Roślin
LV Zjazd PTB, Warszawa 2010
76
KULTURY IN VITRO GATUNKÓW RODZINY
PLANTA-GINACEAE
Andrzejewska-Golec Emilia, Makowczyńska Joanna.
Uni-wersytet Medyczny, Katedra Biologii i Botaniki Farmaceutycz-nej, Zakład Biologii i Botaniki FarmaceutyczFarmaceutycz-nej, ul. Muszyń-skiego 1, 90-151 Łódź, emilia.andrzejewska@gmail.com Do tej pory opisano kultury in vitro niewielu spośród znanych około 260 gatunków babkowatych (Plantaginaceae). Zajmowa-no się głównie roślinami leczniczymi tego taksonu. Obiektem badań były nieznane u nas dalekowschodnie rośliny lecznicze: babka azjatycka (Plantago asiatica L.) i babka kamczacka (P. camtschatica Link) oraz bardzo rzadkie w Polsce, podlega-jące ochronie ścisłej czynnej: babka nadmorska (P. maritima L.) i babka pierzasta (P. coronopus L.) Opracowano mikrorozmna-żanie tych taksonów. W przypadku P. asiatica zajęto się również badaniami wczesnych etapów embriogenezy i organogenezy, bu-dową histologiczną, ultrastrukturą, badaniami kariologicznymi oraz cytometrycznymi zawartości jądrowego DNA w różnych rodzajach kultur. Poza tym uzyskano nasiona somatyczne babki azjatyckiej. Kultury in vitro innych ważnych roślin leczniczych z rodziny Plantaginaceae: babki lancetowatej (P. lanceolata L.), babki zwyczajnej (P. major L.) i babki jajowatej (P. ovata Forssk.), znalazły się w kręgu zainteresowań innych autorów. W przypadku babki lancetowatej i babki zwyczajnej interesowa-no się szczególnie metabolitami wtórnymi o znaczeniu farmako-logicznym, produkowanymi w kulturach in vitro tych roślin.
KULTURY IN VITRO TUSSILAGO FARFARA L.
Buchwald Waldemar, Krajewska-Patan Anna, Dreger Ma-riola, Stanisławska Marzena, Górska-Paukszta Małgorzata, Adamczak Artur, Mielcarek Sebastian, Gryszczyńska Ag-nieszka. Instytut Włókien Naturalnych i Roślin Zielarskich,
Oddział Roślin Zielarskich, ul. Libelta 27, 61-707 Poznań, wbu-chwald@iripz.pl
Spożycie roślinnych produktów leczniczych, zawierających podbiał pospolity (Tussilago farfara L.), jest limitowane przez występowanie w nim hepatotoksycznych alkaloidów piroli-zydynowych (zalecenia Komisji E). Surowiec jest stosowany w preparatach polecanych przy schorzeniach górnych dróg odde-chowych. Drogą do wyeliminowania problemu obecności alka-loidów w przetworach leczniczych mogłoby być pozyskiwanie surowca z roślin o małej zawartości tych związków. Przedsta-wione badania są częścią prac, obejmujących selekcję naturalnie występujących polskich populacji – poprzez badanie ich zróżni-cowania genetycznego i fi tochemicznego w celu wyodrębnienia linii hodowlanych o małej zawartości alkaloidów pirolizydyno-wych. Po opracowaniu metodyki multiplikacji pędów nadziem-nych oraz rizogenezy z zebranej kolekcji proweniencyjnej zało-żono hodowle in vitro zorganizowanych kultur podbiału. Analizy występowania alkaloidów pirolizydynowych w pędach hodo-wanych in vitro (wykonane metodą własną przy zastosowaniu techniki HPLC-DAD) wykazały, że zawartość senkirkiny wahała się w granicach od 1,008 do 8,59 mg·(100 g)–1 suchego surowca, w zależności od populacji wyjściowej. Założona kolekcja in vitro stanowić będzie bazę do otrzymania metodami biotechnologicz-nymi linii podbiału, charakteryzującej się małą zawartością alka-loidów. Badania były dofi nansowane przez MNiSW w ramach projektu nr N N405 306236.
