5.2 Geom etria i struktura elektronowa klastera A
5.2.2 Pro tonowany klaster A
D ośw iadczalnie stwierdzono, że dw uelektronow o zredukow any klaster A (A-red2) je s t nietrwały, a protonacja je s t jednym ze sposobów stabilizacji jego struktury [19]. Z tego względu, optym alizacji geom etrii poddano form y kla
stera A z protonem na wszystkich stopniach utlenienia, a jak o m iejsca protona- cji uw zględniono atom Nip oraz atom y siarki (S I, S2, S3, S6; m iejsca oznaczone strzałkam i, Rysunek 5.5).
O bliczenia uwzględniające protonację klastera A zostały w ykonane po raz pierw szy i opublikowane w pracy [80], Zoptym alizow ane param etry strukturalne dla m odeli klastera A z protonem , odpow iadające najniższej energii (Tablica 5.5) zostały zebrane w Tablicy 5.6. Na R ysunku 5.9 pokazano zoptym alizow ane geo
m etrie protonow anych struktur, otrzym ane dla ==20. W Załączniku B znajdują się Tablice B I, B2 i B3, które zaw ierają energie, w ybrane param etry geom e
tryczne, gęstości spinowe oraz ładunki NBO dla m odeli M l - H (Ared2) i M 3-H (A recii i A red2) dla wszystkich rozpatryw anych m iejsc protonacji. W artości naj
niższej energii dla zostały podane pogrubioną czcionką.
D la form utlenionych (Aox) w szystkich rozpatryw anych m odeli klastera A, najniższą energię m ają struktury gdzie protonacja m a m iejsce na atom ie siarki S2 (A ox-S2H ), a cząsteczka wody nadal zw iązana je st z atom em N ip. Protonacja struktur zredukow anych prowadzi do pow stania w odorków (A re(il-NiH i A red2- N iH ), w których proton związany jest z proksym alnym atom em niklu (Nip). A na
lizując odległości zawarte w Tablicy 5.6 widać, że dla w szystkich protonow anych m odeli znaleziono tylko jed n ą konform ację klastera A. D la m odeli MO-H i M l - H m ożna ją uznać za pośrednią m iędzy konform acją zw artą, a rozw artą. D la m o
delu M l - H odległość Nip-F el jest w iększa niż dla m odelu M 3-H , poniew aż m oż
liw ość zginania kąta F e l-S6-Nip jest dodatkow o (oprócz zam rożonych atom ów w ęgla) zablokow ana przez obecność reszt am inokw asow ych. Interesująca jest do
5.2 Geometria i struktura elektronowa klastera A
b ra zgodność (~ 0 .1 A, e=20) geom etrii protonow anych struktur dla m odeli M l - H i M 3-H z danym i krystalograficznym i dla 1RU3 (Tablica 5.1) [51].
A ox-S2H A^-NiH A^-NiH
MO-H * * r
M1-H ^
R ysunek 5.9: Zoptymalizowane geometrie protonowanych struktur klastera A na róż
nych stopniach utlenienia. Wyniki otrzymano metodą DFT/BP8 6 w bazie funkcyjnej TZYP z zastosowaniem modelu PCM/e=20. Przedstawiane są tylko te struktury spośród rozpatrywanych miejsc protonacji, którym odpowiada najniższa energia
5.2 Geometria i struktura elektronowa klastera A
Tablica 5.5: Energia struktur zoptymalizowanych protonowanych modeli klastera A na różnych stopniach utlenienia. Wyniki obliczeń metodą DFT/BP8 6 w bazie funkcyjnej TZVP z zastosowaniem modelu PCM/e=4, 12, 20, 80
M O D E L £= 4 12 20 80
MO-H Ł A D U N E K S P I N E +12820[a.u.]
A ox-S2H -1 0 -5.89909 -5 .9 2 2 8 4 -5.92509
Aredl-N iH -2 1/2 -6.01680 -6.0 6 0 3 4 -6.06909
A red2-NiH -3 0 -6.11394 -6.2 0 1 4 4 -6.2 1 8 6 0
M l-H E +13390[a.u.]
A ox-S2H -1 0 -9.38704 -9.40845 -9.41358 -9.41989
A retil-N lH -2 1/2 -9.5 1 5 1 0 -9.55262 -9.5 6 0 6 6 -9.56998
A redl-N iH “) -2 1/2 -9.51291 -9 .5 5 0 5 0 -9 .5 5 8 5 6 -9.56793
A red2-NiH -3 0 -9.61206 -9.68538 -9.70081 -9.71860
M 3-H E +16030[a.u.]
