotransferazę asparaginianową (AST) następuje przeniesienie grupy aminowej z L-asparaginianu na α-ketoglutaran, w wyniku czego powstaje szczawiooctan, który w następnej reakcji przy udziale dehydrogenazy jabłczanowej (MDH) ulega redukcji do L-jabłczanu. Reakcji towarzyszy utlenienie NADH do NAD. Równocześnie następuje spadek absorbancji przy długości fali 340 nm, który jest proporcjonalny do zmian aktywności AST.

ALT

LDH

AST

72

Przebieg oznaczenia

1 ml odczynnika inkubowanego wcześniej przez 5 minut w temperaturze 37ºC odmierzono do kuwety. Następnie dodano 100 µl osocza i dokładnie wymieszano. Pomiarów absorbancji dokonano przy długości fali 340 nm, w temperaturze 37ºC dokładnie po 1 minucie oraz przez następne 2 minuty w odstępach 30-sekundowych.

Obliczanie wyników

Aktywność aminotransferaz została obliczona według następującego wzoru:

IU/l = = Δabs/min 1768

1,1 – objętość całkowita 1000 – zamiana IU/ml na IU/l

6,22 – współczynnik absorbancji milimolowej 0,1 – objętość próbki

1 – długość drogi optycznej

3.5.6.2. Oznaczanie aktywności γ-glutamylotransferazy (GGT)

GGT jest katalizatorem reakcji przeniesienia grupy γ-glutamylowej z donora, którym mogą być peptydy γ-glutamylowe lub glutation na akceptor, takim jak α-aminokwas, substrat γ-glutamylowy lub glicylo-glicyna.

Zasada oznaczenia

Aktywność γ-glutamylotransferazy oznaczono za pomocą testu firmy ALPHA DIAGNOSTIC, opartego na następującej reakcji enzymatycznej:

L-γ-glutamyl-3-karboksy-4-nitroanilid + glicylo-glicyna γ-glutamylo-glicylo- glicyna + 5-amino-2-nitrobenzoesan

W reakcji katalizowanej przez γ-glutamylotranferazę (GGT) następuje przeniesienie grupy glutamylowej z substratu na cząsteczkę glicylo-glicyny, w efekcie której powstaje 5-amino-2-nitrobenzoesan. Szybkość powstawania tego produktu mierzona przy długości fali 405 nm jest proporcjonalna do aktywności GGT w badanej próbce.

73

Przebieg oznaczenia

1 ml odczynnika inkubowanego wcześniej przez 5 minut w temperaturze 37ºC odmierzono do kuwety. Następnie dodano 50 µl osocza i dokładnie wymieszano. Pomiarów absorbancji dokonano przy długości fali 405 nm, w temperaturze 37ºC dokładnie po 1 minucie oraz przez następne 3 minuty w odstępach 60-sekundowych.

Obliczanie wyników

Aktywność γ-glutamylotransferazy została obliczona według następującego wzoru:

IU/l = = Δabs/min x 2211

1,05 – objętość całkowita 1000 – zamiana IU/ml na IU/l

9,5 – współczynnik absorbancji milimolowej 5-amino-2-nitrobenzoesanu 0,05 – objętość pojedynczej próby

1 – długość drogi optycznej

3.5.6.3. Oznaczanie aktywności dehydrogenazy mleczanowej (LDH)

Dehydrogenaza mleczanowa jest enzymem z klasy oksydoreduktaz biorącym udział w rekcji utleniania kwasu mlekowego do pirogronianu oraz w reakcji odwrotnej – redukcji pirogronianu do mleczanu.

Zasada oznaczania

Aktywność dehydrogenazy mleczanowej oznaczono za pomocą testu firmy POINTE SCIENTIFIC, opartego na następującej rekcji enzymatycznej:

L-mleczan + NAD⁺ pirogronian + NADH + H⁺

W reakcji katalizowanej przez dehydrogenazę mleczanową następuje utlenianie

L-mleczanu do pirogronianu, z równoczesną redukcją NAD⁺ do NADH. Rekcji

towarzyszy zmiana absorbancji mierzonej przy długości fali 340 nm, która jest proporcjonalna do aktywności LDH w badanej próbie.

Przebieg oznaczenia

1 ml odczynnika inkubowanego wcześniej przez 5 minut w temperaturze 37ºC odmierzono do kuwety. Następnie dodano 25 µl osocza i dokładnie wymieszano.

74

Pomiarów absorbancji dokonano przy długości fali 405 nm, w temperaturze 37ºC dokładnie po 1 minucie oraz przez następne 2 minuty w odstępach 30-sekundowych.

Obliczanie wyników

Aktywność dehydrogenazy mleczanowej została obliczona według

następującego wzoru:

IU/l = = Δabs/min x 6592

gdzie:

1000 – zamiana IU/ml na IU/l 1,025 – objętość całkowita 0,025 – objętość próby

6,22 – współczynnik absorbancji milimolowej NADH 1 – długość drogi optycznej

3.5.6.4. Oznaczanie aktywności dehydrogenazy sorbitolowej (SDH)

Dehydrogenaza sorbitolowa (SDH) katalizuje proces utleniania sorbitolu do fruktozy przebiegający według reakcji:

Sorbitol + NAD⁺ fruktoza + NADH + H⁺

Zasada oznaczania

Aktywność dehydrogenazy sorbitolowej została oznaczona przy pomocy testu SIGMA DIAGNOSTIC, który polega na pomiarze szybkości spadku asorbancji przy długości fali 340 nm w roztworze zawierającym enzym oraz fruktozę.

Przebieg oznaczenia

Do kuwety odmierzono 1 ml roztworu NADH w buforze TRIZMA (przygotowanego

przez odważenie 4 mg NADH i uzupełnienie do 40 cm3 buforem TRIZMA). Następnie

dodano 25µl osocza krwi. Zawartość kuwety dokładnie wymieszano i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Po tym czasie dodano 0,25 ml β-D(-)fruktozy o stężeniu 72 g/dl i dokonano pomiarów absorbancji przy długości fali 340 nm, w temperaturze 25ºC, przez 5 minut w odstępach 60-sekundowych.

75

Obliczanie wyników

Aktywność dehydrogenazy sorbitolowej została obliczona według następującego wzoru:

SDH (sigma/ml) = = Δabs/min x 58000 x TC

1,5 – objętość roztworu reakcyjnego 60 – zamiana Δabs/min na Δabs/h 0,00622 – współczynnik mikromolowy 0,25 – objętość próbki

TC – korekta temperatury (dla temperatury 25ºC TC=1)

3.5.6.5. Oznaczanie stężenia kreatyniny

Zasada oznaczania

Oznaczenia wykonano wykorzystując test firmy POINTE SCIENTIFIC POLAND. Metoda polega na reakcji kreatyniny z kwasem pikrynowym w środowisku alkalicznym.

Szybkość powstawania kompleksu o żółtopomarańczowej barwie jest wprost proporcjonalna do stężenia kreatyniny w próbie. Pomiarów absorbancji dokonuje się przy długości fali 510 nm.

Przebieg oznaczenia

Odmierzono 1 ml odczynnika roboczego (mieszanina kwasu pikrynowego i wodorotlenku sodowego 1:5) do kuwety i inkubowano w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Dodano 50 μl próbki i zmierzono absorbancję wobec próby ślepej odczynnikowej po 1 minucie (abs. 1) i po 2 minutach (abs. 2).

Obliczanie wyników

Stężenie kreatyniny obliczono na podstawie wzorów: Różnica absorbancji:

76