Wpływ cukrów na ekspresję genów zaangażowanych w naprawę DNA

wykonano pomiary poziomów ekspresji genów zaangażowanych w różne szlaki naprawy uszkodzeń DNA stosując PCR w czasie rzeczywistym. Wyniki przedstawiono na Rysunkach 15 – 18.

80 zebranych z pojedynczej szalki i było mierzone w 3 powtórzeniach technicznych.

Słupki błędów reprezentują błąd standardowy. Gwiazdkami oznaczono istotność statystyczną różnicy między poziomem ekspresji danego genu w roślinach z danego podłoża i podłoża kontrolnego B5Ø, sprawdzoną testem Tukeya: *, 0.05>P>0.01; **, 0.01>P>0.001; ***, 0.001>P.

81 Rysunek 16. Względna ekspresja genów kodujących białka zaangażowane w NER.

A) DDB1A, B) DDB1B,C) RAD1, D) RAD23A, E) UVH6. A. thaliana hodowano in vitro przez 5 dni na podłożu B5 z 1% sacharozą, następnie pasażowano na podłoża B5 z różną zawartością glukozy, sacharozy i mannitolu oraz podłoże kontrolne B5Ø. Słupki odpowiadają wartościom średnim uzyskanym w 4-6 niezależnych powtórzeń biologicznych. Każde z nich składało się z 25 siewek zebranych z pojedynczej szalki i było mierzone w 3 powtórzeniach technicznych. Słupki błędów reprezentują błąd standardowy. Gwiazdkami oznaczono istotność statystyczną różnicy między poziomem ekspresji danego genu w roślinach z danego podłoża i podłoża kontrolnego B5Ø, sprawdzoną testem Tukeya: *, 0.05>P>0.01; **, 0.01>P>0.001; ***, 0.001>P.

0

82 Rysunek 17. Względna ekspresja genów kodujących białka zaangażowane w HR:

A) BRCA1, B) RAD51; NHEJ: C) Ku70; MMR: D) MLH1, E) MSH7. A. thaliana hodowano in vitro przez 5 dni na podłożu B5 z 1% sacharozą, następnie pasażowano na podłoża B5 z różną zawartością glukozy, sacharozy i mannitolu oraz podłoże kontrolne B5Ø. Słupki odpowiadają wartościom średnim uzyskanym w 4-6 niezależnych powtórzeń biologicznych. Każde z nich składało się z 25 siewek zebranych z pojedynczej szalki i było mierzone w 3 powtórzeniach technicznych. Słupki błędów reprezentują błąd standardowy. Gwiazdkami oznaczono istotność statystyczną różnicy między poziomem ekspresji danego genu w roślinach z danego podłoża i podłoża kontrolnego B5Ø, sprawdzoną testem Tukeya: *, 0.05>P>0.01; **, 0.01>P>0.001; ***, 0.001>P.

83 Rysunek 18. Względna ekspresja genów A) GYRA, B) GYRB1,

C) PCNA1, D) PCNA2. A. thaliana hodowano in vitro przez 5 dni na podłożu B5 z 1% sacharozą, następnie pasażowano na podłoża B5 z różną zawartością glukozy, sacharozy i mannitolu oraz podłoże kontrolne B5Ø. Słupki odpowiadają wartościom średnim uzyskanym w 4-6 niezależnych powtórzeń biologicznych. Każde z nich składało się z 25 siewek zebranych z pojedynczej szalki i było mierzone w 3 powtórzeniach technicznych. Słupki błędów reprezentują błąd standardowy. Gwiazdkami oznaczono istotność statystyczną różnicy między poziomem ekspresji danego genu w roślinach z danego podłoża i podłoża kontrolnego B5Ø, sprawdzoną testem Tukeya: *, 0.05>P>0.01; **, 0.01>P>0.001; ***, 0.001>P.

