ZASTOSOWANIE CSH W ANALIZIE TRANSKRYPTOMÓW 1. Wpływ długości sond na jakość eksperymentów CSH

Wpływ długości sond oceniano porównując wyniki uzyskane przy zastosowaniu mikromacierzy TOM1 i TOM2, ponieważ pochodziły one z tego samego laboratorium i reprezentowały podobny zestaw transkryptów. Gwarantowało to uzyskanie maksymalnie dużej liczby danych do późniejszych porównań między mikromacierzami. Biorąc pod uwagę liczbę genów różnicujących oraz zbieżność z danymi referencyjnymi, zdecydowanie lepsze wyniki, wykazujące większe podobieństwo do uzyskanych w eksperymencie SSH, otrzymano stosując mikromacierze z sondami cDNA. W przypadku mikromacierzy TOM2 uzyskano niewiele danych o znaczeniu biologicznym, a geny różnicujące, pokrywające się z uzyskanymi na mikromacierzy referencyjnej, są nieliczne,

151 co w porównaniu z wynikami otrzymanymi z wykorzystaniem mikromacierzy TOM1, wskazuje jednoznacznie na przewagę mikromacierzy cDNA nad oligo w eksperymentach CSH. Wynik ten jest zgodny ze spostrzeżeniem wskazującym na większą liczbę genów różnicujących i lepsze parametry FDR uzyskiwane przy pomocy dłuższych sond [58]. Nawet w przypadku wyselekcjonowania puli 600 sond o najlepszych parametrach statystycznych (top600), skuteczność mikromacierzy cDNA była zdecydowanie wyższa. Mimo iż takiego stanu rzeczy można było oczekiwać na podstawie wcześniejszych prac [40,56,77,78], spodziewano się jednak nieco większej specyficzności sond oligo. Co ciekawe, w zbiorze prac porównujących hybrydyzację mikromacierzy cDNA i oligo, można znaleźć doświadczenia wskazujące na niższą specyficzność mikromacierzy oligo w porównaniu z mikromacierzami cDNA (320-390 pz,) wynikającą z większej podatności na hybrydyzację krzyżową [197]. Stwierdzono, że hybrydyzacji krzyżowej sprzyja wyższe od 75% podobieństwo niespecyficznego transkryptu do sondy oraz obecność w pełni komplementarnych do transkryptu odcinków sondy o długości powyżej 15 zasad. Zatem w pracy tej podważono jeden z wyżej przytaczanych argumentów przemawiających za stosowaniem mikromacierzy oligo, mówiących o większej specyficzności wiązania transkryptów przez sondy. Równocześnie badane sondy wykazywały podobną czułość, określoną jako zdolność do wykrycia 3-krotnej różnicy w stężeniu dodawanych do próby transkryptów o znanej ilości. Autorzy nie negują przydatności sond oligo w zastosowaniach mikromacierzowych, a jedynie wskazują na konieczność starannego ich projektowania i znaczenie dostępności sekwencji DNA. Zatem, zgodnie z tymi spostrzeżeniami, w przypadku CSH, w której prawdopodobieństwo przyłączenia do sondy kilku podobnych transkryptów jest większe niż w tradycyjnej hybrydyzacji, stosowanie mikromacierzy oligo wymagałoby znacznie bardziej szczegółowej filtracji danych pod kątem podobieństwa sekwencji, uwzględniającej powyższe warunki [197].

