Przydatność antygenów chimerycznych w serodiagnostyce toksoplazmozy u świń

Podobnie jak w przypadku owiec, zarażenie T. gondii jest jednym z najczęściej występujących u świń, szacuje się, iż w krajach Unii Europejskiej wynosi średnio 6%

i waha się od 0-64% w poszczególnych krajach [EFSA, 2007; Tenter i wsp., 2000].

O ile obraz kliniczny pierwotnego zarażenia u świń jest zbliżony do tego występującego u owiec, to jednak znacznie rzadziej dochodzi do ronień u ciężarnych macior, co

135 związane jest najprawdopodobniej ze zdecydowanie mniejszym ryzykiem przejścia pasożyta przez łożysko do płodu [Dubey, 2009a]. Do zarażenia pasożytem dochodzi najczęściej u młodych świń, analogicznie jak u owiec poprzez spożycie zanieczyszczonego pokarmu i wody. Częstość występowania zarażenia zależy w przypadku świń przede wszystkim od typu hodowli, z przeprowadzonych badań wynika, iż bardzo wysoki odsetek seropozytywnych świń (do 100%) odnotowuje się w gospodarstwach, gdzie zwierzęta hoduje się na tzw. wolnym zewnętrznym wybiegu.

Podczas gdy na tzw. farmach zamkniętych, gdzie przestszegane są rygorystyczne warunki sanitarne dotyczące zarówno warunków bytowania zwierząt jak i jakości pasz i wody podawanych zwierzętom wyeliminowano ryzyko zarażenia [Kijlstra i wsp., 2004; Tenter i wsp., 2000]. Mimo, wszystko spożycie wieprzowiny, która jest najczęściej konsumowanym mięsem stanowi prawdopodobnie główną przyczynę transmisji pasożyta do człowieka. O ile hodowla zamknięta zwierząt pozwala zminimalizować, a czasami nawet całkowicie wyeliminować ryzyko zarażenia pasożytem, może to już nie potrwać długo, szczególnie w świetle rozporządzeń Unii Europejskiej, z których wynika, iż powinno się prowadzić bardziej przyjazne hodowle zwierząt i zrezygnować z tzw. zamkniętych farm, gdzie zwierzęta są całkowicie odizolowane od świata zewnętrznego. Na problem ten zwrócili niedawno uwagę Dubey i wsp., którzy po raz pierwszy od kilku lat odnotowali w Stanach Zjednoczonych wysoki odsetek seropozytywnych świń właśnie w tzw. „organicznych” gospodarstwach [Dubey i wsp., 2012]. W związku z powyższym diagnostyka toksoplazmozy u świń nadal będzie bardzo istotana z punktu ograniczenia ryzyka transmisji pasożyta drogą pokarmową do człowieka, a co za tym idzie drogą wertykalną do płodu u ciężarnych kobiet.

W niniejszej pracy wykazano potencjalną dużą użyteczność trzech antygenów chimerycznych SAG1D-MIC1-MAG1, SAG2-GRA1-ROP1D i GRA1-GRA2-GRA6 do diagnostyki toksoplazmozy u świń. Czułość testów IgG ELISA opartych na tych antygenach wynosiła od 90,1-96,3% (Tab. 18 i Rys. 28). Uzyskane rezultaty potwierdziły, iż wielkość fragmentów immunodominujących poszczególnych białek determinuje reaktywność antygenów, o czym świadczy przede wszystkim czułość testów opartych na antygenach chimerycznych SAG1D-MIC1-MAG1 (90,1%) i SAG2-GRA1-ROP1D (93,8%) w porównaniu odpowiednio do czułości testów z wykorzystaniem MIC1-MAG1-SAG1M (45,7%) i SAG2-GRA1-ROP1M (28,4%). Na podstawie tych wyników, można przypuszczać, iż białka pasożyta ROP1 oraz SAG1 pełnią ważną rolę w procesie inwazji pasożyta u świń i odpowiadają za modulację silnej odpowiedzi immunologicznej. Immunogenność antygenu powierzchniowego SAG1 znajduje potwierdzenie we wcześniejszych badaniach dotyczących możliwości zastosowania antygenów rekombinantowych B427 (MAG1), C55 (GRA2), V22 (SAG2), MBP30 (SAG1) oraz C51 do wykrywania swoistych przeciwciał