Poziom transkryptu UVR3 jest niższy w roślinach rosnących na pożywkach zawierających sacharozę lub glukozę w porównaniu z roślinami z podłoży kontrolnych z mannitolem i z podłoża B5Ø. Różnica ta była istotna statystycznie dla roślin hodowanych na pożywce z 3% glukozy (Rysunek 15A). Poziom transkryptów genów APE1L i APE2, których produkty są endonukleazami AP uczestniczącymi w BER, nie różni się w badanych roślinach (Rysunek 15B,C). Zaobserwowano wzrost poziomu mRNA DDB1A na podłożach z dodatkiem 0,53% i 1% mannitolu oraz 1% i 3%

84 sacharozy (Rysunek 16A). Spośród genów zaangażowanych w NER, różnice poziomów transkryptów RAD1 i UVH6 między roślinami hodowanymi z dodatkiem cukru i mannitolu lub na pożywce kontrolnej bez dodatku cukrów i mannitolu nie wykazały istotnych statystycznie różnic (Rysunek 16C,E). Poziom transkryptu RAD23A był wyższy w roślinach na podłożach z 1 i 3% glukozy oraz z 3% sacharozy (Rysunek 16D) w porównaniu z roślinami z podłoża B5Ø. Zaobserwowano również istotną statystycznie różnicę między poziomem transkryptu RAD23A w roślinach rosnących na podłożu GLC3 i odpowiadającym mu osmotycznie podłożu MAN3 (Rysunek 16D).

Poziom transkryptu RAD51, genu zaangażowanego w rekombinację homologiczną, był wyższy w roślinach hodowanych na podłożach zarówno z 1 jak i 3% sacharozy oraz glukozy w porównaniu z podłożem kontrolnym. Różnica poziomu mRNA tego genu była statystycznie istotna dla próbek z wyższego stężenia glukozy w porównaniu z odpowiadającym mu stężeniem mannitolu oraz z podłożem kontrolnym (Rysunek 17B). Prawdopodobieństwo, że różnica między poziomami transkryptu RAD51 w roślinach z podłoży SUC3 i MAN1,6 jest statystycznie istotna wyniosło pomiędzy 0,1 a 0,05 w teście Tukeya, a więc nieznacznie poniżej przyjętego poziomu istotności 0,05. Spośród zbadanych genów uczestniczących w MMR, poziom transkryptu MLH1 nie wykazał istotnych statystycznie różnic pomiędzy badanymi grupami roślin, natomiast poziom mRNA MSH7 był wyższy w roślinach rosnących na obu stężeniach glukozy oraz na 3% sacharozie (Rysunek 17D,E). Wyższy poziom transkryptu GYRA w roślinach z podłoża GLC3 w porównaniu z B5Ø był istotny statystycznie (Rysunek 18A). Nie zaobserwowano istotnych statystycznie różnic pomiędzy poziomami transkryptów w roślinach z różnych podłoży, w przypadku genów DDB1B (Rysunek 16B), BRCA1 (Rysunek 17A), KU70 (Rysunek 17C) i GYRB1 (Rysunek 18B).

Najwięcej różnic stwierdzono dla genów PCNA Arabidopsis (Rysunek 18C,D).

W przypadku PCNA2 statystycznie istotna była różnica poziomu mRNA w roślinach rosnących na pożywkach z 3% sacharozą i glukozą w porównaniu z roślinami z pożywki kontrolnej, a dla rosnących na podłożu z 3% sacharozą także w porównaniu z roślinami z jej osmotycznego odpowiednika (MAN1,6) (Rysunek 18D).

Zaobserwowano również wyższy poziom transkryptu PCNA1 w roślinach hodowanych na podłożach z oboma stężeniami sacharozy i glukozy, a różnice między roślinami z izoosmotycznych par SUC3 i MAN1,6 oraz GLC1 i MAN1 były istotne statystycznie (Rysunek 18C).

85 4.7. Wpływ cukrów dodanych do pożywki na powstawanie uszkodzeń DNA wywoływanych UV

Rośliny hodowane in vitro na kontrolnym podłożu B5 oraz podłożach z dodatkiem glukozy, sacharozy i mannitolu naświetlono UV (2,5 kJ·m^-2), po czym natychmiast zebrano. Przeprowadzono test ELISA na wyizolowanym z roślin całkowitym DNA.

Porównywano średnie wyniki uzyskane w pomiarze absorbancji przy 450 nm, po zatrzymaniu reakcji enzymatycznej przez dodanie kwasu siarkowego. Wyniki przedstawiono na Rysunku 19.

Rysunek 19. Względny poziom A) CPD i B) 6-4 PP w DNA A. thaliana hodowanych in vitro na podłożu B5 z różnymi stężeniami glukozy, sacharozy i mannitolu oraz podłożu kontrolnym, naświetlonych dawką UV równą 2,5 kJ·m^-2. Wartości reprezentują średnie z 3-5 niezależnych powtórzeń biologicznych, normalizowanych względem średniej wartości uzyskanej dla standardu na każdej płytce.

