Wielkością szczególnie użyteczną przy oznaczeniach spektrofotometrycznych jest absorban-cja:
I AlogI0
gdzie I0 jest natężeniem światła padającego a I natężeniem światła przechodzącego przez próbkę. Zgodnie z prawem Lamberta-Beera, odnoszącym się do absorpcji światła monochro-matycznego przez roztwory, absorbancja jest wprost proporcjonalna do stężenia roztwo-ru c i drogi optycznej l, czyli groztwo-rubości warstwy roztworoztwo-ru, przez którą przechodzi świa-tło.
A = k l c
Współczynnik absorpcji k charakteryzuje intensywność absorpcji promieniowania elektroma-gnetycznego przez daną substancję przy określonej długości fali. Metodą spektrofotometrycz-ną najłatwiej więc oznaczać substancje charakteryzujące się dużymi współczynnikami ab-sorpcji. Jeżeli stężenie absorbującej substancji c jest wyrażone w mol/dm3 wówczas współ-czynnik absorpcji k nazywamy molowym współwspół-czynnikiem absorpcji (albo absorpcyjnością molową) i oznaczamy literą Jeżeli drogę optyczną l wyrazimy w cm, wówczas jednostką jest dm3mol-1cm-1. Często, również w naszych ćwiczeniach, gdy interesuje nas nie tyle ilość moli co masa analitu, dogodnie jest jednak posługiwać się innymi jednostkami stężenia, taki-mi jak g/dm3, mg/cm3.
Znajomość współczynnika absorpcji k i drogi optycznej l pozwala na bezpośrednie obliczenie z równania Lamberta-Beera stężenia analizowanej substancji. Ze względu na to, że nie zaw-sze znamy wartość współczynnika k jak i poniżej omówione odchylenia(7) od prawa Lamber-ta-Beera bezpieczniej jest jednak zastosować metodę krzywej wzorcowej (kalibracyjnej).
W celu wykonania krzywej wzorcowej przygotowuje się zwykle kilka (4-6) roztworów wzor-cowych o wzrastającym stężeniu analizowanego pierwiastka i mierzy ich absorbancję przy długości fali λmax, stosując wodę destylowaną jako roztwór odniesienia(8). Stężenia roztworów wzorcowych powinny być tak dobrane, aby absorbancja nie była większa od 1,5(9). Następnie wykreśla się krzywą wzorcową (Rysunek 1) A = f(c), która przy idealnym spełnieniu prawa Lamberta-Beera jest linią prostą o nachyleniu kl, przechodzącą przez początek układu
(7) Pomiar absorpcji roztworów stężonych rodzi niebezpieczeństwa wynikające z odstępstw od prawa Lamberta-Beera. Jeśli w danym zakresie stężenia absorbancja jest mniejsza niż przewiduje równanie Lamberta-Beera mó-wimy o odchyleniu ujemnym jeśli jest przeciwnie, o odchyleniu dodatnim. Odchylenia te wynikają z różnych oddziaływań i reakcji chemicznych cząsteczek oznaczanej substancji między sobą, z rozpuszczalnikiem bądź innymi składnikami roztworu.
(8) Podczas pomiaru absorbujący roztwór znajduje się w kuwecie, której ścianki nie są nigdy idealnie przezroczy-ste (absorbancja rzędu kilku setnych). Do tego przy wybranej długości fali również rozpuszczalnik i inne skład-niki roztworu niż oznaczana substancja mogą dawać pewien wkład do całkowitej absorbancji. Jeśli prawo Lam-berta-Beera ma być spełnione te wkłady pochodzące od kuwety, rozpuszczalnika itp. należy odjąć. Można tego dokonać przez umieszczenie w przyrządzie przed właściwym pomiarem kuwety z samym rozpuszczalnikiem i pomiar absorbancji bez substancji badanej. Wartość tę trzeba następnie odejmować od otrzymanych wyników (kompensacja). W nowoczesnych spektrofotometrach kompensacja zachodzi automatycznie.
(9) Należy unikać pomiarów dużych wartości absorbancji (umownie A > 1,5). Ze wzrostem absorbancji wydatnie maleje bowiem dokładność pomiaru. Np. przy A = 3 natężenie światła przechodzącego przez próbkę jest już 1000 razy mniejsze niż natężenie światła padającego. Jeżeli absorbancja jest zbyt duża badany roztwór należy rozcieńczyć.