A ox-S2H -1 0 - -0 .62189 -0.63085 -0.64225
A re^i-N iH -2 1/2 - -0.78317 -0.79151 -0.80173
A'/~ed2 -N lH -3 0 - -0 .93486 -0.9 4 6 5 7 -0.96073
O dległość N ip-S4= 2.9
A
została zamrożona w trakcie optym alizacji5.2 Geometria i struktura elektronowa klastera A
5.2 Geometria i struktura elektronowa klastera A
O dległość N ip-S 4= 2.9 A została zamrożona w trakcie optym alizacji
5.2 Geometria i struktura elektronowa klastera A
W Tablicy 5.7 zebrano gęstości spinowe i ładunki NBO struktur klastera A z protonem dla e = 4 ,12,20 i 80. Dla m odelu M l - H w strukturze jednoelektronow o zredukow anej ( Aredi) niesparowany elektron znajduje się na kubanie żelazo- siarkow ym [Fe4-S4], Gęstość elektronow a w zależności od £ w ynosi od -0.671 do -0.870. Dla dużego modelu M 3-H obserw uje się obniżenie gęstości spinowych w stosunku do m niejszych modeli, co m oże być spowodowane przesunięciem ła
dunku na skutek tworzenia się wiązań w odorow ych pom iędzy resztam i amino- kw asow ym i białka oraz atomami siarki i tlenu należącym i do klastera A.
5.2.3 K laster A z Ugandami
O bliczenia optym alizacji geometrii wykonano rów nież dla klastera A z li- gandam i. W ybrano takie molekuły, które w trakcie procesu katalitycznego łącza się z proksym alnym atomem niklu (Nip). O bliczenia z grupą karbonylow ą (-CO) przeprow adzono dla jednoelektronow o zredukowanej struktury, która została wy
kryta eksperym entalnie (układ NiFeC) [60-62], Z ligandem m etylow ym (-C H 3) optym alizację wykonano dla struktury dw uelektronow o zredukow anej, ponieważ została ona stw ierdzona doświadczalnie [57, 8 6], W form ie utlenionej klaster A zaw iera cząsteczkę wody skoordynow aną do atom u Nip. O becność innych ligan- dów m. in. m rów czanu, SO, CO2 czy azydku jest sugerow ana pracach ekspe
rym entalnych [43, 82, 83]. Autorzy artykułu opisującego strukturę krystalogra
ficzną IOAO [43] w ychodzą z propozycją, że je s t to anion m rówczanowy. Z kolei udział jo n u OH~ w m echanizm ie katalitycznym enzym u ACS sugerują autorzy pracy [87], U zasadnia to wybór ligandów prezentow anych w niniejszej pracy.
N a R ysunkach 5.10 i 5.11 przedstaw iono zoptym alizow ane geom etrie kla
stera A na różnych stopniach utlenienia dla m odeli M l - L i M 3-L z Ugandami (-O H , -C O , - C H3-H C O O ) dla £=20. W Tablicy 5.8 zam ieszczono w artości ener
gii zoptym alizow anych struktur, a w Tablicy 5.9 zebrano wybrane, zoptym alizo
wane odległości m iędzy atomami. K om pleksy A ox-O H , A red2- C H 3, A ox-H C O O i A re ^ -N iH -H C O O zawierają atom niklu na + 1 1 stopniu utlenienia, dla którego otoczenie Nip je s t planarne. D la tych struktur różnice odległości m iędzy atom am i, porów nując m odel M l - L i M 3-L (Tablica 5.9), m ieszczą się w zakresie 0 .0 2 - 0.07 A. W kom pleksach A red i-C O , A red i-H C O O i A red2-H C O O nikiel w ystę
puje na + 1 stopniu utlenienia i charakteryzuje się tetraedryczną lub zniekształ
coną tetraedryczną koordynacją. Porów nując te struktury, pom iędzy m odelam i M l - L i M 3-L, m ożna zauważyć duże różnice w w artościach odległości N ip-F e l.
Szczególnie uw idacznia się to dla struktury A refn - C O , gdzie odległość N ip-F el dla m odelu M l - L m a wartość 4.100 A, podczas gdy dla m odelu M 3-L w ynosi
o
3.298 A (Tablica 5.9, £=20). Odnosząc się do danych literaturow ych zebranych w Tablicy 5.1 widać, że tak duże odległości N ip-F e l w ystępują dla atom ów Zn (3.736
A,
[43]) i Cu (3.471A
i 3.545A,
[82]) w m iejscu M p. Strukturatetra-5.2 Geometria i struktura elektronowa klastera A
edryczna m a konform ację najbardziej rozw artą, a białko zapobiega jej pełnej re laksacji.
