Próby znalezienia sekwencji promotora jhbp oraz poznania iloci kopii genu w genomie

Pierwsz technik zastosowan w celu poznania promotora genu lub sekwencji niekodujcych byá Southern Blotting (Sambrook i Russell, 2001). Wstpnym krokiem do zastosowania tej techniki jest izolacja wysokiej jakoci DNA genomowego, którego przecitna dáugoü fragmentów powinna wynosiü nie mniej ni* 100 000 pz. Izolacj wykonano wedáug przepisu zawartego w podrozdziale 6.2.2 a jego jakoü sprawdzono elektroforetycznie. Otrzymane DNA byáo niezdegradowane i miaáo wymagan dáugoü. W celu uzyskania krótszych fragmentów w granicach 3000 - 6000 pz poddano wyizolowany materiaá genetyczny trawieniu enzymatycznemu. Wedáug danych statystycznych, enzymami, które tn DNA genomowe D. melanogaster w oczekiwanych przedziaáach dáugoci s midzy innymi EcoRI - cicie statystycznie co okoáo 4000 pz i HindIII - cicie co okoáo 3000 pz (www.neb.com). Poniewa* D. melanogaster jest najbli*ej spokrewnionym z G. mellonella organizmem, dla którego poznana zostaáa sekwencja genomu wic zaáo*ono, *e w tym przypadku czstotliwoü cicia DNA bdzie podobna. Dlatego trawiono DNA wy*ej wymienionymi enzymami. Poniewa* trawienie nie zachodziáo do koca, powstaáa pula fragmentów o zró*nicowanych dáugociach widoczna na zdjciu jako cignca si smuga (Rys. 11, lad 1, 2, 3). Cicie HindIII zgodnie z danymi statystycznymi daáo pul fragmentów dáu*szych ni* cicie EcoRI, co widoczne jest na Rys. 9 w ladzie 2 w postaci mocniejszego zaczernienia w obszarze dáu*szych fragmentów. Elektroforez genomowego DNA trawionego wy*ej wymienionymi enzymami prowadzono w trzech powtórzeniach, ale na jednym kawaáku *elu. Pozwoliáo to uniknü bádów zwizanych ze zmian warunków elektroforezy, które mogáyby si pojawiü gdyby prowadzono trzy niezale*ne rozdziaáy elektroforetyczne. )el nastpnie podzielono na trzy czci, zawierajce identyczne lady. Pierwsza czü *elu zostaáa zu*yta w celu przeniesienia DNA na báon nylonow, druga posáu*yáa jako (ródáo materiaáu genetycznego do klonowania, a trzecia stanowiáa rezerw w przypadku niepowodzenia

Rys. 11 Strategia poszukiwania sekwencji niekodujcych metod Southern Blotting. Zdjcie na górze przedstawia obraz DNA genomowego po elektroforezie w 0,6% *elu agarozowym. lad 1 - DNA trawione enzymem EcoRI, lad 2 - DNA trawione

HindIII, lad 3 - DNA trawione EcoRI i HindIII, lad M - marker GeneRuler 1 kbp DNA Ladder (Fermentas). Czü *elu I wykorzystano do przeniesienia DNA genomowego na báon nylonow. Báon nastpnie hybrydyzowano ze znakowan izotopem 32P sond powstaá na matrycy DNA genomowego w reakcji PCR ze starterami JR18 i JR21. Czü *elu II wykorzystano w celu wycicia ze ladu 1 fragmentu zawierajcego DNA o dáugoci ~6000 pz. Strzaákami oznaczono widoczne po hybrydyzacji specyficzne pr*ki, wladzie 1 o dáugoci ~6000 pz oraz w ladzie 2 o dáugoci ~ 3800 pz oraz w ladzie 3 o dáugoci ~2000 pz.

któregokolwiek z eksperymentów (Rys. 11). W dowiadczeniu jako sondy do hybrydyzacji u*ywano dsDNA znakowanego izotopem ³²P, który powstaá poprzez amplifikcj DNA genomowego w PCR za pomoc dwóch starterów JR18 i JR21. Startery te obejmuj fragment 293 pz od strony 3' sekwencji kodujcej wraz z kodonem stop. Poniewa* w reakcji jako matrycy u*yto DNA genomowego otrzymano fragment znacznie dáu*szy ni* oczekiwano, bo okoáo 1200 pz. wiadczyáo to o tym, *e w badanym obszarze prawdopodobnie znajduj si sekwencje niekodujce - introny. Nie wiadomo byáo jednak ile ich jest i jakiej s dáugoci, a u*ywana wtedy metoda sekwencjonowania nie pozwalaáa na poznanie caáej sekwencji tego odcinka. Po amplifikacji powy*szy fragment DNA zaznakowano izotopem i wykorzystano w dalszej czci eksperymentu do hybrydyzacji.

