UN IW ERSY TET ŚLĄSKI Wydział M atematyki, Fizyki i Chemii
Rozprawa doktorska
Kwantowochemiczne obliczenia właściwości strukturalnych i elektronowych
oraz reaktywności klastera A w syntazie acetylokoenzymu A
Aleksandra Chmielowska
Prom otor pracy
✓
dr hab. prof. US M an a Jaw orska
Instytut Chem ii Z akład Chem ii Teoretycznej
K atowice 2015
Pragnę serdecznie podziękow ać m ojej prom otor Pani dr hab. prof. US M arii Jaworskiej za zainteresowanie mnie tematyką pracy, opiekę naukową oraz wyrozum ia
łość i życzliwe wsparcie podczas j e j realizacji.
D r Piotrowi Lodowskimu dziękuję za wszechstronną p o moc oraz cenne uwagi m erytoryczne, a wszystkim p ra cownikom Zakładu Chemii Teoretycznej za serdeczność i życzliwą atmosferę.
Dedykuję mojej Mamie...
Ob l i c z e n i a p r o g r a m e m Ga u s s i a n0 9 z o s t a ł y w y k o n a n e w e Wr o c ł a w s k i m
Ce n t r u m Si e c i o w y m i Su p e r k o m p u t e r o w y m, W C S S Wr o c ł a w
h t t p : / / w w w . w c s s . w r o c . p l W RAMACH GRANTU OBLICZENIOWEGO NR 18
Spis treści
1 W stęp i cel pracy 10
2 W stęp teoretyczny 13
2.1 M etoda funkcjonałów g ę s t o ś c i ... 13
2.1.1 Twierdzenia H o h e n b e rg a-K o h n a ... 14
2.1.2 M etoda i równania K o h n a - S h a m a ... 14
2.2 Stosowane f u n k c jo n a ły ... 16
2.3 M odel ro z p u s z c z a ln ik a ... 17
2.4 Potencjały redukcji i pK a ... 18
3 Syntaza acetylokoenzym u A 20 4 Dotychczasow y stan badań teoretycznych 25 5 O bliczenia własne 27 5.1 M odele o b lic z e n io w e ... 28
5.2 Geom etria i struktura elektronowa klastera A ... 32
5.2.1 Klaster A ... 32
5.2.2 Pro tonowany klaster A ... 38
5.2.3 Klaster A z ligandami ... 43
5.3 pK a ... 48
5.4 Potencjały r e d u k c j i ... 50
5.5 Reakcja m e ty la c ji... 55
5.5.1 M odel s tru k tu ra ln y ... 55
5.5.2 Reakcja d e p ro to n a c ji... 56
5.5.3 M echanizm A ... 59
5.5.4 M echanizm B ... 63 5.5.5 Sjv2 czy reakcja ro d n ik o w a ... 6 6
5.5.6 Redukcyjna m etylacja klastera A przez m etylokobalam inę 70
6 Podsum ow anie i wnioski 72
Bibliografia 76
Załączniki 82
Spis tablic
5.1 Wybrane, eksperymentalne parametry geometryczne klastera A ... 31 5.2 Energia struktur zoptymalizowanych dla modeli klastera A na różnych
stopniach utlenienia... 35 5.3 Wybrane, zoptymalizowane odległości między atomami dla modeli kla
stera A na różnych stopniach u tle n ie n ia ... 36 5.4 Gęstości spinowe i ładunki NBO dla modeli klastera A na różnych stop
niach utlen ien ia ... 37 5.5 Energia struktur zoptymalizowanych protonowanych modeli klastera A
na różnych stopniach utlenienia... 40 5.6 Wybrane, zoptymalizowane odległości między atomami dla protonowa
nych modeli klastera A na różnych stopniach utlen ien ia... 41 5.7 Gęstości spinowe i ładunki NBO dla protonowanych modeli klastera A na
różnych stopniach u tle n ie n ia ... 42 5.8 Energia struktur zoptymalizowanych dla modeli klastera A na różnych
stopniach utlenienia z ligandami (-OH, -CO , -C H3, -HCOO, -H ) . . . . 45 5.9 Wybrane, zoptymalizowane odległości między atomami dla modeli kla
stera A na różnych stopniach utlenienia z ligandami (-OH, -CO, -C H3, -HCOO, - H ) ... 46 5.10 Gęstości spinowe i ładunki NBO dla modeli klastera A na różnych stop
niach utlenienia z ligandami (-OH, -CO, -C H3, -HCOO, - H ) ... 47 5.11 Wartości pKa obliczone dla modeli klastera A na różnych stopniach utle
nienia ... 48 5.12 Wartości potencjałów redukcji Eo (V, względem NHE) obliczone dla mo
deli klastera A ... 53 5.13 Zależność obliczonych wartości potencjałów redukcji E’o od p H 54
Spis rysunków
2.1 Cykl termodynamiczny B om a-H abera... 19 3.2 Struktura C O D H \A C S ... 20 3.3 Wzajemna orientacja białka i klastera A w zależności od metalu skoordy
nowanego w miejscu Mp ... 22 3.4 Proponowane mechanizmy reakcji katalitycznej klastera A ... 23 5.5 Zastosowana w obliczeniach struktura modelowa klastera A oparta na
strukturze krystalograficznej 1RU3, PDB ... 29 5.6 Modele klastera A stosowane w obliczeniach ... 32 5.7 Zoptymalizowane geometrie klastera A na różnych stopniach utlenienia
dla modeli MO i M l ... 33 5.8 Zoptymalizowane geometrie klastera A na różnych stopniach utlenienia
dla modeli M2 i M 3 ... 34
5.9 Zoptymalizowane geometrie protonowanych struktur klastera A na róż
nych stopniach utlenienia... 39 5.10 Zoptymalizowane geometrie klastera A z Ugandami (-OH, -CO, -C H3)
na atomie Nip dla modeli Ml i M 3 ... 44 5.11 Zoptymalizowane geometrie klastera A na różnych stopniach utlenienia
z anionem mrówczanowym jako ligandem na atomie Nip dla modeli M l i M3 oraz dla struktury z protonem ... 45 5.12 Zależność wartości pKa od stałej dielektrycznej e dla modeli klastera A
stosowanych w o b liczen iach ... 49 5.13 Zależność pierwszego i drugiego potencjału redukcji od stałej dielektrycz
nej e dla modeli klastera A stosowanych w obliczeniach... 50 5.14 Schemat reakcji metylacji z uwzględnieniem struktur modelowych stoso
wanych w obliczeniach... 55 5.15 Metylokobalmina w formie ”base-on” z ligandem dimetylobenzoimida-
zolowym... 56 5.16 Krzywa energii jako funkcja odległości Nip-H+ dla reakcji oderwania
protonu przez anion mrówczanowy z zaznaczonymi strukturami substra
tów, produktów i stanu p rzejściow eg o ... 57 5.17 Panel a) krzywe energii jako funkcje odległości Nip-H 1 dla reakcji ode
rwania protonu przez anion mrówczanowy dla różnych stałych dielek
trycznych e; panel b) zmiana gęstości spinowych na fragmentach kla
stera A i anionie mrówczanowym w trakcie reakcji przeniesienia protonu 58 5.18 Krzywa energii jako funkcja odległości Nip-CH3 dla reakcji przeniesienia
metylu z metylokobaltokoryny na klaster A z zaznaczonymi strukturami substratów, produktów i stanu przejściowego ... 60 5.19 Krzywe energii jako funkcje odległości Nip-CH3 dla reakcji przeniesienia
metylu z metylokobaltokoryny na klaster A dla różnych stałych dielek
trycznych e ... 61 5.20 Zmiana gęstości spinowych na fragmentach klastera A, metylu i kobalto-
korynie wzdłuż ścieżki reakcji o najniższej energii... 62 5.21 Krzywa energii jako funkcja odległości Nip-CH3 dla reakcji przeniesienia
metylu pomiędzy atomem Nip klastera A a metylokobaltokoryną przy sta
łej odległości Co-Nip=7 A z zaznaczonymi strukturami substratów, pro
duktów i stanu przejściowego... 64 5.22 Panel a) krzywe energii jako funkcje odległości w reakcji przeniesienia
metylu pomiędzy atomem Nip klastera A a metylokobaltokoryną przy ustalonej odległości Co-Nip=7 A. Sytuacja taka modeluje reakcję rodni
kową z przeniesieniem elektronu (ET); panel b) zmiana gęstości spino
