Właściwości immunoprotekcyjne wybranych antygnenów chimerycznych

którą możnaby stosować zarówno u ludzi jak i zwierząt. Otrzymanie skutecznej szczepionki dla ludzi pozwoli na zmniejszenie śmiertelności oraz pozwoli na redukcję innych niekorzystnych efektów, do których manifestacji dochodzi po zarażeniu pasożytem. Uzyskanie szczepionki będzie miało także korzyści ekonomiczne, bowiem pozowoli na zredukowanie nakładów finansowych na opiekę medyczną kobiet w ciąży, czy pacjentów z nieprawidłowo funkcjonującym układem odpornościowym, u których nawet przewlekła faza choroby może stanowić zagrożenie dla życia. Z kolei szczepionka o zastosowaniu weterynaryjnym oprócz korzyści ekonomicznych będzie się ściśle wiązała ze zdrowiem publicznym, poprzez zminimalizowanie ryzyka odzwierzęcego zarażenia pasożytem poprzez spożywanie surowego lub niedogotowanego mięsa. Dlatego też w ostatnim etapie niniejszej pracy oceniono właściwości immunoprotekcyjne antygenów chimerycznych SAG1D-MIC1-MAG1 oraz SAG2-GRA1-ROP1D na modelu mysiej toksoplazmozy.

Wymienione powyżej antygeny chimeryczne wybrano na podstawie wyników badań immunoserologicznych, w których oceniano ich potencjalną użyteczność diagnostyczną w wykrywaniu swoistych przeciwciał antytoksoplazmowych w próbach surowic ludzkich i zwierzęcych, a także bazując na rezultatach wcześniejszych prac, w których wykazano potencjalne właściwości immunoprotekcyjne białek pasożyta (Tab. 6). Uzyskane rezultaty świadczą o tym, iż oba antygeny chimeryczne SAG1D -MIC1-MAG1 oraz SAG2-GRA1-ROP1D zdolne są do stumulacji układu odpornościowego myszy do produkcji swoistych produktów odpowiedzi immunologicznej, które rozpoznają natywne antygeny T. gondii. Preparaty szczepionkowe różnią się jednak właściwościami immunoprotekcyjnymi, antygen SAG1D-MIC1-MAG1 wywołuje tylko częściową ochronę przed przewlekłą toksoplazmozą, o czym świadczy redukcja liczby cyst o 44,8% (p=0,008). Potencjalne znaczenie szczepionkowe może mieć natomiast antygen SAG2-GRA1-ROP1_D, który pozwalał na redukcję liczby cyst w mózgowiu zarażonych myszy aż o 86,2% (p<0,001), w odniesieniu do grupy kontrolnej. Różnica w poziomie immunoprotekcji świadczy