Po przeniesieniu DNA z *elu agarozowego na báon nylonow poprzez transfer kapilarny ustalano warunki hybrydyzacji, aby uzyskaü specyficzne pr*ki. Po kilku próbach, w których zmieniano temperatury inkubacji i páukania oraz st*enia buforów ostatecznie ustalono, *e najwy*sz specyficznoü uzyskuje si w nastpujcych warunkach: (1) prehybrydyzacja - temp. 65,5˚C, bufor 1xSSC z 2% SDS, czas 2 godziny; (2) hybrydyzacja - temp. 65,5˚C, bufor 1xSSC z 2% SDS, czas 20godzin; (3) páukanie (x4) - pierwsze w temp. pokojowej, pozostaáe w temp. 65,5˚C, bufor 0,5xSSC z 0,1% SDS, czas 2-3 minuty. Po inkubacji ze znakowan sond i páukaniach báon poddano wizualizacji w aparacie Fuji Film FLA-3000 Fluorescent Image Analyzer (Raytest Isotopenmegeräte GmbH, Germany), po uprzedniej ekspozycji na páyt odwzorowujc (Imaging Plates BAS-MS 2325 i/lub 2340, Fuji Photo Film, Japan). W puli DNA trawionego HindIII stwierdzono obecnoü wyra(nego pr*eka o dáugoci okoáo 6000 pz (Rys. 11, lad 1), natomiast w puli citej EcoRI jest pr*ek o dáugoci okoáo 3800 pz. W przypadku trawienia obydwoma enzymami jest widoczny bardzo sáaby pr*ek o dáugoci okoáo 2000 pz. Istnienie pojedynczych pr*ków w poszczególnych ladach wiadczy o tym, *e w genomie G. mellonella znajduje si tylko jedna kopia sekwencji jhbp.

Poniewa* pr*ek o dáugoci 6000 pz najprawdopodobniej zawieraá najwicej sekwencji niekodujcych i w jego przypadku byáa najwiksza szansa na to, *e obejmie obszar promotorowy, dlatego podjto prób jego analizy. DNA pochodzce z obszaru, w którym jest widoczny pr*ek pozyskano z *elu II wycinajc ze ladu 1 jego kawaáek obejmujcy dáugoü w przybli*eniu 6000 pz. DNA wyizolowano z *elu i podano ligacji do wektora pTZ57R. Tak powstaáy konstrukt namno*ono w bakteriach i oczyszczono. Na uzyskanym DNA plazmidowym przeprowadzono kontrolny PCR przy u*yciu tych samych, co do amplifikacji sondy starterów (JR18 i JR21), aby sprawdziü czy wklonowano wáaciwy fragment (Rys.12, lad 1). Obraz po elektroforezie sugerowaá, *e konstrukt zawiera DNA z jhbp. Próbowano wic przy u*yciu starterów specyficznych do sekwencji kodujcej (np. JR18, JR17) oraz

starterów skierowanych do wektora (WRA 202, WRA 203) amplifikowaü nieznany fragment DNA jhbp, który mo*naby nastpnie poddaü sekwencjonowaniu. W PCR uzyskiwano wiele niespecyficznych produktów (artefaktów), o dáugoci niezgodnej z oczekiwan lub nie otrzymywano *adnych produktów. Mimo wielokrotnych prób dopracowania warunków reakcji amplifikacji nie udaáo si osignü zdefiniowanego produktu jak to miaáo miejsce dla reakcji kontrolnej z 2 specyficznymi starterami JR 18 i JR 21 (Rys. 12, lad 1). Niestety nie udaáo si uzyskaü *adnego specyficznego produktu. Przyczyny powy*szych problemów zostaáy omówione w dyskusjii, w rozdziale 8.1.1, pt.”Wybór strategii sekwencjonowania”.