wych na fragmentach klastera A, metylu i kobaltokorynie... 65 5.23 Powierzchnie energii potencjalnej zależne od dwóch parametrów geome
trycznych, odległości Nip-CH3=2.5-3 . 0 A oraz odległości Co-CH3=2.0- 3.0 A dla różnych stałych dielektrycznych e ... 67
5.24 Powierzchnie gęstości spinowych na fragmentach klastera A, metylu i kobaltokorynie dla dwóch odległości Nip-CH3=2.5-3.0 A oraz Co- CH3=2.0-3 . 0 A i różnych stałych dielektrycznych e ... 6 8
5.25 Panel a) wzajemne położenie K r z y w e j I i II dla dwóch odległości Nip- CH3=2.5-3 . 0
A
oraz Co-CH3=2.0-3 . 0A;
panel b) ścieżki reakcji odpowiedzialne za M e c h a n i z m A i M e c h a n i z m B ... 69 5.26 Proponowany schemat reakcji metylacji klastera A ... 70
Wykaz stosowanych skrótów
ACS
CODH
DFT
DFT-BS
ET
GGA
HOMO
LDA
LUMO
MP2
NBO
PCM
WFT
ZPE
syntaza acetylokoenzymu A (ang. Acetyl-CoA Synthase) dehydrogenaza tlenku węgla
(ang. Carbon Monoxide Dehydrogenase) teoria funkcjonałów gęstości
(ang. Density Functional Theory)
metoda DFT z funkcją o złamanej symetrii
(ang. Dependent Density Functional Theory-Broken Symmetry) reakcja z przeniesieniem elektronu
(ang. Electron Transfer)
uogólnione Przybliżenie Gradientowe (ang. Generalized Gradient Approximation) najwyższy zajęty orbital molekularny (ang. Highest Occupied Molecular Orbitalj przybliżenie Lokalnej Gęstości
(ang. Local Density Approximation) najniższy niezajęty orbital molekularny (ang. Lowest Unoccupied Molecular Orbital)
metoda oparta na drugim rzędzie rachunku zaburzeń Mollera-Plesseta (ang. Móllera-Plesset Perturbation Theory)
metoda naturalnych orbitali wiązań (ang. Natural Bond Orbital) ciągły model rozpuszczalnika (ang. Polarizable Continuum Model) teoria oparta na funkcji falowej (ang. Wave Function Theory) energia punktu zerowego (ang. Zero-Point Energy)
1 Wstęp i cel pracy
1 Wstęp i cel pracy
K om pleksy metali przejściowych stanow ią centra aktyw ne enzym ów katalizu
jących wiele reakcji biochem icznych. Zw iązki te m ogą wykazyw ać zróżnicow aną reaktyw ność chemiczną, ze względu na łatw ość z jak ą m etale przejściow e przyj
m ują różne stopnie utlenienia i różne sfery koordynacji.
Jednym z pierwiastków tworzących centra aktyw ne enzym ów jest nikiel. Sie
dem z ośm iu jego enzym ów katalizuje reakcje, w których produkowane lub prze
tw arzane są następujące gazy: CO, C 0 2, C H 4, H 2, N H3 i 02 [1-3]. O dgryw ają one w ażną rolę w m etabolizm ie bakterii beztlenow ych, obiegu węgla, azotu i w odoru w przyrodzie oraz m ają ogrom ne znaczenie dla zrozum ienia procesu pow staw a
nia życia na Ziemi. Atom y niklu w m etaloenzym ach w ykazują dużą różnorodność koordynacji, m ogą przyjm ować różne stopnie utlenienia (+I,+II,+III) oraz kata
lizują reakcje redoks w szerokim zakresie potencjału [2]. Badanie teoretyczne i dośw iadczalne połączeń z niklem m a na celu zrozum ienie w iele m echanizm ów reakcji zachodzących w układach biologicznych m in. procesu m etylacji i karbo- nylacji. M a również na celu ich przyszłościow e w ykorzystanie w przem yśle m. in.
w produkcji kwasu octowego w procesie M onsanto [4,5],
O biektem badań, z zakresu teoretycznych m etod w chemii wchodzących w zakres prezentowanej pracy doktorskiej, jest dw ucentrow y kom pleks niklu, [Fe4S4]-N ipN i(i, nazywany klasterem A. Stanowi on centrum aktyw ne syntazy acetylokoenzym u A (ACS), enzym u który katalizuje reakcje pow staw ania ace- tylokoenzym u A z CO, CH3 i koenzym u A (CoASH) w bakteriach: M oorella therm oacetica i Carboxydothermus hydrogenoformans [6-8], Krystalografia oraz spektroskopia M óssbauera i EPR [9-12] dostarczają wielu danych eksperym en
talnych dotyczących złożonej struktury i reaktyw ności klastera A, niew iele jest jed n a k prac obliczeniowych z nim zw iązanych [13-16]. Prezentują one ponadto różne podejścia do om aw ianego zagadnienia. Innow acyjność niniejszej pracy przejaw ia się zarów no w wykonaniu obliczeń niepublikow anych do tej pory doty
czących redukcji klastera A połączonej z protonacją, ale rów nież w zaproponow a
niu m echanizm u katalitycznej m etylacji enzym u ACS ,w którym istotną rolę od
gryw a dw uelektronow a redukcja z przeniesieniem protonu. Z w rócono też uwagę,
1 Wstęp i cel pracy
że istotną rolę przy wyznaczaniu w łaściw ości redoksow ych klastera A odgrywa ligand skoordynowany z proksym alnym atom em niklu (Nip). W badaniach zasto
sowane zostały m etody chemii kwantowej oparte na teorii funkcjonałów gęstości.
Wyniki otrzym ano stosując metodę BS-D FT z funkcjonałem B P8 6 i bazą funk
cyjną TZVP. Otoczenie białkowe enzym u uw zględniono stosując m odel ciągły rozpuszczalnika PCM [17, 18], dla czterech stałych dielektrycznych e=4, 12, 20 i 80. W obliczeniach sprawdzono kilka, różniących się w ielkością typów m odeli strukturalnych klastera A (MO, M l, M 2 i M3).
Prezentow ana praca przedstaw ia finalne wyniki obliczeń optym alizacji geo
m etrii klastera A na różnych stopniach utlenienia (Aox, Arerfl i K Te(n ) oraz kla
stera A z ligandami: grupą metylową, grupą karbonylową, protonem oraz anionem m rów czanowym . Przeanalizowano rów nież ładunki i gęstości spinowe w szystkich w yselekcjonow anych struktur. W ybrano takie molekuły, których obecność suge
row ana je s t w strukturze krystalograficznej enzym u oraz takie, których obecność w trakcie katalizowanej przez klastera A reakcji została potw ierdzona dośw iad
czalnie i w związku z tym, wydają się być istotne do popraw nego opisu m echa
nizmu reakcji. Ważny elem ent pracy stanow iło teoretyczne w yznaczenie w arto
ści pK a, potencjałów redukcji oraz potencjałów redukcji sprzężonych z przyłą
czeniem protonu. Na ich podstawie w ybrano m echanizm redukcyjnej aktywacji utlenionej form y klasteru A (Aox) spośród dw óch proponow anych dośw iadczal
nie [9,19], a także oceniono wpływ w ielkości m odelu oraz otoczenia białkowego na w łaściw ości redoksow e klastera A.
W kolejnym etapie badań, przedstaw ionych w niniejszej pracy, w yznaczono ścieżkę reakcji m etylacji klastera A, przeanalizow ano zm iany gęstości spinow ych w trakcie reakcji oraz zaproponow ano jej m echanizm . C zynnikiem m etylującym w reakcji była m etylokobalam ina w form ie ”ba se-o ff”. W ym ieniona reakcja, jest jed n y m z etapów pośrednich katalizowanej przez centrum aktywne reak
cji pow staw ania acetylokoenzym u A. A by m ożliw e było popraw ne opisanie m echanizm u reakcji stosowana m etodyka obliczeń m usi popraw nie odtwarzać potencjały redukcji reagentów, dlatego to zostało zrobione w pierw szym kroku.