Słupki błędów odpowiadają odchyleniom standardowym. Gwiazdkami oznaczono istotność statystyczną różnicy między poziomem CPD lub 6-4 PP w roślinach z danego podłoża i podłoża kontrolnego B5Ø albo dla pary podłoży z różnym stężeniem glukozy (zaznaczono klamrą), sprawdzoną testem Tukeya: *, 0.05>P>0.01; **, 0.01>P>0.001; ***, 0.001>P.

Stwierdzono spadek indukowanych UV poziomów CPD oraz 6-4 PP ze wzrostem stężenia zarówno glukozy, sacharozy jak i mannitolu. Poziom CPD w porównaniu ze zmierzonym dla roślin z podłoża B5Ø był o mniej niż 10% niższy dla roślin z podłoży SUC1, MAN0,53, GLC1, MAN1 i MAN1,6, o ok. 15% niższy dla roślin z podłoża SUC3 i ok. 25% niższy dla roślin hodowanych na GLC3 i MAN3 (Rysunek 19A).

Poziom 6-4 PP w DNA roślin hodowanych na SUC1 i MAN0,53 był podobny do zmierzonego dla roślin z podłoża kontrolnego B5Ø, a dla roślin hodowanych na GLC1 i MAN1 o odpowiednio 5 i 10% niższy (Rysunek 19B). W DNA roślin hodowanych na MAN1,6 było o ok. 15% mniej 6-4 PP, a w DNA roślin hodowanych na SUC3 i GLC3

86 – ok. 25% mniej 6-4 PP w porównaniu z kontrolą (Rysunek 19B). Najniższy poziom 6-4 PP stwierdzono w DNA roślin z podłoża MAN3, wynosił on nieco ponad 60%

poziomu zmierzonego dla kontroli B5Ø (Rysunek 19B). Różnice w porównaniu z wartościami zmierzonymi dla podłoża B5Ø były istotnie statystyczne w przypadku CPD dla 3% sacharozy, glukozy i mannitolu (Rysunek 19A) oraz w przypadku 6-4 PP dla podłoży z 3% glukozy i mannitolu (Rysunek 19B). Nie zaobserwowano statystycznie istotnych różnic w poziomie dimerów pirymidynowych między izoosmotycznymi parami podłoży cukier – mannitol.

4.8. Wpływ cukrów w pożywkach na naprawę uszkodzeń DNA

Rośliny hodowane in vitro na kontrolnej pożywce B5 oraz na pożywkach z dodatkiem 1 i 3% glukozy lub sacharozy lub odpowiadającymi im osmotycznie stężeniami mannitolu naświetlono dawką UV równą 2,5 kJ·m^-2. Część roślin zebrano, a pozostałe umieszczono w monochromatycznym świetle niebieskim o długości fali 470 nm i natężeniu 100 µmol·m^-2·s^-1, lub w ciemności na 4 godziny. Po upływie tego czasu zebrano próbki, które posłużyły do analizy poziomu CPD i 6-4 PP w całkowitym DNA metodą ELISA. Uzyskane wyniki porównano z wyjściowym poziomem uszkodzeń zmierzonym w próbkach zebranych natychmiast po naświetleniu UV. Wyniki przedstawiono na Rysunku 20.

87 Rysunek 20. Względny poziom dimerów pirymidynowych w DNA

roślin hodowanych in vitro na podłożu B5 z różnymi stężeniami glukozy, sacharozy i mannitolu po naświetleniu UV (2,5 kJ·m^-2) i 4 godzinach naprawy w ciemności lub świetle niebieskim (100 µmol·m^-2·s^-1, 470 nm). A) CPD po naprawie w ciemności; B) CPD po naprawie w świetle niebieskim; 6-4 PP po naprawie w ciemności;

D) 6-4 PP po naprawie w świetle niebieskim. Wartości reprezentują średnią proporcję między wynikiem uzyskanym w teście immunoenzymatycznym dla roślin po 4-godzinnej inkubacji w ciemności lub w niebieskim świetle (100 µmol·m^-2·s^-1, 470 nm) i roślin zebranych bezpośrednio po naświetleniu UV. Każdy słupek odpowiada średniej z 6 niezależnych powtórzeń biologicznych, z których na każde zebrano po 25 siewek z pojedynczej szalki hodowlanej. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe.