G ęstości spinowe i ładunki NBO dla m odeli klastera A na różnych stop
niach utlenienia z Ugandami (-O H , -C O , - C H 3, -H C O O , -H ) zostały przed staw ione w Tablicy 5.10. W cząsteczce A redl-CO niesparow any elektron zloka
lizow any je s t głównie na atom ie N ip, co potw ierdza konfigurację elektronow ą [Fe4S4JNip+ (CO)Ni^+ . Zw iększenie gęstości elektronow ej w ynoszące 0.262 dla m odelu M l - L (Tablica 5.10, e=20) m ożna zauw ażyć także w tej strukturze na dystalnym atom ie niklu (Nid). D w uelektronow o zredukow any m etylow any kla
ster A (A red2-C H 3) posiada m ałą, rów ną 0.006 dla m odelu M l - L (Tablica 5.10, e=20) gęstość spinow ą na Nip i jego konfiguracja elektronow a m oże być opisana ja k o [Fe4 S4]2+ Nip+ (CH3)Ni^+ .
R ysunek 5.10: Zoptymalizowane geometrie klastera A z Ugandami (-OH, -CO , -C H 3) na atomie Nip. Wyniki otrzymano metodą DFT/BP8 6 w bazie funkcyjnej TZVP z zasto
sowaniem modelu PCM/e=20
5.2 Geometria i struktura elektronowa klastera A
R ysunek 5.11: Zoptymalizowane geometrie klastera A na różnych stopniach utlenienia z anionem mrówczanowym jako ligandem na atomie Nip dla modeli M l i M3 oraz dla struktury z protonem. Wyniki otrzymano metodą DFT/BP8 6 w bazie funkcyjnej TZVP z zastosowaniem modelu PCM/e=20
Tablica 5.8: Energia struktur zoptymalizowanych dla modeli klastera A na różnych stop
niach utlenienia z ligandami (L=-OH, -CO , -C H3, -HCOO, -H ). Wyniki obliczeń me
todą DFT/BP8 6 w bazie funkcyjnej TZVP z zastosowaniem modelu PCM/e=12, 20, 80
M O D E L 6 — 12 20 80
M l-L Ł A D U N E K SPIN E +13300[a.u.]
A o x - O H -3 0 -9 8 .4 8 8 2 2 -98.50411 -98.5225
A r e d l C O -3 1/2 -136.01351 -1 3 6 .0 2 8 8 9 -136.04671
A r e d 2 - C H 3 -3 0 -6 2 .5 3 0 7 4 -62 .5 4 6 3 3 -62 .5 6 4 3 6
E +13510[a.u.]
A r a - H C O O -3 0 -1.8 9 0 7 7 -1.90641 -1.92487
A r e d l - H C O O -4 1/2 -1.9 8 7 3 7 -2 .0 1 3 8 0 -2.0 4 4 6 4
A r e d2- H C O O -5 0 -2.06035 -2.1 0 0 1 5 -2 .1 4 8 1 4
A r e d2- N i H - H C O O -4 0 -2.5 8 7 4 2 -2 .5 9 6 6 2 -2 .6 2 7 8 0
M 3-L E +15900[a.u.]
A o x - O H -3 0 -1 2 9 .7 3 6 1 7 -1 2 9 .7 4 8 3 0 -1 2 9 .7 6 3 1 0
A r e d l - C O -3 1/2 -1 6 7 .2 4 8 2 6 -167.25981 -1 6 7 .2 7 3 7 8
A r e d2- C H3 -3 0 -9 3 .7 8 2 5 0 -9 3 .7 9 4 1 2 -93 .8 0 8 1 5
E +16140[a.u.]