Podsum ow ując, realizacja badań w ram ach przedkładanej pracy doktorskiej m iała na celu:
(i) W ypracowanie m odelu i metodyki obliczeń, która praw idłowo odtw arza dośw iadczalne dane strukturalne oraz potencjały redukcji i wartości pK a dla klastera A.
(ii) Zaproponow anie m echanizm u redukcji utlenionej form y klastera A (Aox).
(iii) W skazanie m echanizm u reakcji m etylacji klastera A, będącej jednym z etapów pow staw ania acetylokoenzym u A.
1 Wstęp i cel pracy
Rozpraw a została podzielona na sześć rozdziałów. W rozdziale drugim om ó
wiono, w sposób ogólny, podstawy teoretyczne m etody funkcjonałów gęstości (DFT), stosowany do obliczeń funkcjonał BP8 6 oraz ciągły m odel rozpuszczal
nika (PCM ). W rozdziałach trzecim i czw artym dokonano przeglądu danych lite
raturow ych reprezentujących obecny stan wiedzy na tem at enzym u, syntazy ace- tylokoenzym u A (ACS) oraz jego centrum aktywnego, czyli klastera A. Infor
m acje przedstaw ione w rozdziale trzecim dotyczą danych doświadczalnych: kry
stalograficznych i spektroskopowych, natom iast w rozdziale czw artym dokonano przeglądu literatury prac teoretycznych. Badaniom w łasnym został poświęcony rozdział piąty, który składa się z pięciu podrozdziałów. W rozdziale 5.1 om ówiono m odele klastera A stosowane w obliczeniach. Rozdział 5.2 zaw iera wyniki obli
czeń optym alizacji geom etrii dla przedstaw ionych wcześniej m odeli klastera A oraz analizuje ich struktury elektronowe. Rozdziały 5.3 i 5.4 dotyczą właściwości elektronow ych klastera A i obejm ują wyniki obliczeń w artości pK a oraz potencja
łów redukcji dla różnych stałych dielektrycznych e. Rozdział 5.5 om aw ia wyniki obliczeń dla reakcji m etylacji i przedstaw ia schem at proponow anego m echanizm u tej reakcji. W ostatnim rozdziale um ieszczono podsum ow anie i wypunktowano najw ażniejsze wynikające z pracy w nioski.
2 Wstęp teoretyczny
2 Wstęp teoretyczny
M etody opracowane w ramach teorii funkcjonałów gęstości (DFT, ang. Den
sity Functional Theory) są obecnie najbardziej popularnym i i efektyw nym i m eto
dami stosowanym i w chemii układów biologicznych i katalitycznych. Im plem en
tacje tych m etod znajdują się ju ż w zdecydowanej w iększości pakietów progra
m ów obliczeniow ych przeznaczonych do obliczeń kw antow o-chem icznych dla układów atom owych, m olekularnych, krystalicznych, a także dużych układów biologicznych i nanostruktur. U m ożliw iają one badanie dużych m olekuł, dla któ
rych stosow anie złożonych m etod chem ii kwantowej jest niem ożliw e ze względu na w ym agania sprzętowe i wysoki koszt obliczeń. Podstaw ow ą zaletą m etod DFT, je s t znacznie niższy koszt obliczeniowy niż standardowo używ anych m etod typu ab initio opartych na teorii funkcji falowej (WFT, ang. Wave Function Theory).
R ów nocześnie dokładność otrzym anych w yników jest, w w iększości przypad
ków porów nyw alna z dokładnością m etod W FT opartych na przybliżeniu Hartree- Focka (HF) z uwzględnieniem dodatkow o efektów korelacji elektronowej w dru
gim rzędzie rachunku zaburzeń M óllera-Plesseta (MP2). M etoda DFT uw zględ
nia korelację elektronową i m oże być w ykorzystyw ana do w yznaczania w łasno
ści m olekularnych związków m etaloorganicznych, zaw ierających m etale przej
ściowe, dla których m etoda HF zawodzi ze w zględu na zbyt m ałą różnicę energii m iędzy orbitalam i HOM O i LUM O.
2.1 Metoda funkcjonałów gęstości
W teorii funkcjonałów gęstości w ychodzim y z przybliżenia Bom a- O ppenheim era, które pozw ala rozpatryw ać stany elektronow e przy określonych położeniach jąder. Stan podstawowy układu m ożna znaleźć za pom ocą gęstości elektronow ej zdefiniowanej w następujący sposób [2 0,2 1]
P(r)
_
2 f 2
= N ^ dT2d r3 ...d T N \'ii! ( r ,a i,T2,(r2, . . . , T N , a N)\ (2.1)
„ _ 1 ^
2.1 Metoda funkcjonałów gęstości
gdzie:
r jest położeniem w przestrzeni trójwym iarowej, a całkow anie odbywa się po w szystkich współrzędnych spinowych N elektronów i po współrzędnych prze
strzennych N - l elektronów.
Gęstość elektronow a jest zawsze liczbą dodatnią, a jej wycałkowanie po całej przestrzeni daje nam ilość elektronów w układzie. Posiada też łatwe do przew idze
nia cechy jakościowe: m aksim a (ostrza) w pobliżu jąder, które wraz ze wzrostem odległości od jąd ra dążą do zera; pochyłość ostrza określona jest przez ładunki jąder.
2.1.1 Twierdzenia H ohenberga-K ohna
Punktem wyjścia w teorii funkcjonałów gęstości, są sform ułow ane w 1964 roku, tw ierdzenia Hohenberga-Kohna [22-25]:
1 .G ęstość elektronowa stanu podstaw ow ego Po(r) i funkcja falow a stanu po d sta wowego mogą być używane alternatywnie jako pełne opisy właściw ości stanu podstaw owego.
2. Istnieje funkcjonał energii zależny o d p osiągający swoje minimum dokładnie dla idealnej gęstości stanu podstaw owego, czyli dla p = po.
Spełniona je s t wtedy następująca zasada wariacyjna:
E » K [p\ > E » K [p0} = po (2.2) 2.1.2 M etoda i równania K ohna-Sham a
Praktyczna realizacja teorii funkcjonałów gęstości opiera się na opracowanej rok po ogłoszeniu twierdzeń m etodzie K ohna-Sham a [2 1 ,2 3 ,2 4 ], Polega ona na zastąpieniu oddziaływań pom iędzy elektronam i koncepcją w zajem nie nieoddzia- łujących, ale oddziałujących z jądram i i polem zew nętrznym elektronów, poru
szających się w efektywnym potencjale. D la takiego m odelu funkcja falowa ma postać w yznacznika Slatera i stanowi funkcję w łasną efektyw nego ham iltonianu będącego sum ą operatorów jednoelekronow ych. Zabieg ten pozw ala uniknąć pro
blem u w ielu oddziałujących ze sobą ciał. Jednocześnie taki potencjał efektywny zaw iera w sobie zarówno oddziaływ ania dw uelektronow e (korelację kulombow- ską) ja k i korelację w ym ienną (statystyczną). Kluczowy je s t w ybór tego poten
cjału w taki sposób, aby gęstość nieoddziałujących elektronów dokładnie odw zo
row yw ała gęstość rzeczyw istego układu w stanie podstaw owym .
Energia całkowita w m etodzie D FT zależy od gęstości elektronow ej i wyraża się następującym wzorem:
E[p] = Tq [p\ 4- K je[p] + Jee[p\ + E xc[p\ (2.3)
2.1 Metoda funkcjonałów gęstości
W rów naniu tym kolejne człony oznaczają odpowiednio:
> energię kinetyczną nie oddziałujących elektronów,
(2.4)
> energię elektrostatycznego przyciągania m iedzy jądram i atom owym i i elek
tronami:
który zaw iera wszystkie składniki pom inięte przez poprzednie wyrazy:
• część wymienną,
• korelacje elektronową,
• popraw kę do energii kinetycznej,
• popraw kę do oddziaływania elektronów sam ych ze sobą.