Gwiazdki oznaczają sprawdzoną testem Tukeya istotność statystyczną różnicy między poziomem CPD lub 6-4 PP w roślinach z danego podłoża i podłoża kontrolnego B5Ø albo dla izoosmotycznych par podłoży cukier/mannitol (zaznaczono klamrą): *, 0.05>P>0.01; **, 0.01>P>0.001; ***, 0.001>P.

Wszystkie rośliny inkubowane na świetle niebieskim po naświetleniu UV miały znacznie obniżony poziom obu typów uszkodzeń w porównaniu ze zmierzonym zaraz po naświetleniu. Poziom CPD spadł w tym czasie o ok. 20-30% (Rysunek 20B),

88 a poziom 6-4 PP o ok. 60-70% (Rysunek 20D). Dla próbek inkubowanych w ciemności różnica pomiędzy poziomem uszkodzeń w porównaniu z poziomem mierzonym od razu po naświetleniu była mniejsza, pozostało od 80 do 100% nienaprawionych dimerów obu typów (Rysunek 20A,C). W DNA roślin, które po naświetleniu UV były inkubowane na świetle, nie zaobserwowano statystycznie istotnych różnic między poziomami uszkodzeń w roślinach rosnących na różnych podłożach. Z kolei rośliny hodowane na podłożach SUC3 i GLC3, które po naświetleniu UV były inkubowane w ciemności, miały niższy poziom obu typów uszkodzeń niż te hodowane na odpowiadających im osmotycznie podłożach z mannitolem: MAN1,6 i MAN3 (Rysunek 20A,C).

4.9. Wpływ ruchów organelli na poziom uszkodzeń DNA wywołanych przez UV Aby określić czy sterowane światłem niebieskim ruchy chloroplastów i jądra komórkowego mają wpływ na ochronę materiału genetycznego przed UV, wykonano serię eksperymentów, w których liście roślin poddawano naświetlaniu silnym lub słabym światłem niebieskim, aby uzyskać pożądane ustawienie organelli (patrz:

Rysunek 3), a następnie naświetlano dawką UV równą 2,5 kJ·m^-2. Analizowano poziom dimerów pirymidynowych w DNA izolowanym osobno z chloroplastów i jąder komórkowych. Wyniki dla DNA jądrowego przedstawiono na Rysunku 21A i 21B, a dla DNA chloroplastowego na Rysunku 21C i 21D.

89 Rysunek 21. Względny poziom w DNA jądrowym: A) CPD;

B) 6-4 PP i w DNA chloroplastowym: C) CPD; D) 6-4 PP. DNA izolowano z odpowiednich frakcji liści A. thaliana dzikiego typu i mutantów genów zaangażowanych w kierunkowe ruchy organelli. Adaptowane do ciemności liście pobrane z 5–6-tygodniowych roślin były naświetlane przez 4 godziny monochromatycznym światłem niebieskim (470 nm) o natężeniu 1,5μmol·m^-2·s^-1 (słabe światło, WB) lub 120 μmol·m^-2·s^-1 (silne światło, SB), a następnie 2,5 kJ·m^-2 UV.

Każdy słupek reprezentuje średnią z 5 niezależnych powtórzeń biologicznych. Słupki błędów odpowiadają odchyleniom standardowym średnich.

W przeprowadzonych eksperymentach nie zaobserwowano żadnych statystycznie istotnych różnic w poziomach dimerów pirymidynowych pomiędzy DNA (zarówno chloroplastowym jak i jądrowym) izolowanym z roślin naświetlanych silnym lub słabym światłem niebieskim przed ekspozycją na UV. Nie zaobserwowano również różnic między dzikim typem oraz poszczególnymi liniami mutantów z zaburzonymi ruchami organelli.

