REAKCJA ŁA CUCHOWA POLIMERAZY

Metod pozwalaj c na specyficzne badanie sekwencji typu VNTR jest reakcja ła cuchowa polimerazy (PCR), która polega na syntezie in vitro du ych ilo ci specyficznych fragmentów DNA o okre lonej długo ci i sekwencji z małych ilo ci matrycowego DNA [147]. Reakcja PCR oparta jest na enzymatycznej amplifikacji fragmentów DNA ograniczonych z obu stron oligonukleotydowymi starterami, które hybrydyzuj z dwiema ni mi powielanego fragmentu. Starter, którego sekwencja stanowi cz nici koduj cej lub sekwencji pierwotnie opisanej w literaturze, zwyczajowo okre lany jest jako starter forward, za drugi ze starterów nosi nazw startera reverse.

Powtarzane cyklicznie etapy amplifikacji docelowej sekwencji daj w efekcie powielenie fragmentu ograniczonego przez ko ce 5’ starterów. Poniewa produkty wydłu ania ka dego ze starterów mog słu y jako matryca dla nast pnych starterów, ka dy cykl teoretycznie podwaja ilo fragmentów DNA wyprodukowanych w poprzednim cyklu, co prowadzi do wykładniczej akumulacji specyficznych produktów amplifikacji. Reakcja ła cuchowa polimerazy DNA z racji swej prostoty i mo liwo ci analizy bardzo niewielkich ilo ci nawet silnie zdegradowanego materiału genetycznego znalazła szerokie zastosowanie w praktyce medyczno-s dowej.

W skład mieszaniny reakcyjnej wchodzi matrycowy DNA, startery, trifosforany deoksynukleozydów (dNTP), jony magnezu i polimeraza DNA. Wprowadzenie termostabilnej polimerazy DNA do metody PCR (np. polimerazy Taq z termofilnej bakterii Thermus aquaticus) znacznie poprawiło efektywno metody [146] i pozwoliło na automatyzacj procesu w urz dzeniach zwanych termocyklerami.

Ka dy cykl amplifikacji rozpoczyna si od denaturacji cieplnej matrycowego DNA w temperaturze 92–96 ºC [87]. Podniesienie temperatury mieszaniny reakcyjnej do tej warto ci powoduje zerwanie wi za wodorowych pomi dzy komplementarnymi parami zasad i rozdzielenie nici DNA. W drugim etapie w temperaturze 37–72 ºC nast puje przył czanie (hybrydyzacja) starterów do komplementarnych sekwencji matrycowego DNA. Trzeci etap, przebiegaj cy w temperaturze 72 ºC, polega na katalizowanym przez polimeraz DNA wydłu aniu (elongacji) przył czonych starterów od ko ca 3’ przez sukcesywne doł czanie dNTP (ryc. 2.). Standardowo stosuje si 25–35 (do 40) cykli amplifikacji, po których zwykle przeprowadza si przez 5–15 min inkubacj w 72 ºC w celu doko czenia niekompletnych syntez i pełnej hybrydyzacji jednoniciowych komplementarnych produktów.

Ryc. 2. Schemat reakcji PCR. Ka dy cykl amplifikacji obejmuje denaturacj dwuniciowego DNA (1), przył czenie starterów (2) oraz ich wydłu anie przez polimeraz DNA (3), oznaczon na schemacie liter P. Po zako czeniu pierwszego cyklu (4) z jednej cz steczki DNA powstaj dwie, które stanowi matryc do amplifikacji w kolejnych cyklach, podwajaj c ilo DNA pod koniec ka dego cyklu.

Jedn z odmian klasycznej reakcji PCR jest kompleksowa reakcja PCR (multipleks), której przebieg inicjowany jest poprzez dodanie do mieszaniny reakcyjnej wi cej ni jednej pary starterów, co pozwala na jednoczesn amplifikacj dwóch lub wi kszej liczby fragmentów DNA [28]. Odk d po raz pierwszy opisano t metod [40], bardzo szybko znalazła ona zastosowanie w genetyce s dowej [112] i stała si jej wa nym narz dziem, oferuj c kilka istotnych udogodnie w porównaniu do standardowej amplifikacji [33]. Koszt analizy oraz nakład pracy potrzebny do uzyskania wyników z badania wielu markerów został znacznie zredukowany, podczas gdy ilo informacji genetycznej uzyskiwanej na jednostk czasu zdecydowanie wzrosła. Ponadto ilo matrycowego DNA niezb dnego do analizy wielu systemów jest o wiele mniejsza, za zmniejszenie manipulacji na badanym materiale genetycznym obni yła ryzyko kontaminacji [152].