D okonując wariacji wyrażenia na energię w zględem gęstości elektronow ej, z ograniczeniam i ortonorm alności i nieoznaczonym i m nożnikam i Lagrange’a, otrzym ujem y układ równań różniczkow o-całkowych. U kład ten nazywany jest układem rów nań Kohna-Sham a i rozw iązuje się go iteracyjnie podobnie ja k w m e
todzie H artree-Focka [2 0 ,2 1 ,2 5 ,2 6 ].
Z zestaw u startowych orbitali oblicza się gęstość w zerow ym przybliżeniu i operator vq. Rozwiązując rów nanie po raz kolejny otrzym uje się nowe orbitale, a procedurę pow tarza się, aż do sam ouzgodnienia.
(2.5)
> energię odpychania elektrostatycznego elektronów,
(2.6)
> funkcjonał korelacyjno-wym ienny,
-Ęrc [p] (2.7)
(2.8)
(2.9) Gdzie:
.—. ń Exc
VXc (2.10)
2.2 Stosowane funkcjonały
2.2 Stosowane funkcjonały
Dokładność i efektywność metod DFT zależy od przybliżeń i jakości funk
cjonałów korelacyjno-wym iennych używanych w tych m etodach. Niestety więk
szość znanych, popularnych i standardowo stosowanych funkcjonałów korelacyj
nych i w ym iennych daje zadowalające wyniki tylko w pew nych obszarach obli
czeń kwantowo-chem icznych, a popraw ność wyników otrzym anych przy pomocy tych funkcjonałów dla innych (zbliżonych) zagadnień jest praktycznie nieprzew i
dywalna. Dlatego też bardzo istotny jest odpowiedni dobór funkcjonału do kon
kretnego problem u obliczeniowego.
W yróżnia się cztery podstawowe grupy funkcjonałów:
1. LD A lub SDA (przybliżenie lokalnej gęstości lub spinowej lokalnej gęsto
ści),
2. G G A (uogólnione funkcjonały gradientow e), 3. m eta-G G A (funkcjonały m eta-gradientowe), 4. funkcjonały hybrydowe.
W niniejszej pracy wykorzystano funkcjonał B P8 6, który należy do grupy funkcjonałów GGA. Powstał on przez połączenie funkcjonału w ym iennego Becke (B8 8) [27] z funkcjonałem korelacyjnym Perdew (P8 6) [28].
Część w ym ienna funkcjonału przedstaw ia się wzorem (Fx (s ) je s t w spółczyn
nikiem poprawy):
F-B88w=1+T 7 6 i S r o
< 2 ' n )s = — —— r (2.1 2)
2(37r2)5 gdzie:
o /3 = 0.0042 jest param etrem em pirycznym dopasow anym m etodą najm niej
szych kw adratów do dokładnej energii wym iennej H artree-Focka sześciu atomów gazów szlachetnych (od He do Rn);
> funkcja: sinh “1 y = l n( y + y / l + y 2) zapew nia praw idłow e asym ptotyczne zachow anie w ym iennej energii gęstości dla dużych odległości r;
> param etry cx i C2 wyznacza się ze wzorów: cx = 2(6 7t2)3, C2 = ( 2 s C x) ~l . Cześć korelacyjna funkcjonału B P8 6 przedstaw ia się wzorem:
£ f8V , / ] = + J (2' 13)
2.3 Model rozpuszczalnika
Funkcja d ( Q jest dana równaniem:
5
d( C) = 25
¥ ) ' * 1 - C V
2 (2.14)oraz:
- C c ( 0 ) 1 V p|
C c(rs) p l (2.15)
Param etr / = 0.11 jest tak dobrany, żeby pasował do dokładnej energii korelacji atom u Ne, a C c(rs) jest w spółczynnikiem w rozw inięciu gradientow ym .
2.3 Model rozpuszczalnika
Standardow e obliczenia kw antow ochem iczne przeprow adzane są na ogół dla układów m olekularnych w próżni. Tym czasem większość interesujących reakcji (bio)chem icznych przebiega w roztw orach, dlatego konieczne jest uw zględnienie oddziaływ ania m olekuł z rozpuszczalnikiem . W obliczeniach stosuje się zaim plem entow ane w pakietach obliczeniow ych m odele rozpuszczalników . Jednym z nich je s t m odel PCM (ang. Polarizable Continuum M odel), w którym rozpusz
czalnik traktowany jest jako ośrodek ciągły [17,1 8,29,30 ], Cząsteczka substancji rozpuszczonej um ieszczana jest wew nątrz wnęki w rozpuszczalniku, zbudowa
nej z zachodzących na siebie sfer scentrowanych na poszczególnych atom ach lub grupach atomów. Promień sfery jest proporcjonalny do prom ieni van der W aalsa atomów, a w spółczynnik proporcjonalności dobierany jest na podstaw ie obliczeń testow ych dla wybranych układów i porów nania uzyskanych danych z ekspery
m entem . R ozpuszczalnik w m etodzie PC M jest izotropow ym m edium ciągłym o stałej w artości przenikalności dielektrycznej e. W środku w nęki stała dielek
tryczna e = l, natom iast na zewnątrz m a wartość charakterystyczną dla danego roz
puszczalnika.
W m odelu PCM proces solwatacji dzieli się na trzy etapy:
1. utw orzenie wnęki w rozpuszczalniku,
2. um ieszczenie we wnęce cząsteczki substancji rozpuszczonej, 3. w ygenerow anie rozkładu ładunków.
W yznacza się energię sw obodną solwatacji, która jest sum ą trzech członów:
A G sol = A G c a v + A G vd w + A G e j (2.16)
2.4 Potencjały redukcji i pKa
> A G cav - energii kawitacji, wyznaczanej jak o ważony udział w kładu od izo
lowanego atomu;
> A G vdw - energii van der Waalsa, wyznaczonej z sum y w kładów atom owych;
> A G ei - energii elektrostatycznej - przy obliczaniu jej w kładu zakłada się, że rozpuszczalnik stanowi ciągły polaryzowalny ośrodek odpowiadający na rozkład ładunku cząsteczki rozpuszczonej.
2.4 Potencjały redukcji i pKa
M ożliw ość teoretycznego w yznaczania wartości stałej równowagi reakcji dy- socjacji kw asów w wodzie, Ka lub jej ujem nego logarytmu: (pKa=-logK a) przy użyciu spójnego, dobrze zdefiniowanego podejścia bez stosow ania zew nętrznych przybliżeń lub dopasowywania wyników do danych dośw iadczalnych m a dla che
m ików ogrom ne znaczenie [30,31], G łów na trudność w obliczaniu absolutnych (pKa) i w zględnych wartości (pK ’a) polega na w yznaczeniu zm iany entalpii sw o
bodnej zw iązanej z deprotonacją. O bliczenie dokładnych w artości pK a je s t bardzo w ym agające, ponieważ błąd w wyniku A G °= 1.36 kcal/m ol w arunkuje błąd rzędu
1 jednostki pK a [31-33].
pK a zw iązane jest z entalpią sw obodną następującą zależnością:
A G0
p K a = —l o g K a = ---(2.17)
F y 2 .303R T
gdzie: R=1.987 10” 3 kcal/(K -m ol)jest stałą gazową, T=298.15 K, A G Qaq oznacza sw obodną entalpię dla reakcji deprotonow ania w roztw orze, a czynnik 2.303 po
chodzi z zam iany logarytm u naturalnego na dziesiętny. Rysunek 2 .l a obrazuje cykl B orna-H abera, na podstawie którego w yznacza się A G°aq zgodnie ze w zo
rem:
A Ą = AG " + A + A ~ A G ^ i f ) (2.18) gdzie:
AG°g = A G°g(A ~) + A G°g{ H + ) - A G°g{A H ) (2.19) N ależy m ieć na uwadze, że dla każdego z indyw iduów należy uw zględnić w kład pochodzący od zmiany stanu standardow ego z 1 atm osfery w tem pera
turze 298.15 K w fazie gazowej na 1 m ol/dm3 w fazie skondensow anej. D użą trudność spraw ia w yznaczenie teoretyczne wartości A G °oto(H +), a dostępne dane literaturow e podają istotne różnice w w artościach [33,34], Problem spraw ia także obliczenie entalpii swobodnej protonu w fazie gazowej, G y(H + ). Sw obodną ental
pię reakcji w fazie gazowej wyznacza się dla izolowanych cząsteczek za pom ocą obliczeń kwantowo-chem icznych, natom iast sw obodną entalpię solw atacji z za
stosow aniem w ybranego m odelu rozpuszczalnikow ego.