90 5. Dyskusja

5.1. Cukry w podłożu wspomagają przeżywanie roślin narażonych na UV

Jednym z głównych celów pracy było zbadanie wpływu egzogennych cukrów na ochronę roślin przed promieniowaniem UV. Został on zrealizowany dzięki zastosowaniu hodowli in vitro, która która umożliwiła podawanie kontrolowanej ilości cukrów w podłożu. Ponieważ znane jest hamujące działanie glukozy na kiełkowanie Arabidopsis (Dekkers et al., 2004), zdecydowano się zastosować do kiełkowania wszystkich roślin jednakowe podłoże B5 z 1% sacharozą. Rośliny hodowano na podłożu z sacharozą przez 5 dni, żeby uzyskać ich równy wzrost. Po tym czasie przenoszono je w warunkach jałowych na nowe podłoże B5 z 1 lub 3% sacharozy albo glukozy, następnie hodowano przez 7 dni i poddawano działaniu UV o natężeniu 8 W·m^-2 przez 1 godzinę, co odpowiada dawce około 28 kJ·m^-2. Zaobserwowano, że rośliny hodowane na podłożu z cukrami mają zwiększoną odporność na naświetlanie UV (Rysunek 4; 5; 6A). Rośliny z podłoża bez cukru mają zupełnie wybielone liścienie i liście, a większość z nich jest martwa. Rośliny hodowane z dodatkiem sacharozy lub glukozy zachowują w większości zielone liście, przy czym zielonych roślin jest więcej na 3% stężeniach cukrów oraz więcej na podłożu z glukozą niż z sacharozą (Rysunek 4; 5).

5.1.1. Cukry i mannitol w podłożu obniżają akumulację uszkodzeń DNA Poziom obu mierzonych typów uszkodzeń DNA, czyli CPD i 6-4 PP, był niższy w roślinach hodowanych na podłożu z 3% glukozy i mannitolu (Rysunek 19). Poziom CPD w roślinach hodowanych na SUC3 był również obniżony w porównaniu z kontrolą (Rysunek 19A). Prawdopodobnie niższy poziom uszkodzeń zmierzony w DNA roślin hodowanych na podłożu z cukrami jest spowodowany podwyższonym poziomem związków absorbujących UV, szczególnie jabłczanu sinapoilu oraz glikozydów kemferolu (Rysunek 14). Ponieważ nie zmierzono poziomu związków fenolowych w roślinach hodowanych na podłożach z mannitolem, nie można stwierdzić, czy też mogły być lepiej chronione przed UV poprzez jego pochłanianie. Z pewnością w tych roślinach wpływ na niski zmierzony poziom dimerów w DNA mogła mieć inna morfologia roślin, w szczególności drobne i pozwijane liście (Rysunek 4G,H; 5G,H), które otrzymują w rezultacie niższą dawkę UV.

91 5.1.2. Wpływ cukrów w podłożu na poziom barwników fotosyntetycznych Analiza poziomów barwników fotosynetycznych wykazała wzrost zawartości chlorofili a i b na podłożach z 3% sacharozą i na podłożach z 3% glukozą (Rysunek 9E,F).

Również średnie poziomy karotenoidów: β-karotenu, luteiny, wiolaksantyny i neoksantyny były podwyższone w tych roślinach w porównaniu z kontrolą rosnącą bez cukrów (Rysunek 9A,B,C,D). Wzrost poziomów tych związków był skorelowany ze wzrostem poziomu chlorofili. Przy przeliczeniu ich zawartości na zawartość chlorofilu (wyrażoną w molach) powyższe różnice zanikają. Jedyną istotną statystycznie różnicą był obniżony poziom wiolaksantyny w roślinach hodowanych na podłożu GLC3 w porównaniu z roślinami z podłoża kontrolnego (Rysunek 10D). Pozytywny wpływ cukrów na aparat fotosyntetyczny, mierzony m.in. jako wpływ na wydajność transportu elektronów (ETR, electron transport rate), maksymalną wydajność kwantowa PSII czy wydajność fotochemiczną PSII był już opisany (Tichá et al., 1998; Kadleček et al., 2003; Eckstein et al., 2012). Inni badacze zwracali też uwagę na przeciwny efekt – wywołane egzogennymi cukrami osłabienie fotosyntezy u hodowanych in vitro skrzydłokwiatów - Spathiphyllum (Van Huylenbroeck & Debergh, 1996) oraz goryczki – Gentiana kurroo (Rybczyński et al., 2007). W naszych warunkach 3% stężenia cukrów podawane w pożywce wpływały na wzrost zawartości barwników fotosyntetycznych bez istotnych zmian w ich wzajemnych proporcjach (Rysunek 9).