A 0 * - H C O O -3 0 -3.1 2 9 8 9 -3 .1 4 1 9 4 -3.1 5 6 4 9
A r e d l - H C O O -4 1/2 -3.2 4 2 4 9 -3 .2 6 0 0 9 -3.2 8 2 9 5
A r e d2—H C O O -5 0 -3.36457 -3 .3 6 6 5 3 -3 .40182
A r e d2- N i H - H C O O -4 0 -3.82655 -3.8 4 5 9 4 -3 .86970
5.2 Geometria i struktura elektronowa klastera A
Tablica5.10: Gęstości spinowei ładunki NBOdla modeliklasteraA naróżnychstopniachutlenieniaz ligandami (L=-OH, -CO, -CH3, -HCOO, -H).Wyniki obliczeńmetodąDFT/BP86w bazie funkcyjnej TZVP z zastosowaniemmodeluPCM/e=12, 20, 80
5.2 Geometria i struktura elektronowa klastera A
os co co co o —1
L 0.0310.038 0.032 -0.783-0.781-0.7780.053 0.0510.050 -0.747 -0.757-0.758 Ared2-NiH-HCOONip-0.165-0.183-0.173-0.237 -0.216 -0.231-0.107 -0.110 -0.116 -0.254 -0.254 -0.249 Nid -0.011-0.012 -0.012 0.0400.044 0.042 -0.003 -0.005 -0.006 0.0620.0610.060 Fe4S4 0.098 0.115 0.105 -0.751-0.775-0.7860.0410.0510.053 -0.566 -0.568-0.574 L 0.000 0.000 0.000 0.023 0.031 0.020 0.000 0.000 0.000 0.025 0.028 0.020
5.3 pKa
5.3 pK«
W Tablicy 5.11 zostały zebrane wartości p K a obliczone ze wzoru 5.22 dla m odeli klastera A na różnych stopniach utlenienia, natom iast na Rysunku 5.12 pokazano ich zależność od stałej dielektrycznej e. Do w yliczenia w artości pK a zostały użyte struktury protonowane o najniższej energii zebrane w Tablicy 5.5 (A0X-S2H, A rerfl-NiH i A red2-NiH). Do Tablicy 5.11 i R ysunku 5.12 w łączono także wartości pKa dla struktur A ox-OH i A red2-H C O O dla m odeli M l - L i M 3-L.
Tablica 5.11: Wartości pKa obliczone dla modeli klastera A na różnych stopniach utle
nienia. Wyniki obliczeń metodą DFT/BP86 w bazie funkcyjnej TZVP z zastosowaniem
m o d e lu P C M /ć= 4 , 12, 2 0 , 80. W artości p K a d la m o d elu M 2 n ie b y ły w y z n a c z a n e
£= 4 12 20 80 4 12 20 80
M O D E L MO MOa
A ox 8.5 -0.9 -4.1 16.0 - 5.4 2.6
A r e d l 25.3 3.7 -0.4 27.2 - 7.0 3.0
A re e i2 52.1 21.3 15.3 55.3 - 25.9 19.0
M O D E L M l M la 10
A ox - - - 11.4 2.5 0.8 -1.1
A r e d l 24.2 8.9 5.1 1.5 25.2 10.2 6.4 2.9
A r e d 2 46.0 22.7 17.4 12.1 55.8 32.8 27.6 22.2
M O D E L M2 M3
A ox - - - - -8.0 -7.9 -7.5
A Xe rfl - - - - 0.7 -1.2 -2.6
A Xerf2 - - - - 17.7 15.6 12.6
M O D E L M l-L M3-1L
A o x - O H - 16.0 12.8 9.2 - 10.7 9.1 7.2
A r e d 2 - H C O O - 40.7 26.6 18.9 - 28.2 18.8 11.9
D la struktury A reai odległość N ip-S4= 2.9 A została zam rożona w trakcie optym alizacji.
Struktura A ox-OH została wzięta pod uwagę, celem spraw dzenia czy praw do
podobne jest aby grupa - O H - była zw iązana z atom em Nip [87], podczas gdy struktura A red2-HCO O może być zaangażow ana w m echanizm redukcji utlenio
nej form y klastera A. A naliza obliczonych wartości pK a nasunęła kilka wniosków.
Stała dielektryczna £ - 4 nie odtwarza praw idłow o pK a, otrzym ane wartości są zbyt duże, dlatego też została pom inięta w obliczeniach dla dużych m odeli M 2 i M3.
W artości pK a obliczone dla A ox i A retn są m ałe dla w szystkich zastosowanych m odeli. D la form A red2 wyliczone wartości pK a są zaw sze w iększe od 7, co po
tw ierdza, że w warunkach fizjologicznego pH, istnieją one w form ie protonow a- nej. Podobnie jest dla struktury A ox-OH (m odel M l-L ), gdzie obliczona wartość p K a je s t rów na 12.8 (Tablica 5.11, e=20). W środow isku obojętnym , jo n O H
-5.3 pK a
będzie ulegał protonacji co oznacza, że form a utleniona klastera A będzie koor
dynow ać w odę a nie anion hydroksylowy. W artości pK a obliczone dla struktury A red2-H CO O są zbliżone dla M 3-L (18.8) i M 3 (15.6) dla £=20. R ysunek 5.12 pokazuje bardziej ogólną zależność, że w raz ze w zrostem w artości stałej dielek
trycznej e m aleje wartość pK a. N ajw iększa zm iana w artości pK a w ystępuje dla m ałego m odelu MO, a najm niejsza dla m odelu M 3. O becność reszt am inokw aso- w ych obniża wartość pK a o około 2 jednostki (z 17.4 dla M l do 15.6 dla M 3, e=20).