Z kolei, w przypadku sond cDNA problemem mogą być trudności w identyfikacji rzeczywistych transkryptów reprezentowanych na mikromacierzach, nawet w przypadku SSH – sekwencje sond są tylko częściowo znane, dodatkowo często transkrypty roślin obecne w bazach danych mają postać kontigów (ciągów częściowo zachodzących na siebie sekwencji), które mogą zawierać błędy. Ponadto w przypadku większości roślin sekwencje te najczęściej są adnotowane na podstawie analiz funkcjonalnych, np. z wykorzystaniem genów rzodkiewnika. W takim przypadku dysponujemy zatem sondą „prawdopodobnie” reprezentującą dany kontig, ten z kolei tylko „prawdopodobnie” jest funkcjonalnym odpowiednikiem genu w roślinie modelowej. Wynik uzyskany przy pomocy takiej sondy

152 odnosimy do cDNA z organizmu badanego, który „prawdopodobnie” jest homologiem genu „prawdopodobnie” reprezentowanego na mikromacierzy. Biorąc pod uwagę tak dużą niepewność, nawet pomimo uzyskanych lepszych wyników dla sond cDNA niż w przypadku sond oligonukleotydowych, należy zachować dużą dozę ostrożności podczas wnioskowań dotyczących ekspresji poszczególnych genów. Dodatkowo warto tutaj wspomnieć o kwestii ogromnej zmienności genetycznej organizmów już na poziomie wewnątrzgatunkowym, na co wskazuje szereg badań. Przykład mogą stanowić wyniki eksperymentów Rna-seq dla kukurydzy - wskazujące na obecność lub brak niektórych transkryptów w zależności od odmiany [185]. Biorąc to pod uwagę, należy liczyć się z faktem, że każda analiza oparta o hybrydyzację jest ograniczona tylko do zestawu sond reprezentowanych na mikromacierzach, a istnienie genomu referencyjnego nie gwarantuje pełnej reprezentacji transkryptomu nawet w przypadku pracy na poziomie innej odmiany danego gatunku, nie wspominając już o badaniach międzygatunkowych.

V.3.2. Wpływ pokrewieństwa gatunku badanego i reprezentowanego na mikromacierzy na jakość CSH

Biorąc pod uwagę stosunkowo niewielką liczbę mikromacierzy w kontekście istniejących gatunków, istnieje duże prawdopodobieństwo, że wybór badacza będzie oczywisty i ograniczony tylko do jednej mikromacierzy, lub też może wystąpić sytuacja, w której zbyt duża odległość filogenetyczna uniemożliwi wykonanie eksperymentów. Niemniej, jednak, w przypadku istnienia kilku mikromacierzy w obrębie jednej rodziny (tak jak dla Solanaceae, Brassicaceae) (por. Tabela 2), może zaistnieć konieczność wyboru najlepszej mikromacierzy spośród kilku opcji. W przypadku tego porównania analizowano eksperymenty wykonane na mikromacierzach cDNA dla pomidora i ziemniaka zawierających sondy o zbliżonym, choć niedokładnie określonym stopniu podobieństwa sekwencji do tytoniu i odznaczających się podobną liczbą sond użytkowych. Jeśli założyć, że elementem warunkującym jakość eksperymentów CSH jest podobieństwo sekwencji gatunków [55,57,80] nie powinno się uzyskiwać dużej rozbieżności wyników pomiędzy dwiema mikromacierzami w tych samych warunkach eksperymentalnych. Z punktu widzenia statystyki korelacji pojedynczych genów różnicujących, uzyskane wyniki wskazują na lepszą zgodność z danymi referencyjnymi (TOB) mikromacierzy POT. Z kolei ilościowe spojrzenie na dane uzyskane w wyniku analiz GO nie wskazuje tak jednoznaczne na przewagę jednej z mikromacierzy. Gorsze wyniki analizy na podstawie kategorii GO specyficznych gatunkowo mogą być uzasadnione ponad trzykrotnie większą

153 liczbą kategorii GO przyporządkowanych sondom TOM1, czego skutkiem może być brak niektórych kategorii w analizie mikromacierzy POT.

Tabela 32. Liczba kategorii GO dostępnych dla mikromacierzy POT i TOM1

POT TOM1

Kombinacje GO-sonda 16242 66851

Liczba sond posiadających GO 8837 6811

Liczba unikatowych GO 1169 3342

Rycina 40. Średnia intensywność sygnału (Sig) dla wszystkich sond na poszczególnych