KULTURY KORZENI PLANTAGO OVATA FORSSK. Budzianowska Anna. Uniwersytet Medyczny, Katedra i Zakład
Botaniki Farmaceutycznej i Biotechnologii Roślin, ul. Św. Marii Magdaleny 14, 61-213 Poznań, abudzian@ump.edu.pl
Plantago ovata Forssk. (Ispagula, Isubgol, babka jajowata)
(Plantaginaceae) występuje w Azji, jest uprawiana w celu po-zyskiwania nasion i łupiny nasiennej (Plantaginis ovatae semen/
seminis tegumentum), stosowanych głównie jako środki przeciw
zaparciom. Mikrorozmnażanie tego gatunku uzyskano poprzez indukcję pędów bocznych, organogenezę pośrednią i somatycz-ną embriogenezę (Fons i in. 2008). W poprzednich badaniach uzyskano kultury pędowe i kalusowe (Budzianowska i Budzia-nowski 2009). W toku testowania nowych pożywek na inicjację kalusa i organogenezę pośrednią stwierdzono w licznych przy-padkach silną ryzogenezę, szczególnie na pożywkach zawierają-cych NAA i BAP oraz NAA z KIN. Analiza chromatografi czna ekstraktu z tych korzeni na obecność związków fenolowych wy-kazała obecność fenyloetanoidów (glikozydów fenetylowych), podobnych jak w kalusie (werbaskozyd, plantamajozyd). Następ-nie założono kultury w pożywce płynnej MS z NAA 0,25 mg·l–1
i BAP 0,5 mg·l–1, w których wzrost korzeni okazał się bardzo szybki i znacznie większy niż na pożywce stałej. Kultury korzeni
P. ovata mogą być wydajnym źródłem fenyloetanoidów
charak-terystycznych dla rodzaju Plantago L. Literatura: Fons F., Gar-gadennec A., Rapior S. 2008. Acta Biol. Gallica 155: 277–300; Budzianowska A., Budzianowski J. 2009. Acta. Biolog. Cracov. ser. Bot. 51; suppl. 1: 34.
ZWIĄZKI FENOLOWE KALUSA PLANTAGO OVATA FORSSK.
Budzianowska Anna, Budzianowski Jaromir. Uniwersytet
Medyczny, Katedra i Zakład Botaniki Farmaceutycznej i Bio-technologii Roślin, ul. Św. Marii Magdaleny 14, 61-213 Poznań, abudzian@ump.edu.pl
Plantago ovata – babka jajowata (Plantaginaceae) występuje
w Azji i jest uprawiana w celu pozyskiwania nasion i łupiny na-siennej, stosowanych głównie jako środek przeciw zaparciom ze względu na dużą zawartość śluzu. Analizy fi tochemiczne wyka-zały w roślinach z uprawy obecność irydoidów i fenyloetanoidów (werbaskozyd i plantamajozyd), a w nasionach – fenyloetano-idów (werbaskozyd i forsytozyd B) oraz fl awonofenyloetano-idów. W po-przednich badaniach otrzymano kultury pędowe i kalusowe tego gatunku (Budzianowska i Budzianowski 2009). Przedmiotem obecnych badań są kultury kalusowe z liści, korzeni i hypokotyli siewek, wzrastające na pożywce MS o zmniejszonej zawartości NH4NO3 uzupełnionej 2,4-D 1 mg·l–1 i KIN 0,5 mg·l–1. W pasa-żach X, XI i XII wykonano pomiary wskaźnika wzrostu (około 300%). Ekstrakty metanolowe z linii kalusa z różnych organów analizowano na występowanie związków fenolowych metoda-mi chromatografi i TLC i 2D-TLC. Stwierdzono występowanie jedynie fenyloetanoidów – dominujące związki to werbaskozyd i plantamajozyd, podobnie jak wcześniej zaobserwowano w przy-padku kalusa P. lanceolata (Budzianowska i in. 2004). Równole-gle prowadzone są kultury zawiesinowe otrzymane z kalusa. Nie stwierdzono wydzielania związków fenolowych do pożywki. Li-teratura: Budzianowska A., Budzianowski J. 2009. Acta. Biolog. Cracov. ser. Bot. 51 suppl. 1: 34; Budzianowska A., Skrzypczak L., Budzianowski J. 2004. Planta Medica 70: 834–840.