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
0 1 2 3 4 5 6
Stężenie metalu, mg/cm3
Absorbancja
rzędnych. Krzywa wzorcowa służy do bezpośredniego odczytu stężenia badanej substancji na podstawie pomiaru absorbancji jej roztworu przy określonej długości fali.
Rysunek 1 Przykładowa krzywa wzorcowa.
Ważne jest, aby próbki o nieznanej zawartości Fe3+ lub Cu2+ przygotować w warunkach iden-tycznych jak dla roztworów wzorcowych (ilość odczynnika kompleksującego, pH, temperatu-ra, warunki pomiaru absorbancji: długość fali, grubość kuwety).
Oznaczenie spektrofotometryczne wykonywane na ćwiczeniach obejmuje:
wykonanie krzywej wzorcowej dla roztworów wzorcowych Fe3+ lub Cu2+,
oznaczenie zawartości Fe3+ lub Cu2+ w badanej próbce.
9.1. Oznaczanie Fe3+ metodą rodankową
Jony Fe3+ tworzą z jonami rodankowymi SCN– (tiocyjanianowymi) w środowisku kwaśnym kompleksy o czerwonym zabarwieniu zgodnie z poniższymi równaniami:
Fe3+ + SCN– → Fe(SCN)2+,
Fe(SCN)2+ + SCN– → [Fe(SCN)2]+, itd. aż do:
[Fe(SCN)5]2– + SCN– → [Fe(SCN)6]3–.
W roztworach rozcieńczonych stosowanych w spektrofotometrii występują głównie komplek-sy Fe(SCN)2+. Intensywność zabarwienia roztworu jest wprost proporcjonalna do stężenia jonów Fe3+. Z charakterystycznego dla oznaczanego kompleksu widma absorpcji, czyli zależ-ności absorpcji światła od długości fali λ, wyznacza się λmax., tzn. długość fali, przy której analizowana próbka wykazuje największą absorbancję (Rysunek 2).
25
350 400 450 500 550 600 650 700 750
Długość fali, l
Absorbancja
max
Rysunek 2 Widmo absorpcji kompleksu jonów Fe3+ z jonami tiocyjanianowymi w roztworze wodnym.
Przebieg ćwiczenia:
Przygotowanie krzywej wzorcowej dla oznaczania Fe3+:
Roztwór wzorcowy roboczy
1. Kolbę miarową o pojemności 100 cm3 opisaną imieniem i nazwiskiem dostar-czyć prowadzącemu ćwiczenie.
2. Do kolbki prowadzący ćwiczenie wydaje roztwór zawierający 1 mg Fe3+. 3. Kolbkę należy starannie uzupełnić do kreski wodą destylowaną, wymieszać.
Roztwory wzorcowe
1. Do pięciu kolbek miarowych o pojemności 25 cm3 odmierzyć kolejno 3, 6, 9, 12, 15 cm3 roztworu roboczego.
2. Do każdej kolbki dodaje się 1 cm3 2M roztworu HNO3 i 5 cm3 20% roztworu KSCN.
3. Całość uzupełnić wodą destylowaną do kreski, wymieszać.
4. Zmierzyć absorbancję przy max = 480 nm dla poszczególnych roztworów (10). Jako roztwór odniesienia należy użyć wodę destylowaną(11).
5. Na papierze milimetrowym wykreślić zależność A = f(c).
Oznaczenie Fe3+ w analizowanej próbce
1. Kolbę miarową o pojemności 100 cm3 opisaną imieniem i nazwiskiem dostar-czyć prowadzącemu ćwiczenie.
2. Otrzymaną próbę o nieznanej zawartości Fe3+ uzupełnić do kreski wodą desty-lowaną, wymieszać.
3. Z tego roztworu pobrać do 3 kolbek o pojemności 25 cm3 po 10 cm3, dodać KSCN i HNO3, podobnie jak przy sporządzaniu roztworów do krzywej wzor-cowej.
4. Roztwory uzupełnić wodą destylowaną do kreski, wymieszać.
(10) Kuwetę przed pomiarem absorbancji należy przemyć badanym roztworem.
(11) Należy przed pomiarem absorbancji sprawdzić, czy spektrofotometr ma ustawioną odpowiednią długość fali i czy jest wykalibrowany.
5. Zmierzyć absorbancję analizowanych roztworów przy długości fali max(10). Jako roztwór odniesienia należy użyć wodę destylowaną (11).
6. Obliczyć średnią z trzech pomiarów absorbancji.
7. Odczytać stężenie żelaza z krzywej wzorcowej i obliczyć zawartość Fe3+ w badanej próbce.
Wynik eksperymentu:
Należy podać prowadzącemu ćwiczenie zawartość Fe3+ (w mg) w kolbce o pojemności 100 cm3.