2.4 Potencjały redukcji i pKa
AH
•a g‘,* (a h) AO'UA) AG‘* < !f) AG*,*(Ox) AG*.k(H -)
AH
AG* + H +aq O x aq+ e s — — — ► R e d aqRysunek 2.1: Cykl termodynamiczny Boma-Habera a) stosowany do wyznaczania stałej równowagi reakcji b) stosowany do wyznaczania potencjału redukcji. Odnośnik [30]
Podobnie wyznacza się potencjały redukcji, a analogiczny cykl B om a-H abera dla procesu jednoelektronow ego przedstaw iono na Rysunku 2. Ib [31,32], Całko
wita, sw obodna entalpia Gibbsa jest sum ą wartości w poszczególnych etapach:
Energia swobodna solwatacji elektronu jest rów na zero, a żeby odnieść w y
niki obliczone do pom iarów eksperym entalnych w zględem standardowej elek
trody wodorowej należy uwzględnić, że A SH E=4.28 V zgodnie z dostępnym i danym i literaturowym i [35-37],
Dla znanych entalpii swobodnych badanego procesu potencjał redukcji wy
znacza się z rów nania Nem sta:
a s y O , r e d o x
E ° = solv (2.21)
n F
gdzie: n je s t liczbą elektronów biorących udział w reakcji redoks, a F= 23.06 kcal/(m ol V) jest stałą Faradaya.
R eakcje redoks m ogą być połączone z innymi procesam i. Przykładow o może to być zm iana konform acji cząsteczki lub przyłączenie liganda. W ielu przykładów złożonych procesów redoks dostarcza biochem ia. Skom plikow ane procesy prze
m iany m aterii, zachodzące w kom órkach organizm ów żyw ych m in. w łańcuchu oddechow ym , polegają na transporcie elektronów od zw iązków ’’bardziej zredu
kow anych” do ’’bardziej utlenionych” . W tych w ieloetapow ych szlakach trans
portu elektronów , od donorów do akceptorów, istotną rolę odgryw ają proste reak
cje utleniania i redukcji jonów [38-40],
t0, r e d o x
= A G o,™*« + a g 0,.„ ( R e d ) - A & Z „ (O x ) (2.20)
3 Syntaza acetylokoenzymu A
3 Syntaza acetylokoenzymu A
N ikiel (Ni, tac. niccolum) jest pierw iastkiem chem icznym z grupy m etali przejściow ych, który odgryw a w ażną rolę w biologii roślin oraz beztlenow ych bakterii i archeonów [41,42]. Jest on obecny w centrach reaktyw ności enzym ów katalizujących w iele reakcji biochem icznych tych organizm ów . U roślin w cho
dzi w skład ureazy, enzym u który uczestniczy w rozkładzie m ocznika. Siedem z ośm iu m etaloenzym ów niklu katalizuje reakcje w których produkow ane lub przetw arzane są następujące gazy: CO, C 0 2, C H 4, H 2, N H3 i 02 [1 -3 ]. Ich po zna
nie je s t w ażne dla zrozum ienia procesu pow staw ania życia na Ziem i, utrzym ania rów now agi ekologicznej oraz ze w zględu na potencjalne zastosow anie w przem y śle [4].
R ysunek 3.2: Struktura CODH/ACS z uwzględnieniem poszczególnych podjednostek (Moorella thermoacetica, PDB - 10A 0 ). Odnośnik [43]
A cetylokoenzym A (CH3CO-C0ASH) dla aerobiontów je s t kluczow ym p ó ł
produktem cyklu K rebsa [44], natom iast u anaerobiontów takich ja k jed n oko m ó r
kowe, beztlenow e bakterie acetogeniczne i m etanogeniczne oraz archebakterie
3 Syntaza acetylokoenzymu A
używ any je s t w procesie redukcji atm osferycznego C O2 w celu uzyskania węgla do produkcji biomasy. Proces ten odbyw a się w redukcyjnym cyklu acetyloko- eznym u A, określanym jako szlak W ood-Ljungdahl’a [6,8,45 ,46]. W przeciw ień
stwie do odw rotnego cyklu Krebsa i cyklu Calvina, proces ten nie je s t cykliczny.
Redukcyjny szlak acetylokoenzym u A jest m etodą w ytw arzania zw iązków orga
nicznych polegającą na redukcji C 02 przez kilka związków pośrednich do acety
lokoenzym u A. Kluczowa reakcja redukcji C 02 do CO przeprow adzana je s t przez dehydrogenazę, której kofaktorami są Ni, Zn, Fe. D onorem elektronów w tej re
akcji je s t wodór. Do CO połączonego z dehydrogenazą przyłączana je s t grupa m e
tylowa przenoszona przez białko korynoidowe o podobnej budowie ja k w itam ina B I 2. Białko to pobiera grupy m etylowe z tetrahydrom etanopteryny i przyłącza do zw iązanego z enzym em CO. Pow stała w reakcji grupa acetylow a przenoszona jest na koenzym A co prowadzi do pow stania acetylokoenzym u A.
K luczow ym enzym em wykorzystyw anym w opisanym wyżej procesie przez bakterię M oorella thermoacetica jest syntaza acetylo-C oA /deh yd ro genaza tlenku węgla (II) (A C S /C O D H ) [4 5 ,4 7 ,4 8 ]. Ten dwufunkcyjny, heterotetram eryczny enzym posiada masę 301 kD a i składa się z dw óch rodzajów podjednostek (Ry
sunek 3.2) [ 5 ,8]. Centralnie w środku w ystępują podjednostki j3 odpow iedzialne za aktyw ność CODH i zawierające klastery: B , C, D . N atom iast sym etrycznie po bokach znajdują się podjednostki a odpow iedzialne za aktyw ność ACS i zaw ierające badany klaster A. W strukturze enzym u pom iędzy klasterem C
o
i klasterem A w ystępuje hydrofobow y tunel (długości około 138 A), którym transportow any jest CO w trakcie katalizy [49], Tunel dostarcza CO i C 02
do m iejsc aktywnych, a dostępność tych gazów je s t regulow ana przez zmiany konform acji białka (Rysunek 3.3).
A C S /C O D H katalizuje dwa ważne biologicznie procesy [6-8]
1. O dw racalną redukcję atm osferycznego C 02 do CO. O dpow iedzialny jest za nią klaster C [Fe4S4Ni] należący do CODH.
C 0 2 + 2 H + + 2 e ^ C O + H20
2. Syntezę acetylokoenzym u A przy udziale CO, koenzym u A (CoASH) i C H3
przenoszonego przez białko koryna-żelazo-siarkow e (CoFeSP). M a ona m iejsce w klasterze A [Fe4S4]N i2 należącym do ACS.
C H 3- C o { I I I ) F e S P + C O + C o A S H # C H 3C O -S C o A + C o {I )F e S P + H +
3 Syntaza acetylokoenzymu A
KONFORMACJA BIAŁKA
A) otwarta B) zamknięta
KONFORMACJA KLASTERA A
R ysunek 3.3: Wzajemna orientacja białka i klastera A w zależności od metalu skoor
dynowanego w miejscu Mp (Mp = Ni, Cu, Zn). Konformacja białka: A) otwarta B) za
mknięta. Konformacje klastera A: a) zwarta b) rozwarta. Odnośnik [50,51]
W ciąż trw ają prace nad dokładnym poznaniem enzym u ze w zględu na rolę ja k ą m oże on pełnić w utrzym aniu rów now agi ekologicznej przez w iąznie gazów cieplarnianych (reakcja 1) oraz z uwagi na jeg o potencjalne znaczenie technolo
giczne przy produkcji kwasu octow ego (proces M onsanto) i w procesie R eppe’a (reakcja 2) [4,5].