136 antytoksoplazmowych u świń [Gamble i wsp., 2000]. Na podstawie uzyskanych rezultatów stwierdzono, iż w niedługim czasie od momentu zarażenia najlepiej rozpoznawane przez przeciwciała anty-T. gondii były antygeny C51, V22 (SAG2) i MBP30 (SAG1), jednakże po około roku od zarażenia rozpoznawane były już tylko antygeny C51 i MBP30 (SAG1). Wysoki potencjał diagnostyczny antygenu SAG1 potwierdzono również w kolejnych badaniach, które dotyczyły zastosowania antygenu MIC3 w teście LAT, w których uzyskane rezultaty odnoszono do tych uzyskanych w teście SAG1-ELISA [Jiang i wsp., 2008]. Oba antygeny MIC3 i SAG1 charakteryzowały się wysokim potencjałem diagnostycznym, o czym świadczy przede wszystkim pozytywny współczynnik zgodności pomiędzy testami na poziomie 96%

w przypadku kiedy do testów wykorzystano surowice od eksperymentalnie zarażonych świń oraz 91,4% w przypadku niezdefiniowanej puli surowic świńskich. W swoich wcześniejszych badaniach zespół Katedry Biotechnologii Molekularnej i Mikrobiologii Politechniki Gdańskiej również wykazał, iż stosując do testów pojedyncze antygeny rekombinantowe (MAG1, SAG1 i GRA7), najlepiej jest stosować antygen SAG1, który charakteryzował się 85,3% reaktywnością [Holec-Gąsior i wsp., 2010]. Niemniej jednak, przeprowadzone badania wykazały, iż najkorzystniej do diagnostyki toksoplazmozy u świń jest stosować mieszankę białek rMAG1+rSAG1+rGRA7, co pozwoliło na opracowanie testu IgG ELISA o czułości 97,3%. Antygen chimeryczny SAG2-GRA1-ROP1D zawierający fragment immunodominujący białka ROP1 odpowiadający prawie całemu antygenowi (reszty aminokwasowe od 85-396), posiada jak opisano wcześniej w C-końcowym regionie białka prawdopodobnie silne determinanty antygenowe rozpoznawane przez swoiste przeciwciała antytoksoplazmowe, co w znaczący sposób wpływa na reaktywność. Wielkość fragmentu immunodominującego białka ROP1 wchodzącego w skład antygenu chimerycznego limituje więc zdolność do odziaływania z przeciwciałami anty-T.

gondii, co potwierdzają również wyniki uzyskane w testach IgG ELISA z wykorzystaniem surowic kocich i końskich. Dodatkowo można przypuszczać, iż u tych grup zwierząt w surowicach występuje stosunkowo niskie miano swoistych przeciwciał skierowanych przeciw antygenom SAG2 i GRA1. Potwierdzeniem takiego stanu rzeczy mogą być wspomniane wcześniej badania, w których wykazano, iż antygen V22 (SAG2) jest stosunkowo dobrze rozpoznawany przez przeciwciała tylko w stosunkowo niedługim czasie od momentu zarażenia świń pasożytem [Gamble i wsp., 2000]. Niski potencjał diagnostyczny antygenu SAG2 w testach IgG i IgM ELISA wykazano również w ostatnich badaniach dotyczących potencjalnego zastosowania antygenów rekombinantowych do serodiagnostyki toksoplazmozy u świń [Terkawi i wsp., 2013]. Z przeprowadzonych doświadczeń wynikało, iż spośród antygenów SAG2, GRA7 i GRA14 w testach IgG i IgM ELISA najlepiej jest stosować antygen GRA7, który może zostać rówież zastosowany do opracowania szybkiego

137 diagnostycznego testu immunochromatograficznego ICT (ang.

ImmunoChromatographic Test).

6.3.5. Podsumowanie

Rozpowszechnienie toksoplazmozy wśród zwierząt stanowi istotny problem diagnostyczny, szczególnie z punktu widzenia badań przeprowadzonych w ostatnich latach, które dotyczyły wykrywania zarażenia pasożytem u coraz większej liczby gatunków zwierząt, wliczając w to ssaki wodne. Z jednej strony zasadność badań epidemiologicznych u zwierząt wynika często ze wzgledów czysto ekonomicznych, czego doskonałym przykładem są owce, u których zarażenie pasożytem związane jest z poważnymi stratami reprodukcyjnymi. Z drugiej strony monitorowanie sytuacji epidemiologicznej narzucają odpowiednie regulacje prawne, jak na przykład dyrektywa Unii Europejskiej nr 2003/99/EC, która nakłada na kraje członkowskie obowiązek wprowadzenia programów umożliwiających określenie częstości występowania chorób pasożytniczych szczególnie wśród zwierząt hodowlanych (owce, kozy, świnie) [EFSA, 2007; Kijlstra i Jongert, 2009]. Niestety w większości krajów nie idą za tym konkretne działania, które pozwoliłyby określić rzeczywistą wartość problemu. Dostępne dane nie odnoszą się najczęściej do faktycznej sytuacji epidemiologicznej konkretnych chorób pasożytniczych w całym kraju, a dotyczą najczęściej konkretnych regionów, na terenie których jakiś ośrodek wykonał badania ze względów czysto naukowych. Z punktu widzenia zdrowia publicznego, diagnostyka toksoplazmozy u zwierząt hodowlanych wydaje się kluczowa w możliwości wyeliminowania głównego źródła transmisji pasożyta do człowieka, jakim jest spożywanie mięsa zarażonych zwierząt.