R ysunek 5.12: Zależność wartości pKa od stałej dielektrycznej e dla modeli klastera A stosowanych w obliczeniach. W panelach umieszczono różne stopnie utlenienia kla
stera A: a) A ox, b) A recn, c) A rej 2 , d) Aox-OH i Arecj2-HCOO. Kolory krzywych ozna
czają modele: MO - granatowy, MOa - niebieski, M l - zielony (ciemny), M la - zielony (jasny), M3 - czerwony, M l-L i M3-L - kolorowe linie przerywane
Struktura A re^2-H je s t trw ałym w odorkiem niklu o konfiguracji elektronow ej [Fe4S4]2+Nip+ HNi^+ . Zależność aktyw acji A ox od w artości pH m oże być do
datkow ym potw ierdzeniem , że A re<22 je st form ą aktyw ną katalitycznie. Podobna struktura z protonem została zaproponow ana na podstaw ie obliczeń D FT przez L in d ah l’a i w spółpracow ników [88] w cyklu katalitycznym klastera C należącego do CO DH .
5.4 Potencjały redukcji
5.4 Potencjały redukcji
Z ależność pierw szego (A ox/A redl) i drugiego (A redi/A red2) potencjału reduk
cji od stałej dielektrycznej e dla m odeli klastera A stosow anych w obliczeniach została zaprezentow ana na Rysunku 5.13. O gólny w niosek z analizy w ykresów je s t następujący: wraz ze wzrostem stałej dielektrycznej w artość obliczonych p o tencjałów redukcji staje się bardziej dodatnia do czego p rzyczynia się stabilizacja struktury przez w iększą polam ość otoczenia.
J
— MO
— MOa
— M l
— Mla
— M2
— M3
— Ml-L
— M3-L
-MO
-MOa -M l
•M la
-M2
-M 3
’ kobalamina
•Ml-L
•M3-L
R ysunek 5.13: Zależność pierwszego i drugiego potencjału redukcji od stałej dielek
trycznej e dla modeli klastera A stosowanych w obliczeniach
5.4 Potencjały redukcji
W artości potencjałów redukcji E 0 [V, w zględem NH E] obliczone zgodnie ze w zorem 5.23 dla m odeli klastera A zestaw iono w Tablicy 5.12. Z danych zaw ar
tych w Tablicy 5.12 wynika, że potencjały redukcji dla e=4 m ają bardzo duże ujem ne w artości, co jest kolejnym dow odem na to, iż nie nadaje się on do obli
czeń w łaściw ości redoksow ych m etaloenzym ów [89-93],
Pierw szy potencjał redukcji {Aox/A rcdi) obliczony dla m odeli MO i M l jest ujem ny i niższy niż dla pozostałych m odeli (w yjątek £=80), co w skazuje, że A or nie ulega redukcji w warunkach fizjologicznych gdzie biologiczne reduktory m ają p otencjał bardziej dodatni. Pow iększenie m odelu o fragm enty białka (m odel M2 i M 3) pow oduje, że potencjał ten staje się bardziej dodatni niż -0.5 V. O becność reszt am inokw asow ych powoduje podw yższenie w artości E 0 na skutek tw orzenia się w iązań w odorow ych z siarką reszt tiolow ych kubanu i atom am i tlenu w koor
dynacyjnym otoczeniu niklu. Porów nując m odele M 2 i M 3 w idać, że oddziaływ a
nie klasteru z argininą w m odelu M3 nie pow odują dużych zm ian w artości E 0 (od 0.1 V do 0.2 V w zależności od e). Fakt, że potencjały obliczone dla najw iększego m odelu M 3 są bardziej dodatnie niż -0.5 V, a klaster A w form ie spoczynkow ej (A ox) nie ulega redukcji, składnia żeby szukać innej przyczyny jeg o odporności na redukcję. W tym celu w yznaczono potencjały redukcji dla klastera A zw iązanego z ligandem m rów czanow ym . Jest to jed en z ligandów, którego obecność jest pro
ponow ana w strukturze białka zgodnie z dostępnym i danym i literaturow ym i [1].