K laster A, stanowiący centrum aktyw ne ACS, je st dw ucentrow ym kom p leksem niklu połączony z kubanem żelazo-siarkow ym : [Fe4S4]-N ipNid, gdzie Nip i Nid oznaczają odpow ienio proksym alne i dystalne położenie niklu w sto
sunku do kubanu. [52, 53]. Enzym ACS m oże przyjm ow ać dw ie konform acje:
otw artą i zam kniętą, które odpow iadają dw óm konform acjom klastera A: zw ar
tej i rozw artej (Rysunek 3.3). W arunkują one aktyw ność katalityczną enzym u.
W strukturze otwartej enzym w ykazuje pełn ą aktyw ność katalityczną, a jonem w pozycji proksym alnej je s t Ni o koordynacji planarnej. W strukturze zam kniętej enzym je s t nieaktywny, a proksym alny atom niklu je s t zastąpiony przez Cu lub Zn
3 Syntaza acetylokoenzymu A
w koordynacji tetraedrycznej. W pracy [54] zasugerow ano, że m iedź i cynk m ogą zostać w prow adzone w strukturę klastera podczas oczyszczania białka lub w pro
cesie krystalizacji. W artykule [55, 56] udow odniono, że atom N ip je s t labilny i m ożna go w yodrębnić z klastera przez ligandy chelatujące, takie ja k fenantro- lina.
K laster A syntazy acetylokoenzym u A m oże w ystępow ać na trzech stopniach utlenienia:
• w form ie utlenionej o konfiguracji elektronow ej [Fe4S4]2+-N ip +Ni^+ (S=0) - oznaczany jak o A ox,
• w form ie jednoelektronow o zredukow anej o konfiguracji elektronow ej [Fe4S4]2+-N ip +Nijj+ ( S = |) - oznaczany ja k o A redl,
• w form ie dwuelektronowo zredukow anej o konfiguracji elektronow ej [Fe4S4]1+-N ip+Ni^+ (S=0) - oznaczany jak o A red2, w ystępuje tu sprzężenie antyferrom agnetyczne [7,19,57]
R ysunek 3.4: Proponowane mechanizmy reakcji katalitycznej klastera A: a) parama
gnetyczny b) diamagnetyczny. Odnośnik [58,59]
R edukcja w obecności CO daje tzw. strukturę A red-CO (N iFeC) [Fe4S4]2+ Nip+ (CO)Ni^+ ( S = |) zidentyfikow aną dzięki spektroskopii elek
tronow ego rezonansu param agnetycznego (EPR) [ 9 - 1 1 ,6 0 - 6 2 ] . M etylow any klaster A posiada strukturę elektronow ą [Fe4S4]2+ N i2+ (C H3)Ni^+ i stan spi
nowy (S=0) [7]. Eksperym entalnie stw ierdzono, że reakcja m etylacji utlenionej form y klastera A (Aox) przez m etylokobalam inę lub białko C oFeSP zachodzi
Mechanizm paramagnetyczny
r CHi
2e
C H3S
Mechanizm diamagnetyczny
3 Syntaza acetylokoenzymu A
w obecności czynników redukujących o niskim potencjale redukcji (niższym niż -0.5 V) i zależy od pH [9,19]. Zw iązek potencjałów redukcji z pH w skazuje, że w strukturach zredukowanych do klastera A przyłączany jest proton [9,12,19,63].
M echanizm reakcji katalitycznej klastera A w enzym ie ACS nie jest w pełni poznany [12, 1 9 ,6 3 -6 5 ], Lindhal i współpracownicy [7 ,6 5 ,6 6 ] zaproponow ali m echanizm diam agnetyczny (Rysunek 3.4), w którym aktyw acja klastera A wiąże się z dw uelektronow ą redukcją. G rupa m etylow a jest przenoszona z białka C H 3- CoFeSP na klaster A jako kation, a następnie przyłącza się CO i tw orzona jest grupa acetylowa. Koenzym A reaguje z acetylem tw orząc acetylokoenzym A, a zredukow any klaster A zostaje odtworzony. Zgodnie z tym m echanizm em A recu- CO nie je s t produktem przejściowym reakcji.
R agsdale i współpracownicy [59, 64] zaproponowali tzw. przypadkow y m e
chanizm param agnetyczny (Rysunek 3.4). CO i C H3 reagują z jednoelektronow o zredukow anym klasterem A, przy czym kolejność ich przyłączania do Nip jest przypadkow a, a do redukcji i utworzenia [Fe4S4]1+Nip+ (C H3)Ni^+ dochodzi w trakcie m etylacji. Następnie powstaje acetyl który łączy się z koenzym em A.
4 Dotychczasowy stan badań teoretycznych
4 Dotychczasowy stan badań teoretycznych
Przy zastosow aniu metod kw antowochem icznych, zw łaszcza dla dużych m o
lekuł, obliczenia wykonuje się nie dla rzeczyw istej struktury, ale dla w ydzielo
nego fragm entu rzeczyw istego układu m olekularnego tzw. struktury m odelowej.
Ważne jest, by struktura ta zachowywała istotne w łasności układu rzeczyw istego z punktu w idzenia rozwiązywanego na drodze obliczeniowej problem u. G eom e
tria, struktura elektronow a i reaktywność klastera A syntazy acetylokoenzym u A, dla różnych struktur modelowych, była przedm iotem badań czterech prac teore
tycznych [13-16],
Pierw sza ukazała się w 2003 roku. Schenker i Brunold [14] wykonali obli
czenia struktury elektronowej i geom etrycznej dla dw óch m odeli N iFeC, róż
niących się atom em m etalu w m iejscu M p. Pierw sza struktura zaw ierała C u+ , natom iast druga N i+ . Autorzy pokazali, że w łaściw ości klastera A zgadzają się z dośw iadczalnym i stałymi sprzężenia nadsubtelnego jeżeli m etalem w p ozy
cji proksym alnej jest nikiel oraz wskazali, że A red2 posiada strukturę elektro
nową [Fe4S4]1+Nip+ Ni^+ i charakteryzuje się sprzężeniem antyferrom agnetycz
nym m iędzy kubanem i Nip.
A utorzy drugiej publikacji, W ebster i w spółpracow nicy [15] wykonali w 2004 roku obliczenia optym alizacji geometrii stanów przejściow ych i produktów p o średnich w cyklu katalitycznym enzymu. Ich celem było spraw dzenie czy w m iej
scu M p znajduje się nikiel czy miedź, oraz który z tych m etali silniej wiąże się z CO i C H 3. Przetestowali też, czy aktyw acja enzym atyczna klastera w y
m aga jed n o- czy dwu- elektronowej redukcji. Przyjęty m odel strukturalny pozba
w iony był kubanu żelazo-siarkowego, który zastąpiono grupą Fe(SH 3)2+. O bli
czenia program em Gaussian98 wykonano m etodą DFT/B3LYP, przypisując różne bazy funkcyjne poszczególnym atom om klastera (Ni, Fe, Cu, S - baza LA N L 2D Z z efektyw nym potencjałem ECP; N, C, O - baza cc-pV D Z; H- baza D95V).
N ajbardziej obszerna z prac obliczeniow ych ukazała się w 2005 roku i należy do A m ara oraz w spółpracowników [13]. D la w szystkich obliczeń kw antow oche
m icznych przyjęto dwa modele strukturalne centrum aktyw nego, a atom y były za
m rażane w trakcie optym alizacji geometrii. W m odelu podstaw ow ym , w m iejsce
4 Dotychczasowy stan badań teoretycznych
am inokw asów (cystein i glicyny) zostały dodane atom y wodoru. W drugim roz
ważanym m odelu (o konform acji rozw artej), uw zględniono w iązania wodorowe tw orzące się z am inokwasami białka. M odelow ono dom niem ane stany pośred
nie, z grupą karbonylow ą (Arecil-CO, NiFeC), m etylow ą (Ared2-C H3) i acetylow ą, pojaw iające się w diam agnetycznym cyklu katalitycznym postulow anym przez L indah l’a [43]. W obliczeniach, przeprowadzonych za pom ocą program u Jaguar, zastosow ano m etodę DFT z funkcjonałem B3LYP w bazie funkcyjnej LACVP.