W niniejszej pracy przedstawiono potencjalną użyteczność rekombinantowych antygenów chimerycznych do serodiagnostyki toksoplazmozy u różnych grup zwierząt.

Największą przydatnością immunodiagnostyczną porównywalną z poliwalentnym antygenem natywnym TLA (100%) charakteryzuje się antygen chimeryczny SAG2-GRA1-ROP1_D, który wykazuje najwyższą reaktywność niezależnie od badanej grupy zwierząt (od 93,3% dla IgG ELISA z wykorzystaniem surowic kocich do 100% dla IgG ELISA z wykorzystaniem surowic końskich i owczych). Uzyskane rezultaty pokazują, iż przy konstrukcji antygenów chimerycznych o potencjalnej przydatności diagnostycznej należy zwrócić przede wszystkim uwagę na dobór białek pasożyta oraz wielkość fragmentów immunodominujących poszczególnych antygenów. Pojedyncze antygeny dobrze rozpoznawne przez swoiste przeciwciała antytoksoplazmowe u jednej grupy zwierząt, mogą być kompletnie bezużyteczne do diagnostyki toksoplazmozy u innej grupy. Podobną prawidłowość można zaobserwować dla antygenów chimerycznych, co doskonale obrazuje przykład antygenów chimerycznych złożonych z fragmentów immunodominujących białek SAG2, GRA1 i ROP1. W przypadku zastosowania do testów IgG ELISA surowic owczych, niezależnie od wielkości

138 fragmentu białka ROP1 wchodzącego w skład antygenu chimerycznego uzyskano bardzo wysoką reaktywność (100%), co sugeruje, iż w surowicach tych znajdowały się przeciwciała skierowane przeciw wszystkim trzem białkom pasożyta. Znajduje to potwierdzenie we wcześniejszej pracy zespółu Katedry Biotechnologii Molekularnej i Mikrobiologii Politechniki Gdańskiej, w której określono zdolność przeciwciał antytoksoplazmowych do oddziaływania z pojedynczymi antygenami rekombinantowymi SAG2 (98,9%), GRA1 (100%) i ROP1 (100%) [Holec-Gąsior i wsp., 2014]. Zupełnie inaczej sytuacja wyglądała kiedy do testów wykorzystano surowice kocie, końskie i świńskie, w których zaobserwowano, iż wielkość fragmentu immunodominującego białka ROP1 limituje zdolność antygenów chimerycznych do oddziaływania ze swoistymi przeciwciałami anty-T. gondii. O ile w przypadku zastosowania antygenu SAG2-GRA1-ROP1_D niezależnie od badanej grupy zwierząt odnotowano wysoką czułość testów IgG ELISA powyżej 93,3%, tak w przypadku testów opartych na antygenie SAG2-GRA1-ROP1_M reaktywność była zdecydowanie niższa i wynosiła zaledwie 28,4% dla surowic świńskich i 50% dla surowic kocich i końskich. Uzyskane rezultaty sugerują, iż w surowicach tych zwierząt przeważają przede wszystkim przeciwciała skierowane przeciw antygenowi roptrii ROP1, a miano swoistych przeciwciał anty-SAG2 i anty-GRA1 jest zdecydowanie niższe i nie pozwala na poprawne wykrycie zarażenia pasożytem. Analogiczną sytuację można zaobserwować dla antygenów chimerycznych złożonych z fragmentów immunodominujących białek MIC1, MAG1 i SAG1. Wytłumaczeniem takiego stanu rzeczy może być fakt, iż poszczególne gatunki zwierząt wykształciły zróżnicowaną odporność na zarażenie pasożytem i tak na przykład człowiek i owce są zdecydowanie bardziej podatni na zarażenie pasożytem, niż konie czy bydło [Innes, 1997]. Na drodze ewolucji u poszczególnych przedstawicieli ssaków doszło do różnych zmian w genomach, co spowodowało u niektórych gatunków między innymi wyciszenie pewnych genów, a u innych ich usunięcie. Przykładem doskonale obrazującym ten fakt może być zmienna liczba genów irg (ang. immunity-related GTPase), kodujących białka z rodziny GTPaz związanych z odpornością wrodzoną przeciwko wewnątrzkomórkowym patogenom. Geny kodujące białka IRG występują u praktycznie wszystkich ssaków, w genomie myszy można znaleźć łącznie 21 genów kodujących białka z rodziny IRG, jednakże w genomie człowieka zostały one zredukowane do 2 genów, a mianowicie irgm oraz irgc, przy czym drugi z genów prawdopodobnie nie koduje białka związanego z odpornością [Bekpen i wsp., 2005; Bernstein-Hanley i wsp., 2006; Collazo i wsp., 2001; Howard, 2008; MacMicking i wsp., 2003;