Wzrost poziomu chlorofili, z zachowaniem niezmienionego stosunku ilości chlorofilu a do chlorofilu b, zaobserwowano również u N. tabacum hodowanych na podłożu z sacharozą (Kadleček et al., 2003). Podobnie, nie zaobserwowano znaczących różnic w proporcjach pomiędzy karotenoidami w tych samych warunkach (Tichá et al., 1998), ani w stosunku ilości karotenoidów do chlorofili (Kadleček et al., 2003). Lepsza kondycja roślin mogła niespecyficznie wpływać na ich odporność na czynniki stresowe, w tym promieniowanie UV, na przykład poprzez resyntezę uszkodzonych białek czy szybszą naprawę uszkodzeń DNA, która została zbadana dla dimerów pirymidynowych i jest omówiona w dalszej części Dyskusji.

5.1.3. Wpływ cukrów w podłożu na produkcję chloroplastowych przeciwutleniaczy

Interesujących wyników dostarczyła analiza poziomów tokoferoli, plastochromanolu-8 i plastochinonu-9. W roślinach hodowanych na podłożu z 3% glukozą poziom

92 wszystkich tych związków był obniżony w porównaniu do kontroli bez cukru. Średnia zawartość γ-tokoferolu była aż ponad 14-krotnie niższa, α-tokoferolu prawie 3-krotnie niższa, a PC-8 i PQ-9 ok. 2-krotnie niższa (Rysunek 12). Średni poziom γ-tokoferolu był obniżony również w roślinach hodowanych na podłożu SUC1 i SUC3, odpowiednio ok. 5 i 12-krotnie w porównaniu z kontrolą (Rysunek 12B). Poziom PC-8 w roślinach z podłoża SUC3 był o około połowę niższy (Rysunek 12C). Te cztery związki uczestniczą w ochronie antyoksydacyjnej roślin, przede wszystkim chronią przez peroksydacją lipidów błonowych w chloroplastach i zmiatają ROS powstające w PSI i PSII. Ich zmniejszona ilość w roślinach hodowanych na podłożu z dodatkiem glukozy albo sacharozy jest zaskakująca, ponieważ przy zwiększonej zawartości chlorofili (Rysunek 9E,F) można spodziewać się zwiększonej produkcji ROS. Wpływ cukrów na poziomy tokochromanoli nie był dotychczas badany. Wzrost zawartości tokoferoli jest obserwowany w różnych warunkach stresowych, takich jak silne światło (Havaux et al., 2000; Szymańska & Kruk, 2010), promieniowanie UV czy niedobór wody (Munné-Bosch & Alegre, 2002). Silne światło powoduje też podwyższenie poziomu plastochinonu-9, ale nie plastochromanolu-8 (Szymańska & Kruk, 2010). Zarówno ilość tokoferoli jak i PC-8 oraz PQ-9 rośnie podczas starzenia się Arabidopsis hodowanych w umiarkowanym świetle (Szymańska & Kruk, 2010).

5.1.4. Wpływ cukrów w podłożu na zawartość związków polifenolowych Pomiar zawartości związków polifenolowych za pomocą HPLC wykazał obecność kilku silnie absorbujących w zakresie UV związków. Poziom czterech spośród nich był podwyższony w roślinach rosnących na podłożu z 3% glukozą, a jednego – także na podłożu z 3% sacharozą (Rysunek 14). Na podstawie analizy wyników spektrometrii masowej stwierdzono, że wśród związków polifenolowych najwięcej było glikozydów kemferolu: 3-O-[ramnozylo(1→2-glukozydu]-7-O-ramnozydu; 3,7-diramnozydu i 3-glukozydu-7-ramnozydu, poza tym stwierdzono obecność 3-glukozydu-7-ramnozydu kwercetyny i jabłczanu sinapoilu.

Znany jest wpływ sacharozy na produkcję antocyjanów, wykazano też, że ten cukier wywołuje bardzo silną indukcję wielu genów ze szlaku ich biosyntezy, w tym genów kodujących białka wspólne dla szlaku syntezy flawonoli i antocyjanów, jak syntaza chalkonowa (CHS) czy izomeraza chalkonowa (CHI), a także genów specyficznych dla szlaku syntezy antocyjanów, np. genu DFR kodującego reduktazę dihydroflawonoli

93 (DIHYDROFLAVONOL REDUCTASE) (Solfanelli et al., 2006). Autorzy pracy wykazali, że również glukoza może indukować ekspresję niektórych z tych genów, ale nie DFR, którego produkt jest pierwszym enzymem oddzielającym szlaki syntezy antocyjanów i flawonoli. Być może jest to wytłumaczenie znacznie wyższych poziomów flawonoidów zmierzonych w ekstraktach z roślin hodowanych na podłożu z glukozą niż z sacharozą (Rysunek 14A,D). Przy niższym poziomie DFR, dihydrokemferol i dihydrokwercetyna, mogły być preferencyjnie przekształcane w odpowiednio: kemferol i kwercetynę przez syntazę flawonoli, FLS (FLAVONOL SYNTHASE).