W iększą bazą funkcyjną LACV3P dla atom ów m etali, oraz bazą cc-pV TZ(-F) dla pozostałych atom ów posłużono się do obliczeń single point dla struktur zoptym a
lizowanych. Obliczenia zaprezentowane w pracy potw ierdziły konfiguracje elek
tronow ą [Fe4S4]1+Nip+Ni^+ i antyferrom agnetyczne sprzężenie w A red2. W ska
zano, że m ało praw dopodobne jest aby atom Nip(0) był związany z kubanem o konfiguracji [Fe4S4]2+, natom iast m oże wiązać się z [Fe4S4]1+. Pokazano, że dystalny atom niklu (Nid) nie uczestniczy w procesie katalizy i zasugerow nano, że utw orzenie m ostka disiarczkowego m oże dostarczyć dw óch elektronów po
trzebnych w trackie reakcji metylacji.
O statnia z prac obliczeniowych została opublikow ana w kw ietniu bieżącego roku [16]. Dw ie rozważane struktury m odelowe klastera A, m ała i duża uw zględ
niająca białko, zawierają histydynę zam iast pom ostowej cysteiny 512 (Rysunek 5.5). G łów nym celem autorów publikacji było spraw dzenie wpływu tej zmiany na param etry geom etryczne i w łaściw ości elektronow e klastera A. W oblicze
niach w ykorzystano metodę BS-DFT i przetestow ano dwa funkcjonały B P8 6 oraz B3LYP.
5 Obliczenia własne
5 Obliczenia własne
Przedstaw ione w pracy obliczenia w ykonano przy pom ocy program u Gaus- sian09 [67]. W yniki otrzym ano stosując m etodę DFT z funkcjonałem B P8 6
[27,28] w bazie TZV P [6 8]. W obliczeniach zastosowano funkcje o złam anej sy
m etrii (ang. Broken Symmetry, BS) [69,70], a do w yznaczenia dw uelektronow ych całek kolum bow skich korzystano z dopasow ania gęstości (ang. D ensity Fitting Approximation) wraz z odpowiadającą bazą TZV Pfit [6 8], W pływ otoczenia biał
kowego, na energię i geom etrię uzyskanych struktur, uw zględniono stosując m o
del ciągły rozpuszczalnika PCM [17,18] ze stałą dielektryczną e=4, 12, 20 i 80.
Do m odelow ania środow iska białkowego pow szechnie stosuje się stałą dielek
tryczna e=4 [29], jed nak wykazano, że w yższa wartość e pozw ala uzyskać lepszą zgodność z dośw iadczeniem dla wartości p K a i odległości m etał-m etal [71,72], Potw ierdziły to także wyniki naszych początkow ych testowych obliczeń. A naliza populacyjna M ullikena silnie zależy od w yboru bazy funkcyjnej, dlatego ładunki atom owe w yznaczono stosując analizę naturalnych orbitali wiązań, znaną jak o m etoda N B O (ang. Natural Bond Orbital) [73,74].
W celu w yznaczenia wartości pK a oraz potencjałów redukcji zastosow ano w pracy m etodologię N oodlem an’a i w spółpracow ników [7 1 ,7 5 -7 7 ]. W ykony
wali oni podobne obliczenia dla białka Rieske oraz reduktazy rybonukleotydow ej.
W artości p K a zostały obliczone ze wzoru:
p K a = [ E { M ) sol - E ( M H + )sol + A G sol( H + , 1 a t m ) - (5.22)
W pow yższym wzorze A G so;(H+ , 1 atm ) je s t energią solwatacji protonu pod ciśnieniem 1 atm osfery gazowego wodoru, która z danych eksperym entalnych w ynosi -263.98 kcal/m ol [3 6 ,3 7 ,7 8 ]. W kład entropii ruchu translacyjnego do energii sw obodnej protonu w fazie gazowej T A S ga.s(H + ) w tem peraturze 298
T A S gas( H +) + b- R T + A Z P £ ] / 1 .3 7
K oraz pod ciśnieniem 1 atm wynosi -7.76 kcal/m ol. Fragm ent w zoru - RT uw zględnia w kład energii ruchu translacyjnego protonu oraz PV = RToraz PV = RT
5.1 Modele obliczeniowe
[79], Energia punktu zerowego (AZPE) dla struktur protonow anych została obli
czona dla m ałych modeli [80], w których nie było ograniczeń geometrii. Struktury m ałych m odeli i wartości A Z PE znajdują się w Załącznikach (Tablica C l , R ysu
nek C l).
Potencjał redukcji został obliczony według wzoru:
E 0 = [E ( M + )sol - E ( M ) sol] / n + A S H E , (5.23) gdzie: potecjał standardowej elektrody wodorowej A SH E=4.28 V został zaczerp
nięty z danych literaturowych [35-37], a n= 1 lub 2 oznacza liczbę elektronów biorących udział w procesie redukcji.
Potencjał redukcji związany z przyłączeniem protonu w yznaczono z rów na
nia:
<524) gdzie: m oznacza liczbę protonów biorących udział w reakcji redukcji (w niniej
szej pracy m -1).
5.1 Modele obliczeniowe
D la klastera A syntazy acetylokoenzym u A dysponujem y geom etrią dośw iad
czalną. W spółrzędne startowe do obliczeń zostały wygenerow ane ze struktury krystalograficznej, opisanej dla bakterii Carboxydothermus hydrogenoformans, która je s t dostępna w m iędzynarodowej bazie Protein Data Bank jak o 1RU3 [51].
W ybrane, wyznaczone metodami eksperym entalnym i param etry geom etryczne klastera A znajdują się w Tablicy 5.1. Zastosow ana w obliczeniach struktura m o
delow a klastera A została pokazana na Rysunku 5.5. N um eracja atom ów stoso
w ana w tekście i tablicach je s t zgodna z tym rysunkiem . N a ilustracji za pom ocą gw iazdek oznaczono atom y zamrożone w trakcie optym alizacji geom etrii, strzał
kam i pokazano rozw ażane m iejsca protonacji, natom iast liniam i przeryw anym i w yróżniono w iązania wodorowe, które tw orzą się m iędzy atom am i siarki i tlenu klastera A, a am inokwasam i białka. W szystkie, różniące się w ielkością, w ykorzy
stane do obliczeń m odele strukturalne klastera A zostały pokazane na Rysunku 5.6 i oznaczono je odpowiednio, od najm niejszego do najw iększego, jak o MO, M l, M 2 i M 3.
W m ałym m odelu MO cząsteczki cystein: Cys509, C ys512, Cys521 i Cys531 zastały zastąpione grupam i -SCH 3, natom iast am inokw asy Ser597 i PheóOl przez atom y H. Jedynie dla tego m odelu nie zam rażano atom ów w trakcie przeprow adzania obliczeń optym alizacji geometrii. W m odelu średnim M l czą
steczki cystein: Cys509, Cys512, Cys521 i Cys531 m odelow ane były przez grupy -SC H2CH 3, natom iast am inokwasy Ser597 i PheóOl przez grupy -C O C H3
5.1 Modele obliczeniowe
i -N H C H3. W m odelach dużych, M 2 i M 3, zostały uw zględnione reszty am ino- kw asow e, które m ogą tworzyć w iązania w odorow e z atom am i siarki reszt d o ło wych kubanu i atom am i tlenu w koordynacyjnym otoczeniu niklu. W m odelu M 2 w łączono w strukturę tylko am inokw asy w obrębie kubanu żelazo-siarkow ego, a w m odelu M 3 dodano argininę (Arg 619) celem zbadania ja k duży w pływ na po tencjały redukcji m a ten zasadowy am inokw as w ystępujący w białku po stronie atom ów niklu.
R ysunek 5.5: Zastosowana w obliczeniach struktura modelowa klastera A oparta na strukturze krystalograficznej 1RU3, PDB. Odnośnik [51]
o Gwiazdki oznaczają atomy zamrożone w trakcie optymalizacji, o Strzałki pokazują rozważane miejsca protonacji,
o Linie przerywane wskazują wiązania wodorowe,
0 Numeracja atomów stosowana w tekście i tablicach jest zgodna z tym rysunkiem
D la w skazanych m odeli strukturalnych przeprow adzono optym alizację geo
m etrii klastera A na trzech stopniach utlenienia: A ox, h red\ i A red2. U w zględ
niono rów nież struktury protonow ane klastera A oraz z ligandam i w ażnym i w cy
klu katalitycznym enzym u. Ponadto dla w szystkich rozpatryw anych m odeli, sto sując analizę naturalnych orbitali w iązań (N BO ) w yznaczono gęstości spinow e 1 ładunki, a w edług w zorów przytoczonych w poprzednim podrozdziale obli
czono w artości pK a i potencjały redukcji. W szystkie otrzym ane w yniki porów -
5.1 Modele obliczeniowe
nano z dostępnym i danymi literaturowymi [9,19,43,51,81], Pozwoliło to na ocenę wpływu wielkości m odelu oraz otoczenia białkowego na właściwości redoksowe klastera A.