MacMicking, 2005; Taylor i wsp., 2000; Taylor, 2007; Zhao i wsp., 2009]. Co więcej o zróżnicowanej odporności na zarażenie można mówić nawet na poziomie szczepów, które różnią się niekiedy pojedynczymi genami, co doskonale obrazuje model zwierzęcy wykorzystywany najczęściej do doświadczeń, a mianowicie różne szczepy

139 myszy laboratoryjnych [Araujo i wsp., 1976; McLeod i wsp., 1989; Suzuki i wsp., 1995; Williams i wsp., 1978]. Z wielu badań wynika, iż myszy wsobne szczepu BALB/c wykazują stosunkowo mniejszą wrażliwość na zarażenie pasożytem, szczep C3H/HeJ jest średnio wrażliwy, a szczep C57BL/6 wrażliwy na zarażenie. Oczywiście nie znaczy to, że u myszy BALB/c nie dojdzie do zarażenia pasożytem, wręcz przeciwnie jest to doskonały model zwierzęcy wykorzystywany do badań dotyczących ostrej fazy choroby. Wyżej wymienione szczepy myszy charakteryzują się przede wszystkim różną zdolnością do przeżycia w zależności od szczepu i formy rozwojowej pasożyta, którym zostały zarażone, co sugeruje również, iż w przypadku poszczególnych gatunków zwierząt będzie dochodziło do różnej odpowiedzi układu immunologicznego na skutek zarażenia danym szczepem T. gondii. Zjadliwość poszczególnych szczepów pasożyta może zatem determinować modulację odpowiedzi immunologicznej u różnych gatunków zwierząt, co więcej może to mieć również wpływ na miano swoistych przeciwciał skierowanych przeciw poszczególnym białkom pasożyta w surowicy. Ponadto, można przypuszczać, iż poszczególne gatunki zwierząt mogą być mniej lub bardziej podatne na zarażenie danym szczepem T. gondii.

Analizując wyniki uzyskane dla mieszanek w porównaniu do antygenów chimerycznych złożonych z większych fragmentów immunodominujących można zauważyć pewne prawidłowości wskazujące na wymienione wcześniej zalety stosowania antygenów chimerycznych do serodiagnostyki toksoplazmozy. Po pierwsze mieszanki antygenów na ogół charakteryzowały się znacznie niższą reaktywnością, co sugeruje, iż opłaszczenie płytki mieszaniną trzech białek rekombinantowych powoduje zawadę sferyczną pomiędzy białkami, na skutek której dochodzi do zasłonięcia ważnych determinant antygenowych, a tym samym utrudnia to możliwość ich rozpoznania przez swoiste przeciwciała antytoksoplazmowe. Drugą zaobserwowaną prawidłowością jest fakt, iż dla mieszanek wyznaczono wyższe wartości współczynników odcięcia. Należy pamiętać, iż w niniejszej pracy mieszanki powstały ze zmieszania trzech białek rekombinantowych, z których każde było oczyszczane osobno, a więc ilość pozostałych białek E. coli, która była mikroorganizmem producenckim, będzie w mieszankach wypadkową białek bakteryjnych obecnych w poszczególnych trzech preparatach, a nie tak jak w przypadku antygenu chimerycznego jednego. W związku z powyższym możliwe, iż przeciwciała anty-E.

coli, które mogą być obecne w surowicach rozpoznały znajdujące się w śladowych ilościach białka bakteryjne, co spowodowało dodatkowe niespecyficzne oddziaływania.

Uzyskane rezultaty potwierdzają zatem, iż zastosowanie antygenów chimerycznych może ułatwić standaryzację testów diagnostycznych dzięki temu, że stosuje się jeden ściśle zdefiniowany preparat.

Niniejsza praca przedstawia potencjalną użyteczność antygenów chimerycznych do serodiagnostyki toksoplazmozy u różnych grup zwierząt. Należy jednak pamiętać, iż

140 inne pasożyty z typu Apicomplexa są bardzo zbliżone antygenowo i do pełnej oceny potencjału diagnostycznego uzyskanych antygenów chimerycznych trzeba wykonać dodatkowe badania na surowicach pochodzących od zwierząt zarażonych tymi pasożytami, w szczególności dotyczy to gatunków Neospora spp. i Sarcocystis spp. Jak pokazują rezultaty uzyskane w niniejszej pracy problem reakcji krzyżowych może być szczególnie istotny u koni, które są zdecydowanie bardziej podatne na zarażenie N. caninum oraz N. hughesi, niż na zarażenie T. gondii [Ciaramella i wsp., 2004; Pitel i wsp., 2003].

6.4. Właściwości immunoprotekcyjne wybranych antygnenów chimerycznych