VII Sekcja Kultur Tkankowych Roślin
77
ZASTOSOWANIE TECHNIK KULTURY IN VITRO DO UZYSKANIA KLONÓW TRUSKAWKI (FRAGARIA SP.) O ZWIĘKSZONEJ TOLERANCJI NA STRES SOLNY Dziadczyk Ewa, Burian Maria, Bednara Józef. Uniwersytet
Marii Curie-Skłodowskiej, Zakład Anatomii i Cytologii Roślin, ul. Akademicka 19, 20-033Lublin, ewadziadczyk@interia.pl Metody selekcji w kulturze in vitro stwarzają możliwość uzyska-nia linii hodowlanych o zwiększonej tolerancji na stresy abio-tyczne (susza, zasolenie, niska temperatura). Truskawka
(Fraga-ria x ananassa Duch.) należy do gatunków o małej tolerancji na
zasolenie. Stres solny hamuje wzrost wegetatywny roślin oraz owocowanie. Celem badań było uzyskanie klonów truskawki o zwiększonej tolerancji na zasolenie dzięki metodom kultury in
vitro. W badaniach użyto nasion odmiany ‘Elkat’ (pochodzących
z samozapylenia) oraz odmian ‘Senga Sengana’ i ‘Selva’ (uzyska-nych z wolnego zapylenia) oraz nasiona klonu SSSR. Zastosowa-no następującą procedurę selekcyjną. 1) Nasiona sterylizowaZastosowa-no podchlorynem sodu (4%w/v) i umieszczano na zmodyfi kowanej pożywce według Murashige i Skoog (1962), w temperaturze 5°C na okres 8 tygodni. 2) Następnie nasiona przenoszono na pożyw-kę selekcyjną zawierającą 175 mM NaCl, umieszczano w pokoju hodowlanym (temp. 23°C i fotoperiod 16/8 ). Podczas 9 tygodni selekcji w odstępach siedmiodniowych liczono kiełkujące na-siona. 3) Młode siewki, które wyrosły na pożywce selekcyjnej, przenoszono do słoików na pożywkę zawierającą nadal czynnik selekcyjny (NaCl) na 4 miesiące. Rośliny uzyskane po dwustop-niowej selekcji przenoszono na pożywkę do mikropropagacji.
BADANIA PROTEOMICZNE PROCESU SOMATYCZ-NEJ EMBRIOGENEZY W RODZAJU GENTIANA Z ZA-STOSOWANIEM METODY 2-DE
Floryanowicz-Czekalska Katarzyna1, Rybczyński Jan2.
1,2Ogród Botaniczny – Centrum Zachowania Różnorodności Biologicznej PAN, ul. Prawdziwka 2, 02-973 Warszawa, 1 kasia-czeka@gmail.com, 2jjryb@obpan.pl
Somatyczna embriogeneza (SE) może służyć jako system mode-lowy do badania molekularnych aspektów embriogenezy u roślin. Proces ten jest łatwo osiągalny dla rodzaju Gentiana. W pracy podjęto badania procesu SE goryczki przy zastosowaniu systemu dwukierunkowej elektroforezy. Porównano mapy proteomiczne uzyskane dla zarodków w stadium globularnym i liścieniowym embriogenezy. Elektroforetycznie rozdzielone plamy białkowe dla trzech powtórzeń z każdego stadium poddano analizie przy użyciu oprogramowania ImageMaster 2D Platinum (Amersham Biosciences). Badania wykazują, że 2-DE może służyć jako na-rzędzie do identyfi kacji markerów białkowych poszczególnych stadiów zarodkowych goryczek. Wyniki stanowią podstawę dla dalszych badań obejmujących identyfi kację białek oraz określe-nie ich funkcji.
CZYNNIKI HORMONALNE I ŚRODOWISKOWE W ROZMNAŻANIU PIWONII CHIŃSKIEJ (PAEONIA
LACTIFLORA PALLAS) IN VITRO
Gabryszewska Eleonora. Instytut Sadownictwa i Kwiaciarstwa
im. Szczepana Pieniążka, Zakład Fizjologii i Morfogenezy Ro-ślin Ozdobnych, ul. Pomologiczna 18, 96-100 Skierniewice, ele-onora.gabryszewska@insad.pl
Głównymi czynnikami regulującymi wzrost i rozwój piwonii chińskiej in vitro są: regulatory wzrostu (cytokininy, auksyny, gibereliny, JA-Me), węglowodany, sole mineralne i temperatura. Sacharoza w wysokim stężeniu hamowała powstawanie i wzrost pędów, a stymulowała formowanie pąków spoczynkowych i korzeni. Natomiast egzogenna giberelina, w obecności cytoki-nin, przełamywała hamujące działanie sacharozy i aktywowała proces powstawania pędów. Chłodzenie przerywało spoczynek i aktywowało wzrost pędów, jednak w mniejszym stopniu niż giberelina. Egzogenna auksyna w wysokim stężeniu hamowała wzrost pędów i wpływała na przejście kultur z fazy juwenilnej do dojrzałej. Wysokie stężenie soli mineralnych silnie ogra-niczało wzrost i rozwój pędów. Egzogenna auksyna i wysokie stężenie sacharozy stymulowały ukorzenianie pędów. Także JA--Me, zastosowany łącznie z IBA, sprzyjał formowaniu korzeni na pędach rosnących w niskiej temperaturze. Temperatura mody-fi kowała działanie zarówno regulatorów wzrostu, jak i sacharozy oraz soli mineralnych w procesie namnażania i ukorzeniania pę-dów piwonii.
