Jak już wspomniano wyżej, aparatura GC-MS ma pewne ograniczenia co do tego, co i jak można analizować. To nie „magiczna czarna skrzynka”, przedstawiana czasem w filmach jako narzędzie pozwalające na określenie długości zarostu właściciela samochodu na podstawie próbki lakieru pozostawionego po stłuczce. Często nie jest nawet możliwe ustalenie pełnego składu mieszaniny prostych substancji. Podstawowym ograniczeniem jest możliwość analizy jedynie lotnych substancji, czyli takich, które da się przeprowadzić do fazy gazowej.
Szczególnym przypadkiem jest tu analiza polimerów, które mimo tego, że zazwyczaj lotne nie są, to możliwe jest przeprowadzenie ich termicznego rozkładu i analiza powstałych produktów depolimeryzacji. Takie analizy wykonuje się często w celu określenia szybkości i sposobu starzenia się tworzyw w wyniku działania czynników środowiskowych.
2.3.1 Składniki nielotne
Do chromatografu można również wprowadzać próbki zawierające składniki nielotne, ale składników tych nie da się analizować. Dotyczy to ogólnie techniki GC, nie tylko GC-MS. Pozostaną one nieodparowane w dozowniku. Z tym może wiązać się szereg problemów. Jeśli są to substancje organiczne, to z czasem mogą one ulegać rozkładowi z wydzieleniem małocząsteczkowych (lotnych) produktów, które widoczne będą w kolejnych analizach. Związki trwałe termicznie (np. sole metali) pozostając w dozowniku mogą mieć działanie katalityczne i powodować np. rozkład wprowadzanych do chromatografu substancji. W wyniku nagromadzenia substancji stałych w dozowniku może zachodzić na nich adsorpcja analitu, co powodować będzie pojawianie się charakterystycznych
„ogonów” w pikach analizowanych substancji.
2.3.2 Analiza ilościowa
Analiza wykonana za pomocą GC-MS bardzo rzadko ma charakter ilościowy. Istotną przeszkodą jest tutaj duża zależność czułości od parametrów procesu jonizacji, pracy analizatora i starzenia się detektora. Analizy ilościowe wykonywane są zasadniczo dwiema metodami:
Oznaczanie w trybie SIM na podstawie krzywej kalibracyjnej (kalibrację trzeba często powtarzać)
Oznaczanie za pomocą dodatku wzorca izotopowego – do próbki dodaje się znaną ilość oznaczanej substancji znakowaną wzorcem, w przypadku związków zawierających atomy tlenu często używa się wzorców zawierających atomy 18O. Tego typu oznaczenia często wykorzystywane są w badaniach przyswajania, metabolizmu i wydalania substancji biologicznie czynnych. Ze względu na obecność analitu i wzorca w jednej próbce znacząco zmniejsza się wrażliwość na warunki eksperymentu, a zawartość analitu oblicza się na podstawie stosunku intensywności jednego z jego pików do intensywności piku wzorca.
Ze względu na różną zdolność do jonizacji niektórych substancji próby identyfikacji pików w chromatogramach uzyskanych za pomocą innego detektora (np. FID) na podstawie chromatogramów uzyskanych z GC-MS mogą zakończyć się niepowodzeniem. Np. w sytuacji, gdy na chromatogramie MS obserwuje się kolejno 3 małe piki a potem czwarty duży pik analitu, może zdarzyć się tak, że na chromatogramie z FID obecne będą dwa duże piki i jeden mały, a dodatkowo piki te będą miały znacznie różniące się czasy retencji. Dziać się tak może, ponieważ FID jest nieczuły na jeden z
analizowanych związków, a na pozostałe charakteryzuje się inną czułością niż MS. Niemożliwe jest w takim wypadku stwierdzenie, który pik z FID pochodzi od analitu. Zdolność do jonizacji można stosunkowo łatwo mierzyć i obserwować. Jeśli przykładowo sporządzi się mieszaninę składającą się z równych ilości dwóch różnych związków, to może zdarzyć się tak, że stosunek pól powierzchni pików z GC-MS będzie w przybliżeniu wynosił nie 1:1, jak często ma to miejsce w przypadku FID, a na przykład 20:1.
2.3.3 Szczelność połączeń
Ważne jest ponadto zachowanie szczelności wszystkich połączeń w układzie. Zwłaszcza od strony spektrometru masowego, gdzie panuje podciśnienie, które może prowadzić do zasysania do wnętrza spektrometru powietrza, a wraz z nim innych zanieczyszczeń.
Konieczne jest także stosowanie odpowiednich do spektrometrii mas kolumn chromatograficznych.
Kolumny te różnią się od standardowych kolumn tym, że faza stacjonarna jest zwykle mocniej związana, przez co ogranicza się jej przenikanie do spektrometru (tzw. column bleed). Kolumny te mogą zazwyczaj pracować w niższej maksymalnej temperaturze niż zwykłe kolumny GC.