U dział tego Uganda rzeczyw iście przesuw a obliczone potencjały redukcji w kie
runku niższych wartości i dla £=20 jest on rów ny -1.065 V. N ależy zw rócić uwagę, że £=20 używ any jest tu jak o punkt odniesienia i jest to m aksym alna w artość £ dla obliczeń w białku. O bliczenia dla £=80 przeprow adzono dla spraw dzenia jak w zrost w artości stałej dielektrycznej w pływ a na potencjał redukcji oraz w celu znalezien ia takiej stałej dielektrycznej, która daje podobne w artości E 0 dla m o
delu MO ja k dla m odelu M 3. O kazało się, że £=80 dla m odelu MOa m a potencjały zbliżone od m odelu M3 dla £=20. Fakt ten został w ykorzystany podczas obliczeń dla reakcji m etylacji.
D rugi potencjał redukcji {A redi/A red2) jest bardzo ujem ny dla w szystkich roz
patryw anych w obliczeniach m odeli. D la stałej dielektrycznej £=20 (Tablica 5.12) dla m odelu M 3 wynosi on -1.052 V, a dla m odelu M la -1.661 V. W artość -1.052 V je s t znów bliska m odelowi MOa dla £=80 (różnica w ynosi około 0.1 V). D la k la
stera A z ligandem m rów czanow ym drugi potencjał redukcji je s t rów ny -1.384 V dla £=20.
W Tablicy 5.12 podane są w artości (A ox/A rcd2), które w ykorzystano w obli
czeniach dw uelektronow ej redukcji połączonej z protonacją.
Z godnie z danym i literaturow ym i zaproponow ano dw a m echanizm y sprzę
żonej z przyłączeniem protonu redukcji A ox . G raham e i w spółpracow nicy [19]
sugerują dw ie kolejne jednoelektronow e redukcje, w trakcie których przyłączenie p rotonu odbyw a się w kroku pierw szym . Lindahl i w spółpracow nicy [9] postu
5.4 Potencjały redukcji
lują je d n ą dw uelcktronow ą redukcję, której tow arzyszy w ychw yt protonu. Biorąc pod uw agę fakt, że A ox posiada potencjał redukcji niższy niż - 0.5 V, przyłączenie protonu pow inno odbyw ać się w pierw szym kroku dw uetapow ego procesu.
Tablica 5.13 zaw iera obliczone, zależne od pH potencjały redukcji (E ’0) w y
znaczone dla m odeli MO i M l oraz m odelu M l-L i M 3-L z anionem m rów czano
w ym . D la m odeli M 2 i M 3 param etry te nie były w yznaczane, poniew aż obliczony pierw szy potencjał redukcji (Aox/A redl) je s t bardziej dodatni niż wartość -0.5 V, co oznacza, że m ożna je zredukować przy pom ocy biologicznych reduktorów. Po
dane w artości zostały obliczone ze w zoru 5.24 i porów nane z dostępnym i danym i eksperym entalnym i [19,57], W niniejszej pracy w yznaczono zależności od pH dla dw uelektronow ej redukcji połączonej z protonacją, na co w skazały w cześniejsze o bliczenia pK„. D la jednoelektronow ej redukcji połączonej z protonacją, protona- cji m usiałby ulegać A redl a jak pokazały obliczenia pK„, w artości dla tej struktury są m ate, nie będzie on więc wiązał protonu. D ość dobrą zgodność w artości obli
czonych z danym i dośw iadczalnym i uzyskano dla konform acji rozw artych modeli MOa i M la (e=80, Tablica 5.13). Dla klastera A z ligandem m rów czanow ym (M3- L jw artości zależnych od pH potencjałów redukcji (E ’0) pozostają o około 0.4 V niższe od danych eksperym entalnych. Jednak za m odelem tym przem aw ia kilka czynników : je st on najbardziej rozbudow any i w yjaśnia dlaczego form a utleniona klastera A nie ulega redukcji, natom iast niezgodność w artości potencjałów reduk
cji obliczonych z dośw iadczalnym i m oże w ynikać z faktu, że nie m a pew ności czy ligandem zw iązanym z Nip jest anion m rów czanow y [87] oraz należy wziąć pod uw agę błąd metody. Biorąc pod uwagę w szystkie rozw ażane aspekty wydaje się, że m odel klastera A z przyłączonym ligandem , który ulega protonacji i dw u
elektronow ej redukcji je st najbardziej praw dopodobny.