TECHNOLOGIA WYPROWADZANIA HOMOZYGO-TYCZNYCH ROŚLIN MARCHWI Z ZASTOSOWANIEM KULTUR PYLNIKOWYCH
Górecka Krystyna, Krzyżanowska Dorota, Kowalska Ur-szula, Kiszczak Waldemar, Górecki Ryszard. Instytut
Wa-rzywnictwa im. Emila Chroboczka, ul. Konstytucji 3 Maja 1/3, 96-100 Skierniewice, kgoreck@inwarz.skierniewice.pl
W Instytucie Warzywnictwa w Skierniewicach opracowano technologię otrzymywania roślin homozygotycznych marchwi z zastosowaniem kultur pylnikowych. Znaleziono embriogen-ne odmiany. Opracowano efektywny sposób regeembriogen-neracji roślin z zarodków androgenetycznych poprzez wywołanie wtórnej embriogenezy i konwersji zarodków. Pozwoliło to wyeliminować etap ukorzeniania, którego efektywność była niska. Otrzymane rośliny miały w ponad 90% podwojony garnitur chromosomo-wy. Zbieżność wyników analizy cytologicznej i cytometrycznej pozwala rekomendować tę ostatnią do badania ploidalności ro-ślin androgenetycznych marchwi. Badania anatomiczne rozwoju mikrospor w czasie trwania kultur pylnikowych wykazały, że zarodki powstawały bezpośrednio z nich. Homozygotyczność roślin androgenetycznych potwierdzono, stosując systemy izo-enzymatyczne – PGI i AAT. Obecnie optymalizuje się te etapy.
LV Zjazd PTB, Warszawa 2010
78
DOSKONALENIE METOD KULTYWACJI KORZENI I KLONOWANIA IN VITRO WYBRANYCH ROŚLIN ZIELNYCH I DRZEWIASTYCH
Hanus-Fajerska Ewa1, Wiszniewska Alina2. 1,2Uniwersytet Rol-niczy, Katedra Botaniki i Fizjologii Roślin, al. 29 Listopada 54, 31-425 Kraków, 1e.hanus@ogr.ur.krakow.pl, 2a.wiszniewska@ ogr.ur.krakow.pl
Materiał stanowiły rośliny zielne o wzroście rozetowym
(Biscu-tella laevigata, Brassicaceae, Armeria maritima, Plumbagina-ceae) i rośliny o pędach zdrewniałych (Daphne caucasica, D. jasminea, D. tangutica, Thymelaeceae). W celu wydajnego
roz-mnażania, doskonalenia określonych genotypów oraz uzyskania materiału wolnego od patogenów opracowano protokoły kulty-wacji i pożywki do prowadzenia kultur korzeni oraz rozmnażania klonalnego in vitro wybranych modeli roślinnych.