3-krotnie wyższa zawartość triglukozydu kemferolu w porównaniu z kontrolnymi roślinami, 2-krotnie wyższa zawartość jabłczanu sinapoilu oraz aż 7-krotnie wyższa zawartość diramnozydu kemferolu w roślinach rosnących na GLC3, podobnie jak 1,5-krotnie wyższa zawartość jabłczanu sinapoilu w roślinach rosnących na podłożu SUC3 (Rysunek 14) może odpowiadać za zmniejszenie ilości UV docierającego w głąb tkanek liścia. W roślinach rosnących na podłożu z 1 i 3% glukozą zawartość jedynego stwierdzonego glikozydu kwercetyny jest nieznacznie niższa niż w kontroli (Rysunek 14B). Stosunek zawartości kwercetyny do kemferolu wzrasta w silnym świetle, a także pod wpływem UV-B w wielu zbadanych roślinach, w tym Arabidopsis (Ryan et al., 2001). Zwracano uwagę, że może to być wynikiem silniejszego działania przeciwutleniaczowego flawonoidów z większą ilością grup hydroksylowych (Agati et al., 2012). Na przykład aktywność przeciwutleniaczowa mierzona jako stężenie związku konieczne do zmniejszenia ilości wolnego rodnika o połowę jest o ponad rząd wielkości większa dla 3-O-glukozydu kwercetyny niż dla 3-O-glukozydu kemferolu (Agati et al., 2012). W naszym doświadczeniu zaobserwowano wzrost ilości związków fenolowych, który prawdopodobnie powodował zwiększenie pochłaniania promieniowania w zakresie UV. Wydaje się, że z kolei ochrona antyoksydacyjna jest słabsza w przypadku roślin hodowanych na podłożach z sacharozą i glukozą niż na podłożu kontrolnym (Rysunek 12). Być może równowaga w powstawaniu i pochłanianiu ROS jest utrzymana np. przez enzymatyczne przeciwutleniacze. Niskie poziomy tokochromanoli oraz glikozydów kwercetyny mogą jednak oznaczać, że nagły wzrost produkcji wolnych rodników może spowodować silniejszy stres oksydacyjny niż w przypadku roślin rosnących na podłożu bez cukrów.

94 5.2. UV indukuje kwitnienie w roślinach rosnacych na podłożu z sacharozą Zaobserwowano również pojawienie się pędów kwiatowych u roślin hodowanych na podłożu z sacharozą naświetlonych UV (Rysunek 6B). Dotychczas opisano indukcję kwitnienia pod wpływem UV, prawdopodobnie będącą wynikiem stresu (Martínez et al., 2003; Llorens et al., 2015), ale również zależną od UVR8 (Arongaus et al., 2018).

Znany jest też wpływ sacharozy na kwitnienie Arabidopsis m.in. przez indukcję genów takich jak LFY (Eriksson et al., 2006; Matsoukas et al., 2012). Działanie sacharozy w regulacji kwitnienia jest jednak silnie zależne od jej stężenia oraz wielu innych czynników. Wykazano, że rośliny na podłożu z 5% sacharozą kwitną o 8 dni później w porównaniu z hodowanymi na 1% i 2% sacharozie (Ohto et al., 2001). W warunkach zastosowanych w naszym doświadczeniu wpływ samego UV albo samej sacharozy nie był istotny statystycznie, natomiast zaobserwowano synergistyczne działanie obu tych czynników.

5.2.1. Rola UVR8 w regulacji kwitnienia

Aby określić czy wpływ UV w połączeniu z sacharozą na przyspieszone kwitnienie Arabidopsis może być zależny od receptora UV-B, kodowanego przez UVR8,

Aby określić czy wpływ UV w połączeniu z sacharozą na przyspieszone kwitnienie Arabidopsis może być zależny od receptora UV-B, kodowanego przez UVR8,