Parametry jakości plamek

Interesującym podejściem jest wykorzystanie do filtracji parametrów opisujących jakość plamek, jednak nie będących wyłącznie miarą intensywności sygnału hybrydyzacyjnego informującego o zmianach ekspresji genów. Należy jednak przy tym zaznaczyć, że dostępność informacji o poszczególnych parametrach zależy od rodzaju oprogramowania użytego do analizy obrazów mikromacierzy. Różnego rodzaju parametry dotyczące charakterystyki jakościowej plamek można automatycznie określić między innymi za pomocą komercyjnego programu GenePix Pro bądź darmowego programu Maia [71]. Bar-Or i wsp. wykorzystując parametry jakości plamek uzyskane za pomocą programu Maia wykazali, że niektóre z nich charakteryzuje korelacja ze stopniem homologii sekwencji pomiędzy sondą a transkryptem, wyrażonym jako wartość Bit Score obliczona za pomocą programu BLAST. Wartość Bit Score jest znormalizowaną miarą podobieństwa pomiędzy dwiema sekwencjami, zależną od długości sekwencji i rozmiaru biblioteki. Stwierdzono również, że korelacja między parametrami jakości a Bit Score jest mniejsza w przypadku dalszego pokrewieństwa pomiędzy organizmami badanym i reprezentowanym na mikromacierzy. Wspomniana korelacja była niepełna, jednak sugeruje się, że jest to skutek niekompletnych informacji dotyczących sekwencji w bazach danych. Parametry wytypowane jako odzwierciedlające stopień dopasowania wymieniono w Tabeli 5. Dzięki odrzuceniu sond, które nie osiągnęły wartości progowych ustalonych dla wszystkich 5 parametrów, uzyskano znaczną poprawę wyników analizy skupień w 2 z 3 eksperymentów, co zdaniem autorów świadczy o możliwości wykorzystania charakterystyki morfologicznej plamek do filtracji danych w eksperymentach CSH [52]. Wnioski z opisanej pracy (w ograniczonej formie) wykorzystali inni badacze, np. stosując średnicę plamek jako kryterium filtracji [84].

36 Tabela 5. Dostępne w programie Maia parametry jakości plamek, które mogą odzwierciedlać stopień dopasowania sond i transkryptów, [52,71].

Parametr Opis Dodatkowe informacje

Det Współczynnik determinacji regresji liniowej pomiędzy intensywnością kanałów Cy3 i Cy5

Miara równomierności rozkładu sygnałów Cy3 i Cy5. Niższe wartości

świadczą o dużym wpływie

zmienności statystycznej, zwykle charakteryzującej plamki o małej intensywności, bądź też o obecności stosunkowo jasnych, lecz nie korelujących z ekspresją genu zanieczyszczeń.

Dia Średnica plamki Zależna od średniej wartości średnicy

plamek na całej mikromacierzy.

GSy Symetria geometryczna Miara odchylenia plamki od kształtu

koła. CVR Współczynnik wariancji pomiędzy

wartościami współczynników RR (współczynnik regresji) i RS (współczynnik segmentacji) opisujących zależności pomiędzy kanałami Cy3 i Cy5.

Wysoka wartość oznacza obecność dodatkowych pikseli w plamce lub dodatkowych pikseli na zewnątrz plamki.

CV Współczynnik wariancji pomiędzy wartościami współczynników ekspresji genów dla replik sond

Opisuje powtarzalność hybrydyzacji dla tych samych sond (możliwość stosowania jedynie dla replik sond)

37 I.4. ODPOWIEDŹ ROŚLIN NA STRES SOLNY I KADMOWY - STAN BADAŃ TRANSKRYPTOMICZNYCH

Rośliny jako organizmy nie posiadające możliwości przemieszczania się, są narażone na stałe oddziaływanie czynników stresowych ze strony środowiska. Stres abiotyczny w istotny sposób wpływa na plony roślin uprawnych, zmniejszając je nawet dwukrotnie. Przykładami stresowych czynników abiotycznych działających na rośliny są: susza, zalanie, nadmierne zasolenie, chłód lub wysoka temperatura, nadmiar lub niedobór światła oraz metale ciężkie [94]. W związku z ich działaniem, organizmy rozwinęły szereg mechanizmów obronnych, w ramach których dochodzi do zmian we wzorze ekspresji wielu genów.