141 o tym, iż zdecydowanie bardziej korzystnie jest immunizować myszy antygenami chimerycznymi złożonymi z dużych fragmentów immunodominujących, co ma również odzwierciedlenie we wcześniejszych wynikach wskazujących na użyteczność diagnostyczną tych antygenów chimerycznych. Niższą immunoprotekcję u myszy immunizowanych antygenem SAG1D-MIC1-MAG1 można wytłumaczyć faktem, iż w niniejszym preparacie znajdowały się stosunkowo niewielkie fragmenty immunodominujące dwóch białek, a mianowicie N-końcowy region białka MIC1 (MIC1ex2) oraz fragment antygenu macierzy cyst tkankowych MAG1 od reszty aminokwasowej 30 do 202, a tylko fragment antygenu SAG1 odpowiadał prawie całemu antygenowi pasożyta. O ile wybrane fragmenty białek MIC1 oraz MAG1 mają wysoki potencjał diagnostyczny, tak ich potencjalne właściwości immunoprotekcyjne mogą być stosunkowo niewielkie. Świadczyć o tym mogą wyniki badań, w których myszy szczepu Swiss-webster immunizowano rekombinantowym antygenem MAG1 odpowiadającym całemu białku pasożyta (reszty aminokwasowe od 26-452), co po zarażeniu cystami T. gondii szczepu ME49 pozowoliło na 65,1% redukcję liczby cyst pasożyta w mózgach [Parmley i wsp., 2012]. Wysoki 68,3% poziom immunoprotekcji uzyskano również u myszy szczepu C57BL/6 immunizowanych preparatem natywnych antygenów TgMIC1+TgMIC4, które również zarażono szczepem ME49 T. gondii [Lourenco i wsp., 2006]. Zróznicowane wyniki w poziomie immunoprotekcji uzyskano dla natywnego antygenu SAG1 i różnych form rekombinantowych białka SAG1, co zależało od szczepu myszy użytego w badaniach, wielkości fragmentu białka rekombinantowego, zastosowanego adjuwantu, szczepu i formy rozwojowej pasożyta, drogi podania szczepionki oraz zarażenia (Tab. 6). Możliwe, iż na skutek immunizacji myszy antygenem SAG1D-MIC1-MAG1, dochodzi głównie do produkcji swoistych przeciwciał skierowanych przeciw białku SAG1, a miano przeciwciał anty-MIC1 oraz anty-MAG1 stanowi tylko niewielki odsetek w całej puli przeciwciał zawartych w surowicach.

We wcześniejszych badaniach nad potencjalnymi właściwościami immunoprotekcyjnymi antygenów chimerycznych tylko w jednej pracy określano zdolność do redukcji liczby cyst w mózgowiu immunizowanych myszy, a więc pod kątem ochrony przed przewlekłą fazą choroby. W 2008 roku, Jongert i wsp. zastosowali do immunizacji myszy szczepu Swiss F1 rekombinantowy antygen chimeryczny rEC2 (złożony z fragmentów immunodominujących białek MIC2157-235, MIC3234-307, SAG1 182-312), odpowiednio w połączeniu z białkiem rGRA7 oraz z DNA plazmidu kodującego antygen GRA7. Po przeprowadzeniu dwóch niezależnych eksperymentów stwierdzono, iż po zarażeniu myszy cystami szczepu 76K pasożyta, zdecydowana redukcja liczby cyst w mózgach na poziomie od 60-79% występuje u myszy immunizowanych rEC2+rGRA7, w porównianiu do 24-28% redukcji u myszy immunizowanych rEC2+pGRA7. Pozostałe badania, w których wykorzystano antygeny chimeryczne

142 dotyczyły oceny potencjalnych właściwości ochronnych przed ostrą toksoplazmozą.

W kilku wcześniejszych pracach wykazano, iż immunizacja myszy szczepu BALB/c antygenem SAG1/2 wpływa znacząco na ich zdolność do przeżycia po zarażeniu tachyzoitami T. gondii szczepu RH. Przeżywalność myszy wynosiła odpowiednio 73%

po immunizacji bakteryjnym antygenem SAG1/2+Vet L-10 [Yang i wsp., 2004] oraz 77% po immunizacji drożdżowym antygenem SAG1/2+PBS [Lau i wsp., 2011].

Największe różnice w przeżywalności myszy po immunizacji bakteryjnym SAG1/2 wykazali w 2013 roku Chuang i wsp., wszystkie myszy immunizowane antygenem SAG1/2+PBS padły przed 14 dniem od momentu zarażenia, niską przeżywalność na poziomie 25% odnotowano dla myszy immunizowanych SAG1/2+Vet L-10, najwyższą 83% przeżywalność zaobserwowano dla myszy immunizowanych mikrokapsułkami PLG-SAG1/2. Kolejne opisane w literaturze antygeny chimeryczne pozwalały na wydłużenie czasu przeżywalności myszy o kilka dni w porównaniu do grupy kontrolnej, a były to drożdżowy antygen SAG1-GRA2 [Zhou i wsp., 2007] oraz multiepitopowy antygen zbudowany z epitopów SAG1_59-67, GRA1_176-186 oraz GRA4_231-245 [Wang i wsp., 2011]. Podobnie jak w przypadku diagnostyki toksoplazmozy również do badań szczepionkowych zastosowano mieszanki antygenów rekombinantowych, które charakteryzują się silnymi właściwościami immunoprotekcyjnymi i mogą w znaczący sposób zapobiegać powstawaniu cyst w mózgach. Jedną z pierwszych mieszanek charakteryzującą się 48,2% zdolnością do redukcji cyst w mózgach myszy szczepu CBA/J była mieszanka białek rekombinantowych rGRA2+rGRA6+MPL, jednakże przeprowadzone badania pokazały, iż korzystniej jest immunizować myszy samym antygenem rGRA2+MPL, co pozwalało na redukcję liczby cyst w mózgach, aż o 69,8%