Rysunek 30: Spektrochromatogram uzyskany za pomocą nieszczelnego spektrometru
Na powyższym rysunku przedstawiono spektrochromatogram uzyskany za pomocą nieszczelnego spektrometru. Na osi odciętych numer skanu (czas retencji), na osi rzędnych stosunek m/z poszczególnych jonów. Ciemniejszy kolor odpowiada większemu natężeniu sygnału o danym m/z.
Widoczne są tutaj charakterystyczne jony o m/z = 18, 28, 32 i 44, czyli odpowiednio: woda, azot, tlen i dwutlenek węgla. Występowanie piku o m/z = 18 świadczy o obecności wody w układzie spektrometru, jednakże zazwyczaj nie jest to para wodna z powietrza, która przedostaje się do wnętrza przez nieszczelności, lecz woda zaadsorbowana na ściankach wewnątrz komory spektrometru, która w trakcie pracy ulega powolnej desorpcji. Pik ten obserwuje się często tuż po uruchomieniu (odpompowaniu) spektrometru, który nie był długo używany.
m/z
numer skanu
Na poniższym rysunku przedstawiono chromatogramy obrazujące intensywność wybranych jonów z tej samej próbki.
Rysunek 31: Chromatogramy charakterystycznych jonów (kolorami oznaczono wybrane m/z)
Wyraźnie widoczne jony o m/z = 28 i 32 świadczą o przedostawaniu się powietrza do wnętrza spektrometru (przez nieszczelność). Zmiany intensywności tych jonów w czasie pozwalają jednoznacznie zidentyfikować źródło nieszczelności – znajduje się ono wewnątrz komory chromatografu, w miejscu gdzie kolumna kapilarna połączona jest ze spektrometrem. Wniosek taki można wysunąć na podstawie tego, że analiza wykonywana była z programem temperaturowy, Początkowo temperatura utrzymywana była na stałym poziomie, następnie zaczęła rosnąć, a po osiągnięciu wartości końcowej utrzymywana była na tym poziomie przez kilka minut. W momencie rozpoczęcie wzrostu temperatury widoczny jest spadek intensywności jonów 28 i 32, spowodowany tym, że lepkość powietrza (i gazów w ogóle) rośnie wraz ze wzrostem temperatury, przez co przy stałej różnicy ciśnień między komorą chromatografu (~1 atm) a wnętrzem spektrometru (~0 atm) zmniejszać się będzie natężenie przepływu, a zatem ilość przedostającego się gazu. Dopiero w wyniku dalszego podwyższania temperatury następuje wzrost natężenia przepływu, spowodowany prawdopodobnie rozszerzalnością cieplną elementów uszczelniających kolumnę.
W przypadku piku 44 (CO2) obserwuje się wzrost jego intensywności wraz ze wzrostem temperatury.
Spowodowane jest to utlenianiem grafitowych feruli uszczelniających kolumnę w porcie spektrometru (C + O2 → CO2).
2.3.4 Column bleed
Na poprzednim rysunku widoczny jest także wzrost piku o m/z = 207, jest to pik pochodzący od cyklicznego polidimetylosiloksanu (Rysunek 32), który powstaje w wyniku termicznej degradacji fazy stacjonarnej w kolumnie chromatograficznej.
Rysunek 32: Mechanizm powstawanie zjawiska column bleed
Na rysunku zaznaczono także przebieg piku o m/z = 91 (kation tropyliowy). Pomimo stosunkowo dużej intensywności pików pochodzących od zanieczyszczeń jego wartość pozostaje na stałym niskim poziomie (poza momentami, kiedy eluują węglowodory alkiloaromatyczne). Wnioskować można zatem, że niewielka nieszczelność i column bleed nie przeszkadzają w szczególny sposób w analizie, jest to jednak wniosek nie do końca poprawny. Zanieczyszczenia widoczne na chromatogramie TIC mogą często spowodować ukrycie w szumie pików substancji, które normalnie byłyby widoczne. Ponadto obecność tych jonów może skutecznie utrudniać analizę jakościową składu mieszaniny. Oprogramowanie nie zawsze pozwala na pominięcie tych pików w procesie przeszukiwania bazy widm.
Ponadto ciągłe wprowadzanie powietrza do wnętrza spektrometru może powodować jego przedwczesną degradację, natomiast column bleed będzie prowadził do gromadzenia się zanieczyszczeń w źródle jonów.
3 Literatura
1. W. Szczepaniak, Metody instrumentalne w analizie chemicznej, PWN, Warszawa 2005 2. Z. Witkiewicz, J. Hepter, Chromatografia gazowa, WNT, Warszawa 2001
3. Z. Witkiewicz, Podstawy chromatografii, WNT, Warszawa 2005
4. W. Szczepaniak, Metody instrumentalne w analizie chemicznej, PWN W-wa, 1997.
5. W. Zieliński, A. Rajca (red.), Metody spektroskopowe i ich zastosowanie do identyfikacji
związków organicznych, WNT W-wa, 1995.
6. R. M. Silverstein, G. C. Bassler, Spektroskopowe metody identyfikacji związków organicznych,
PWN W-wa, 1970.
7. R. A. W. Johnstone, Spektrometria masowa w chemii organicznej, PWN W-wa, 1975