5.4 Potencjały redukcji
5.4 Potencjały redukcji
5.5 Reakcja metylacji
5.5 Reakcja metylacji
D rugim w ażnym elem entem badań teoretycznych były obliczenia m ające na celu w skazanie m echanizm u reakcji m etylacji klastera A. A by m ożliw e było p ra w idłow e opisanie m echanizm u reakcji stosow ana m etodyka obliczeń m usi p o praw nie odtw arzać potencjały redukcji reagentów , a wyniki zostały przedstaw ione w R ozdziale 5.4. Syntaza acetylokoenzym u A (ACS) katalizuje reakcję pow sta
w ania acetylokoenzym u A z koenzym u A (C oA SH ), tlenku w ęgla pow stającego w klasterze C i m etylu przenoszonego przez białko koryna-żelazo-siarkow e (Co- FeSP) zgodnie z rów naniem reakcji 2 (R ozdział 3, strona 21). W białku Co- FeSP m etylokobalam ina w ystępuje w form ie "base-off”. Szczegółow y m echa
nizm przedstaw ionej reakcji pozostaje nadal przedm iotem dyskusji [7 ,5 7 ,6 4 ,8 6 ].
R eakcja m etylacji je s t jednym z etapów pośrednich tego procesu.
5.5.1 M odel strukturalny
M ETYLOKOBALAM INA
+
q=-4, S=0 q=1,S=0
N I,- cen tru m reakcji
R ysunek 5.14: Schemat reakcji metylacji z uwzględnieniem stmktur modelowych sto
sowanych w obliczeniach
W niniejszej pracy w ykonano obliczenia dla reakcji przeniesienia m etylu z m etylokobalam iny (m etylokobaltokoryny) na k laster A z użyciem m ałego m o
delu MOa. M odel ten został w ybrany ze w zględu na czasochłonność obliczeń, a ja k pokazano w poprzednim podrozdziale jeg o w łaściw ości redoksow e w £=80 są porów nyw alne z m odelem M 3 dla e=20. Schem at reakcji m etylacji z uw zględ nieniem struktur m odelow ych został pokazany na R ysunku 5.14. C zynnikiem me- tylującym była m etylokobalam ina (m etylokobaltokoryna) w form ie ”b a se -o ff”
(struktura b ez liganda dim etylobenzoim idazolow ego) przedstaw iona na R ysunku 5.15. Potencjał redukcji m etylokobalam iny m odelującej białko CoFeSP, zgodnie z dostępnym i danym i literaturowym i je s t rów ny -1.21 V [94] (w artość ek sperym en
talna), oraz -1.35 V (wynik otrzym any w m etodzie D F T /B P 8 6 dla form y ”base
KLASTER A
q=0, S=1
5.5 Reakcja metylacji
o f f ”), a energia dysocjacji grupy m etylow ej w zredukow anej m etylkobalam inie w ynosi 19 kcal [95,96],
R ysunek 5.15: Metylokobalmina (metylokobaltokoryna) w formie "base-on” z ligan- dem dimetylobenzoimidazolowym. Odnośnik [97]. W obliczeniach zastosowano model strukturalny w formie "base-off" (struktura z odłączonym ligandem aksjalnym DMB)
5.5.2 R eakcja deprotonacji
A by nastąpiła m etylacja klastera A m usi on ulec redukcji. D ośw iadczalnie pokazano, że tow arzyszy tem u protonacja (redukcja je s t zależna od pH) [19,57], O biektem kontrow ersji jest, czy jest to proces dw uetapow y (jednoelektronow a.
redukcja + protonacja i kolejna redukcja) czy jednoetap ow y (dw uelektronow a re duk cja + protonacja). O bliczenia opisane w R ozdziale 5.4 w skazują na proces jedn oetap ow y z protonacją na Nip. O znacza to, że przed lub w trakcie m etyla
cji proton m usi opuścić klaster A, a w reakcji najpraw dopodobniej uczestniczy cząsteczk a zasady. W prezentow anej pracy w ykonano obliczenia dla deprotona
cji przyjm ując jak o zasadę jon m rów czanow y (H C O O - ). Profil energii procesu oderw ania protonu przez anion m rów czanow y jak o funkcja odległości protonu od N ip, w raz z zaznaczonym i strukturam i substratów (I.), produktów (III.) i stanu przejściow ego (II.) został przedstaw iony na R ysunku 5.16. K rzyw e energii reak
cji oderw ania protonu dla różnych stałych dielektrycznych e = 4, 20 i 80 oraz w y
kresy zm ian gęstości spinow ych na w ybranych fragm entach klastera A i H C O O - zadem onstrow ano na R ysunku 5.17 [panel a) i panel b)]. Podana na R ysunku 5.16 [panel a)] bariera energetyczna rozpatryw anej reakcji dla e= 80 w ynosi 23,5 kcal,
5.5 Reakcja metylacji
a zgodnie z różnicą energii substratów (I.) i produktów (III.) reakcja je s t endoter- m iczna.