[Golkar i wsp., 2007]. Jeszcze wyższy poziom immunoprotekcji zademonstrowali w swojej pracy w 2008 roku, Gatkowska i wsp. Z przeprowadzonych przez nich badań wynikało, iż szczepiąc myszy szczepu C3H/HeJ mieszanką trzech rekombinantowych białek rSAG1+rGRA1+rMAG1 można zredukować liczbę cyst w mózgach o 89%.

Najbardziej kompleksowe badania dotyczące możliwości zastosowania mieszanek białek rekombinantowych jako podjednostkowych szczepionek antytoksoplazmozowych zaprezentowane zostały w dwóch pracach z roku 2011 i 2012 opublikowanych przez Dziadek i wsp. Do swoich badań zespół wykorzystał trzy różne szczepy myszy C3H/HeJ, C57BL/6 oraz BALB/c, które immunizowano mieszankami złożonymi z trzech białek rROP2+rGRA4+rSAG1, rROP2+rROP4+rGRA4 oraz rROP2+rROP4+rSAG1. Na podstawie uzyskanych wyników można stwierdzić, iż największy potencjał immunoprotekcyjny miała mieszanka rROP2+rROP4+rSAG1, która pozwalała na redukcję liczby cyst w mózgach o 71%, 90% i 77% w przypadku odpowiednio szczepu myszy C3H/HeJ, C57BL/6 oraz BALB/c. Mieszanka rROP2+rROP4+rGRA4 wykazywała niższą immunoprotekcję na poziomie 59%

(C3H/HeJ), 41% (C57BL/6) i 84% (BALB/c). Najniższe właściwości

143 immunoprotekcyjne posiadała mieszanka rROP2+rGRA4+rSAG1, która w zależności od szczepu immunizowanych myszy pozwalała na redukcję liczby cyst od 16-55%.

Podsumowując należy podkreślić, iż wyniki uzyskane w niniejszej pracy są bardzo obiecujące i pozwalają sądzić, że w niedalekiej przyszłości uda się opracować szczepionkę antytoksoplazmozową. Przeprowadzone do tej pory badania pokazują, iż stosowanie do immunizacji mieszanek białek pasożyta oraz antygenów chimerycznych pozwala uzyskać wyższy poziom immunoprotekcji, aniżeli w przypadku stosowania pojedynczych białek. Wykazane dla antygenu SAG2-GRA1-ROP1D właściwości immunoprotekcyjne są bardzo satysfakcjonujące, niemniej jednak, aby w pełni ocenić potencjał szczepionkowy tego antygenu konieczne jest przeprowadzenie dalszych badań. Można mieć nadzieję, iż konstruując antygen chimeryczny złożony z czterech fragmentów immunodominujących białek pasożyta uzyska się antygen, który w 100%

będzie zapobiegał powstawaniu cyst w mózgach zarażonych myszy. Z drugiej strony, może wystarczy zmienić jeden fragment immunodominujący w antygenie chimerycznym SAG2-GRA1-ROP1_D na inny, na przykład zamiast fragmentu białka GRA1 wprowadzić fragment immunodominujący antygenu GRA2, który charakteryzuje się silnymi właściwościami immunoprotekcyjnymi.

144