Wskazówka do obliczeń:
Zastanów się:
1) jaka jest masa Fe3+ w kolbce o pojemności 25 cm3, znając z krzywej wzorcowej stężenie Fe3+ w 1 cm3 roztworu ?
2) jak jest masa analitu w całej próbce wiedząc, że do kolbki o pojemności 25 cm3 pobrano 10 cm3 z kolbki (100 cm3) zawierającej analizę ?
9.2. Spektrofotometryczne oznaczanie miedzi (II)
Jony Cu2+ w roztworach wodnych związane są z czterema ligandami – cząsteczkami wody tworząc jon [Cu(H2O)4]2+ o barwie niebieskiej. Po dodaniu amoniaku do roztworu zawierają-cego jony miedzi (II) powstaje kompleks [Cu(NH3)4]2+ o intensywnym niebiesko-granatowym zabarwieniu. Intensywność zabarwienia jest wprost proporcjonalna do stężenia jonów Cu2+ w roztworze. Z widma absorpcji (Rysunek 3) wyznaczamy długość fali max dla badanego kom-pleksu miedzi czyli długość fali, przy której analizowana próbka wykazuje największą absor-bancję.
Rysunek 3 Widmo absorpcji kompleksu jonów Cu2+ z amoniakiem.
Przebieg ćwiczenia:
Przygotowanie krzywej wzorcowej dla oznaczania Cu2+:
Roztwór wzorcowy roboczy
1. Kolbę miarową o pojemności 100 cm3 opisaną imieniem i nazwiskiem dostar-czyć prowadzącemu ćwiczenie.
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
400 500 600 700 800 900
Długość fali,
Absorbancja
max
27
2. Do kolby prowadzący ćwiczenie wydaje roztwór zawierający 100 mg Cu2+. 3. Kolbkę należy uzupełnić do kreski wodą destylowaną, wymieszać.
Roztwory wzorcowe
1. Do pięciu kolbek miarowych o pojemności 25 cm3 odmierzyć kolejno 3, 6, 9, 12, 15 cm3 roztworu roboczego.
2. Do każdej kolbki dodaje się 3 cm3 3 M roztworu NH4OH.
3. Całość uzupełnić wodą destylowaną do kreski, wymieszać.
4. Zmierzyć absorbancję przy max = 608 nm dla poszczególnych roztworów(12). Jako roztwór odniesienia należy użyć wodę destylowaną(13).
5. Na papierze milimetrowym wykreślić zależność A = f(c).
Oznaczenie Cu2+ w analizowanej próbce
1. Kolbę miarową o pojemności 100 cm3 opisaną imieniem i nazwiskiem dostar-czyć prowadzącemu ćwiczenie.
2. Otrzymaną w kolbie próbę o nieznanej zawartości Cu2+ uzupełnić do kreski wodą destylowaną, wymieszać.
3. Z tego roztworu pobrać do 3 kolbek o pojemności 25 cm3 po 10 cm3, dodać podobnie jak przy sporządzaniu roztworów do krzywej wzorcowej,
3 cm3 3 M roztworu NH4OH.
4. Roztwory uzupełnić wodą destylowaną do kreski, wymieszać.
5. Zmierzyć absorbancję roztworów przy max(12)
. Jako roztwór odniesienia nale-ży unale-żyć wodę destylowaną(13).
6. Obliczyć średnią z trzech pomiarów absorbancji.
7. Odczytać stężenie miedzi z krzywej wzorcowej i obliczyć zawartość Cu2+ w badanej próbce.
Wynik eksperymentu:
Należy podać prowadzącemu ćwiczenie zawartość Cu2+ (w mg) w kolbce o pojemności 100 cm3.
Wskazówka:
Zastanów się:
1) jaka jest masa Cu2+ w kolbce o pojemności 25 cm3, znając z krzywej wzorcowej stężenie Cu2+ (ilość Cu2+ w 1 cm3 roztworu)?
2) jaka jest masa analitu w całej próbce wiedząc, że do kolbki o pojemności 25 cm3 pobrano 10 cm3 z kolbki (100 cm3) zawierającej analizę?
(12) Kuwetę przed pomiarem absorbancji należy przemyć badanym roztworem.
(13) Należy przed pomiarem absorbancji sprawdzić, czy spektrofotometr ma ustawioną odpowiednią długość fali i czy jest wykalibrowany.