Stres solny jest jednym z podstawowych czynników wpływających na produkcję rolną. Duży stopień zasolenia gleby zmniejsza światowe zbiory roślin uprawnych o około 20% [95]. Istniejąca wiedza na temat reakcji roślin na stres solny jest dość obszerna. Wiadomo, że wpływa on na gospodarkę wodną oraz homeostazę jonową rośliny. Akumulacja soli może modyfikować skład błon komórkowych i powodować stres hiperosmotyczny, zakłócając wzrost i rozwój rośliny. Znane są dwa rodzaje odpowiedzi rośliny, odmienne pod względem czasu występowania: krótkotrwała odpowiedź ochronna i długotrwała adaptacyjna. Geny odpowiedzi na stres możemy podzielić właśnie na takie dwie klasy [94]. Zaangażowanych w reakcję rośliny jest wiele genów tworzących zawiłą sieć zależności obejmującą szereg szlaków biochemicznych związanych z transdukcją sygnału, metabolizmem związków węgla, wytwarzaniem energii, ochroną przed stresem oksydacyjnym, gospodarką jonami sodu, modyfikacją struktury ścian i błon komórkowych, syntezą osmolitów i transporterów jonów, usuwaniem wolnych rodników i innych. W odpowiedzi biorą udział takie substancje jak: enzymy detoksyfikacji (np. peroksydaza glutationowa), osmolity (np. glicyna-betaina, LEA), flawoproteiny (np. HAL3). Odpowiedź na stres regulowana jest przy pomocy wielu czynników transkrypcyjnych, takich jak AP2/ERBP, DREB, SOS i innych [94]. W sygnalizację komórkową związaną ze stresem zaangażowane są również hormony, takie jak kwas jasmonowy, kwas abscysynowy czy etylen [94].

Istnieją liczne prace oceniające zmiany transkryptomiczne u roślin poddanych działaniu stresu solnego, jednak tylko nieliczne z nich dotyczyły specyficznej tkanki, jaką stanowią korzenie. Ponieważ są one odpowiedzialne za zaopatrzenie w wodę, stanowią pierwsze miejsce odbioru bodźców dla stresu osmotycznego [95]. W dotychczasowych badaniach stwierdzono odmienne profile ekspresji genów dla korzeni i części naziemnej

38 [96]. Z istotnych prac genomicznych z zastosowaniem mikromacierzy, badających działanie stresu solnego na korzenie roślin warto zwrócić uwagę na eksperymenty dla bawełny [100] oraz rzodkiewnika [95, 100]. Szczególnie w przypadku rzodkiewnika, eksperymenty pozwoliły nakreślić szczegółowy profil ekspresji genów w stresie solnym, obejmujący m.in. zmiany w zakresie aktywności genów osmoprotekcyjnych, sygnalizacji komórkowej i regulacji hormonalnej, budowie ściany komórkowej oraz transportu (por. V.4.1.1.) [95,100]. W przypadku rodziny Solanaceae, na uwagę zasługuje praca opisująca badanie stresu solnego w korzeniach pomidorów, która umożliwiła wytypowanie genów związanych z regulacją transkrypcji, metabolizmem ścian komórkowych oraz mechanizmami regulacji równowagi osmotycznej (geny SOS) [142].

Drugim czynnikiem stresowym, którego wpływ oceniano w niniejszej pracy jest chlorek kadmu. Kadm jest metalem ciężkim o działaniu toksycznym i jednym z pierwiastków zanieczyszczających środowisko, na działanie którego narażone są nie tylko rośliny, ale również ludzie i zwierzęta tworzące łańcuchy pokarmowe [97]. Związki kadmu absorbowane są przez korzenie i transportowane do organów wegetatywnych i generatywnych, wpływając negatywnie na szereg procesów życiowych rośliny, takich jak fotosynteza, synteza białek, aktywność enzymów, transport jonów itp. [97]. Rośliny wykształciły szereg mechanizmów obronnych związanych z odpowiedzią na działanie metali ciężkich, prowadzących do detoksyfikacji. Mechanizm odpowiedzi na działanie kadmu nie jest jeszcze tak szczegółowo poznany, jak w przypadku stresu solnego. Wiadomo, że związki kadmu w istotny sposób wpływają na ekspresję genów rośliny, która uruchamia procesy detoksyfikacji, polegające na wychwycie szkodliwych jonów, ich transporcie i sekwestracji w wakuoli. Z badań dotyczących działania kadmu na transkryptom korzeni roślin warto wskazać prace dotyczące rzodkiewnika [100], oraz ryżu [97]. Badania z wykorzystaniem mikromacierzy wskazują na tkankową specyficzność procesów ekspresji genów podczas odpowiedzi na stres wywołany obecnością jonów metali ciężkich. W korzeniach poddanych ich działaniu stwierdzono indukcję genów związanych z asymilacją/redukcją siarki oraz metabolizmem glutationu, prowadzącym do syntezy fitochelatyn [94]. Z kolei badanie korzeni rzodkiewnika poddanych działaniu kadmu pozwoliło zidentyfikować kategorie genów biorących udział w odpowiedzi: 1) geny wspólnej, konserwatywnej odpowiedzi ma stres; 2) geny związane z odpowiedzią charakterystyczną dla metalofitów; 3) geny specyficznej odpowiedzi na kadm [98]. Odpowiedź niespecyficzna może obejmować akumulację osmolitów, antyoksydantów, aminokwasów oraz zmiany w równowadze hormonalnej. W przypadku rodziny

39 Solanaceae jak dotąd wykonano niewiele badań transkryptomicznych dotyczących wpływu kadmu.