1.2.1. ARTEFAKTY POWSTAJ CE W CZASIE REAKCJI PCR

Oprócz reakcji wydłu ania startera na jednoniciowej matrycy DNA polimeraza Taq katalizuje niezale ne od matrycy przył czanie do ko ca 3’ produktu amplifikacji pojedynczego nukleotydu (najcz ciej adenozyny) [42]. Przy metodach detekcji o rozdzielczo ci jednej pary zasad w przypadku niekompletnego zaj cia wspomnianej reakcji ten sam produkt mo e dawa podwójny sygnał. Niezale nemu od matrycy przył czaniu adenozyny przez polimeraz Taq sprzyja wydłu enie do 30–45 min ko cowego etapu inkubacji w 60–72 ºC, wy sze st enie jonów magnezu [6] oraz obecno dodatkowych nukleotydów na ko cu 5’ starterów [25, 92]. W celu ujednolicenia stopnia adenylacji badanych fragmentów DNA alternatywnie usuwa si przył czone niezale nie od matrycy nukleotydy z ko ców 3’ produktów amplifikacji poprzez ich inkubacj po reakcji PCR z polimeraz DNA bakteriofaga T4 [52].

Amplifikacja metod PCR loci mikrosatelitarnych mo e prowadzi do jednoczesnej syntezy artefaktów krótszych o wielokrotno jednostki repetytywnej, b d cych wynikiem lizgania si polimerazy DNA w trakcie amplifikacji. Okre la si je jako produkty typu stutter [6] lub (przy analizie metod elektroforezy elowej) jako cienie pr ków (ang. „shadow band”) [102]. Stosunek ilo ci tego typu artefaktów do prawidłowych alleli jest tym wy szy, im krótsza jest jednostka repetytywna mikrosatelity [13] i im wi cej jednakowych powtórze jednostki repetytywnej posiada dany allel [77, 85, 179].

W przypadku bardzo małych ilo ci DNA amplifikacja heterozygotycznych alleli loci autosomalnych lub markerów haploidalnych obejmuj cych kilka polimorficznych loci prowadzi mo e do przypadkowej dominacji jednego z alleli [116]. Przy niekorzystnym stosunku ilo ciowym powielanych fragmentów DNA niekiedy objawia si to mo e brakiem amplifikacji jednego z alleli. Zjawisko to okre lane jest jako wypadanie alleli (ang. „allelic drop-out”). W przypadku markerów minisatelitarnych o du ym zakresie wielko ci alleli, a tym samym potencjalnie du ych ró nicach mi dzy powielanymi fragmentami DNA, ródłem wypadania alleli mo e by równie preferencyjna amplifikacja krótszego allelu [154].

Brak amplifikacji jednego, rzadziej obu alleli markerów diploidalnych lub brak amplifikacji locus haploidalnego mo e by równie spowodowany wyst powaniem w populacji cichych alleli, znanych te jako nieme lub zerowe (ang. „silent allele / null allele”). Ich ródłem s zmiany nukleotydów w sekwencjach rozpoznawanych przez startery

u ywane w reakcji PCR b d delecje całego locus. W tym pierwszym przypadku stosowanie ró nych starterów mo e prowadzi do niezgodno ci w genotypach tej samej osoby [4, 26, 27].

Innym zjawiskiem obserwowanym w badaniach metod PCR jest amplifikacja dwóch i wi cej alleli w locus haploidalnym, wyst puj cym pojedynczo na chromosomie, lub wi cej ni dwóch alleli w locus diploidalnym [43]. Najcz ciej spowodowane jest ono duplikacj danego locus [14, 34], cho mo e równie wynika z niespecyficzno ci starterów, rozpoznaj cych poza wła ciwym locus równie inne miejsca genowe [34, 47].

Innym rodzajem artefaktów s produkty niespecyficzne, które powstaj w wyniku nieswoistego wi zania starterów podczas reakcji PCR lub oligomeryzacji starterów.

Powstawaniu tego typu artefaktów zapobiegaj odpowiednio zaprojektowane, specyficzne dla danego locus startery, które nie tworz dimerów i struktur drugorz dowych, oraz zoptymalizowane warunki reakcji ła cuchowej polimerazy, obejmuj ce zarówno profil temperaturowy, jak i st enia substratów i katalizatorów [33].