Tablica5.1: Wybrane,wyznaczone eksperymentalnieparametrygeometryczne klasteraA
5.1 Modele obliczeniowe
ujz
Ny
Ł<
CdO o
nJ
fSco
>cd X
UJz
<.
Q
oo Os cmcm
n w — —
SO 00 os r - 00 os
CM CM
cm r-* > n cm
s « si 5 : rb (S —' —
co «/-> ^
vb >n t-:
so —
— co
— o
^ co
— oo o<
T Os
SsO so
co cn‘
00 p so
vi Tf’ vo
O SD oo
OO CM \ o s o X O CM 00
CM OS (— CO
CN Is- rt JO od
— cm 5 2 -
00 CO CM CO
st 0000 os od OJ
— CO 0 0
T f c o fM
2 r “5
CM CO — —
sO —
so r-~
r-; r f
CM CO
O
sd OS
'O co 2 X 'Nco oo
C ^ s f OS
^ sd CM o o r** r** ^
o
<D C U _5J
•►o*
Z Ł 03
*
<T t 'a. a.
s s
>■*
«*
a.
o zi? só Z co
B.
Z Ł
ooU-
< ^ x <3
UJ u 00 so
r- os CM CM
^ z
'a.
X OCN
£ K o-3
£ Z ONOt
'2'C/3
cC
■oO
oo M 'C«C Oa O
*2K/3
cfi
T3O
'2'C/3
c G 'GO
^tNO M
‘2'C/3 C
pG
O ot s«ac
Oc
■aO
CMOO
’ 2VZ3 oC
PO
Mc
SC/3cc T3
o
5.2 Geometria i struktura elektronowa klastera A
MO
_
M,
M2 M3
Rysunek 5.6: Modele klastera A stosowane w obliczeniach
5.2 Geometria i struktura elektronowa klastera A
5.2.1 K laster A
P ierw szym etapem pracy było przeprow adzenie obliczeń optym alizacji geo
m etrii klastera A na różnych stopniach utlenienia: A ox, A redi i A redi- W struktu
rze krystalograficznej 1RU3 [50] z proksym alnym atom em niklu skoordynow ana je s t cząsteczka H20 , dlatego je s t ona obecna w e w szystkich strukturach w trakcie optym alizacji. N a Rysunkach 5.7 i 5.8 przedstaw iono zoptym alizow ane geom e
trie k lastera A na różnych stopniach utlenienia dla m odeli MO, M l, M 2 i M3 otrzym ane dla £=20. W Tablicy 5.2 zam ieszczone są w artości energii zoptym ali
zow anych struktur, natom iast wybrane zoptym alizow ane odległości m iędzy ato
m am i zn ajdują się w Tablicy 5.3. D la e=4, dla m ałego m odelu MO uzyskano zbyt ujem ne w artości potencjałów redukcji, z tego w zględu zrezygnow ano z tej stałej dielektrycznej w obliczeniach dla dużych m odeli (M 2 i M 3).
M odel m ały (MO) i średni (M l) są konstrukcyjnie giętkie. W w yniku obli
czeń otrzym ano dla nich dw ie struktury charakteryzujące się odpow iednio krótką (konform acja zw arta) i długą (konform acja rozw arta) odległością N ip- F e l, przy
5.2 Geometria i struktura elektronowa klastera A
czym energia struktury zwartej jest zaw sze o około 0.01-0.02 a.u. niższa. Ponie
waż jednoelektronow o zredukowany m odel M l nie w ystępuje w form ie rozw artej, w ykonano dodatkow e obliczenia w których odległość N ip-S4 została ustalona na 2.9
A,
podobnie do wartości podawanej dla kryształu [50]. Przyczyną takiego po stępow ania je s t brak zwartej struktury w dostępnych danych dośw iadczalnych.Z godnie z przeprow adzonym i obliczeniam i w przypadku m odeli M 2 i M 3, dla których uw zględniono dalsze otoczenie białkow e, otrzym ano jed y nie konform a
cję zw artą, o krótkiej odległości Nip-F e l. O becność am inokw asów nie pozw ala bow iem na obliczenia z zam rożoną odległością N ip- F e l .
A ox A „ d i A e d 2
M0 A
MOa S '
X
M1
V - T *
~ d M1a
1
R ysunek 5.7: Zoptymalizowane geometrie klastera A na różnych stopniach utlenienia dla modeli MO i M l. Wyniki otrzymano metodą DFT/BP8 6 w bazie funkcyjnej TZVP z zastosowaniem modelu PCM/e=20. Otrzymano dwie konformacje klastera A: zwartą i rozwartą. Literą a w nazwie modelu oznaczono struktury o konformacji rozwartej. Ob
liczenia dla formy utlenionej (Aox) modelu M l nie były wykonywane
D la w szystkich struktur utlenionych (A ox) m ożna zaobserw ow ać, że podob
nie ja k w strukturze krystalograficznej cząsteczka w ody zw iązana je s t przez atom tlenu z atom em Nip (Rysunek 5.7, R ysunek 5.8, Tablica 5.3). Po redukcji klastera cząsteczka w ody odłącza się od m etalu i w iąże w iązaniam i w odorow ym i przez
5.2 Geometria i struktura elektronowa klastera A
atom y siarki. D la m odeli M l, M2 i M 3 zam rożone w trakcie obliczeń optym a
lizacji geom etrii atom y w ęgla (R ysunek 5.7 i 5.8) nie pozw alają na rotacje ku- banu oraz zapobiegają innym przem ieszczeniom atom ów, które nie są m ożliw e w białku.
B iorąc pod uwagę dane zawarte Tablicy 5.3 m ożna zaobserw ow ać kilka ogól
nych zależności. D la struktur utlenionych (A ox) w szystkich branych pod uw agę m odeli odległość Nip-N id jest m niejsza, a N ip-F e l w iększa niż dla struktur zredu
kow anych, co w ynika z koordynacji cząsteczki wody do N ip. W strukturach jedno- i dw u-elektronow o zredukow anych (A re<n i A red2) dla m odeli M l, M 2 i M 3 odle
głość m iędzy atom am i Nip-Nid jest duża i przekracza 3.0
A,
natom iast odległość N ip-F e l je s t m ała i w ynosi ~ 2 .5A.
M odele M l , M 2 i M 3 m ają więc konform acje zw arte. G eneralnie m ożna zauważyć, że w raz ze w zrostem w ielkości m odelu w ydłuża się dystans m iędzy atomami Nip i N id, a skraca m iędzy atom am i N ip oraz F e l.
A A A
^ox ^redl **rod2
M2 A ? '
j
- « S S
R ysunek 5.8: Zoptymalizowane geometrie klastera A na różnych stopniach utlenienia dla modeli M2 i M3. Wyniki otrzymano metodą DFT/BP8 6 w bazie funkcyjnej TZVP z zastosowaniem modelu PCM/s=20. Otrzymano tylko struktury zwarte klastera A
G ęstości spinow e i ładunki N B O na fragm entach klastera A dla trzech stopniach utlenienia zostały zebrane w Tablicy 5.4. Przedstaw iony ro z kład gęstości spinow ych pokazuje, że A ox posiad a konfigurację elektronow ą [Fe4S4]+2- N i+2N żJ2; A redi [Fe4S4]+2- N i +1N i^ 2, a niesparow any elektron jest zlokalizow any na Nip; natom iast A red2 [Fe4S4]+1- N i +1N iJ2 i w ystępuje tu sprzę
żenie antyferrom agnetyczne m iędzy N ip i kubanem o czym św iadczą przeciw ne