U NI.- O(HCOO)=4.0A ■ Ni,- Co=7.0ANi,- H-2.0A '
R ysunek 5.16: Krzywa energii jako funkcja odległości Nip-H+ dla reakcji oderwania protonu przez anion mrówczanowy z zaznaczonymi strukturami substratów (I.), pro
duktów (III.) i stanu przejściowego (II.). Wyniki otrzymano metodą DFT/BP86 w bazie funkcyjnej TZVP z zastosowaniem modelu PCM/e=80. Położenia atomów zaznaczonych gwiazdką zostały zamrożone w trakcie optymalizacji
I Nlp- O(HCOO )*4.0A
■ • Ni - Co«7.0A m Ni„- O(HCOO)"4.0A . Nłp- Co»7.0ANip- H=3.0A
5.5 Reakcja metylacji
R ysunek 5.17: Panel a) krzywe energii jako funkcje odległości Nip-H+ dla reakcji ode
rwania protonu przez anion mrówczanowy dla różnych stałych dielektrycznych e; panel b) zmiana gęstości spinowych na fragmentach klastera A i anionie mrówczanowym w trakcie reakcji przeniesienia protonu. Wyniki otrzymano metodą DFT/BP86 w bazie funkcyjnej TZVP z zastosowaniem modelu PCM/ć=4, 20 i 80
5.5 Reakcja metylacji
5.5.3 M e c h a n iz m A
W kolejnym etapie badań teoretycznych, nad m echanizm em m etylacji ob
liczono energię jako funkcję odległości N ip-C H 3. W obliczeniach użyto form y dw uelektronow o zredukow anej klastera A, zgodnie z wcześniej przeprow adzo
nym i obliczeniam i, w których protonacji tow arzyszy dw uelektronow a redukcja.
N a R ysunku 5.18 przedstaw iono profil energetyczny reakcji przeniesienia m etylu z m etylokobaltokoryny na klaster A, natom iast na R ysunku 5.19 pokazano prze
bieg krzyw ych energii dla różnych stałych dielektrycznych (e=4, 20 i 80). Jak pokazuje Rysunek 5.19, w zależności od startowej geom etrii użytej do obliczeń otrzym ano dw ie krzyw e energii. Jeżeli punktem w yjścia były m ałe odległości Nip- C H 3 uzyskiw ano K r z y w ą II, natom iast rozpoczynając obliczenia od dużych od
ległości N ip-C H 3 i używ ając otrzym anej geom etrii jak o start dla kolejnego punktu otrzym ano K r z y w ą I. Na K r z y w e j I odległość C o-C H 3 je s t rów na około 2 A, natom iast na K r z y w e j II kobaltokoryna jest zdysocjow ana. K r z y w a II opi
suje dysocjację m etylu z klastera A. O bie krzyw e przecinają się przy odległości N ip-C H 3 rów nej 2.6 A. N ależy zwrócić uwagę, iż punkt przecięcia odpow iada innym geom etriom na poszczególnych krzyw ych. D la odległości Nip-C H 3=3 A, niezależnie od s otrzym ano m aksim a na K r z y w e j I. B ariera reakcji m aleje w za
leżności od stałej dielektrycznej i w ynosi odpow iednio 4.8 kcal (f= 4), 3.1 kcal (e= 20) oraz 2.3 kcal (^=80) Na R ysunku 5.20 przedstaw iono zm iany gęstości spi
now ych na w ybranych fragm entach klastera A, m etylu i na kobaltokorynie wzdłuż ścieżki reakcji o najniższej energii ( K r z y w a II w zakresie N ip-C H 3= 1 .4 -2 .6 A oraz K r z y w a I w zakresie Nip-CH3= 2 .6 -6 .5 A). Zm iany gęstości spinow ych na korynie pokazują, że dla e -4 i 20 ulega ona redukcji. N ie redukuje się natom iast dla e= 80, a klaster A w ykazuje sprzężenie antyferrom agnetyczne ([Fe4S4l-Nip).
Przebieg reakcji nie zależy silnie od stałej dielektrycznej e, ani od tego czy ko- ryna je s t zredukow ana., a w skazana reakcja je s t silnie egzoterm iczna, około 27 kcal. N ależy zw rócić uw agę na fakt, że grupa m etylow a posiada m ałą gęstość spi
now ą, któ ra nie zm ienia się w trakcie przebiegu reakcji, m echanizm m ożna więc określić ja k o S^2.
5.5 Reakcja metylacji
| . Ni„- C(CHS)=6.5A
| . Ni„- C(CHS)=6.5A