WPŁYW ZAKŁÓCENIA BIOSYNTEZY I DZIAŁANIA ETYLENU PODCZAS SOMATYCZNEJ EMBRIOGENE-ZY MEDICAGO SATIVA L. NA ZDOLNOŚĆ ZARODKÓW DO REGENERACJI
Kępczyńska Ewa, Zielińska Sylwia. Uniwersytet Szczeciński,
Katedra Fizjologii i Biotechnologii Roślin, Zakład Biotechnolo-gii Roślin, ul. Wąska 13, 71-415 Szczecin, ekepcz@wp.pl Niewielka zdolność zarodków somatycznych do kiełkowania i konwersji, tj. regeneracji w normalne siewki, jest głównym ograniczeniem ich komercyjnego wykorzystania. Głównym ce-lem przeprowadzonych badań było określenie, czy kontrolowane zakłócenie biosyntezy i działania etylenu podczas embriogene-zy somatycznej (SE) Medicago sativa L. cv. Rangelander może wpłynąć na wigor zarodków, w sensie ich zdolności do regenera-cji. Dlatego badano wpływ niespecyfi cznych inhibitorów biosyn-tezy etylenu, kwasu salicylowego (SA) i aminoetoksywinylogli-cyny (AVG) oraz specyfi cznych inhibitorów wiązania etylenu do receptorów, 1-metylocyklopropenu (1-MCP) i 2,5-norbornadie-nu (NBD), zastosowanych podczas fazy namnażania oraz róż-nicowania na wzrost zawiesiny embriogennej, produkcję zarod-ków, ich rozwój i w konsekwencji na zdolność do kiełkowania i konwersji. Uzyskane wyniki wskazują, że nie tylko biosynteza etylenu, ale również jego działanie jest włączone w regulację po-szczególnych faz SE Medicago sativa L., oraz że zakłócenie tych procesów podczas różnych etapów somatycznej embriogenezy niekorzystnie wpływa na wigor uzyskanych zarodków.
MIKROROZMNAŻANIE RZADKIEGO I CHRONIONE-GO GATUNKU – ERYNGIUM MARITIMUM L.
Kikowska Małgorzata, Thiem Barbara. Uniwersytet
Medycz-ny im. K. Marcinkowskiego, Katedra i Zakład Botaniki Farma-ceutycznej i Biotechnologii Roślin, ul. Św. Marii Magdaleny 14, 61-861 Poznań, kikowska@ump.edu.pl
Eryngium maritimum L. (Apiaceae) – rzadka bylina,
podlegają-ca ścisłej ochronie gatunkowej w Polsce, zajmuje nieliczne sta-nowiska na wydmach wybrzeża Morza Bałtyckiego. Halofi t ten rośnie na ubogiej, słonej glebie i wymaga dużego nasłonecznie-nia. Gatunek posiada liczne zastosowanie w medycynie tradycyj-nej z uwagi na zawartość saponin triterpenowych, fl awonoidów, kwasów fenolowych i olejku eterycznego. Dla pozostałych kra-jowych gatunków Eryngium opracowano protokoły mikroroz-mnażania. Kultury in vitro E. maritimum założono ze szczytów młodych pędów i liści roślin gruntowych. Mikropędy otrzymano na pożywce 1/4 MS, 1/2 MS, MS z BAP i IAA oraz TDZ i NAA. Namnożone roślinki i otrzymane somatyczne nasiona mogą sta-nowić formę ochrony ex situ tego rzadkiego gatunku. Zastoso-wanie techniki kultur in vitro w celu otrzymania surowców do badań fi tochemicznych rzadkiego E. planum pozwala na ochronę istniejących w Polsce zasobów tego gatunku.
PORÓWNANIE METOD OTRZYMYWANIA PODWOJO-NYCH HAPLOIDÓW MARCHWI
Kiszczak Waldemar, Krzyżanowska Dorota, Kowalska Ur-szula, Górecka Krystyna. Instytut Warzywnictwa im. Emila
Chroboczka, ul. Konstytucji 3 Maja 1/3, 96-100 Skierniewice, wkisz@inwarz.skierniewice.pl
Przyjmuje się, że zastosowanie kultur pylnikowych czy kultur izolowanych mikrospor skraca etap homozygotyzacji kompo-nentów rodzicielskich mieszańców do około 1 roku. Prezento-wane doświadczenia dotyczyły indukcji androgenezy, regenera-cji, adaptacji i oceny otrzymanych roślin marchwi. Porównano wpływ wybranych czynników na przebieg tych procesów przy zastosowaniu obu metod otrzymywania roślin androgenetycz-nych. Poprzez analizę elektroforetyczną dwóch systemów izo-enzymatycznych PGI (EC5.3.1.9) i AAT (EC 2.6.1.1) oceniano homozygotyczność tych roślin. Ze względów na różnice meto-dyczne między techniką kultur pylnikowych i kultur izolowa-nych mikrospor nie można było jednoznacznie stwierdzić, która z metod jest wydajniejsza. Wykazano istotny wpływ badanych czynników na proces androgenezy zarówno w kulturach pylni-kowych, jak i w kulturach izolowanych mikrospor.
VII Sekcja Kultur Tkankowych Roślin
79
WZROST I TUBERYZACJA ROŚLIN ZIEMNIAKA