Struktura kwasów huminowych w świetle widm

Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) jest jedną z metod cząsteczkowej spektroskopii absorpcyjnej. Jądra atomowe niektórych izotopów umieszczone w jednorodnym polu magnetycznym mogą absorbować promieniowanie elektromagnetyczne o częstości radiowej. W ostatnich latach spektroskopia magnetycznego rezonansu ¹³C i ¹H stała się jedną z podstawo-wych metod badań strukturalnych substancji humusopodstawo-wych [12, 53, 144, 153, 156]. Widma NMR, zwłaszcza widmo węglowe, pozwalają na bardziej szczegó-łową charakterystykę tak bogatych układów, jakimi są substancje humusowe.

Zakres przesunięć chemicznych jąder ¹³C jest bardzo szeroki dla różnych związków chemicznych i może obejmować aż 665 ppm (dla ¹H – 20 ppm).

W widmach ¹³C NMR kwasów huminowych wyróżnia się trzy podstawowe zakresy:

0-95 ppm – obejmujący węgiel połączeń alifatycznych,

95-160 ppm – związany z obecnością węgla połączeń aromatycznych, 160-190 ppm – węgiel grupy karboksylowej.

W obszarze od 0 do około 95 ppm można dodatkowo wyróżnić zakres 0-45 ppm, związany z obecnością w cząsteczkach kwasów huminowych grup metylowych i metylenowych, oraz dwa pasma w zakresie od 45 do 95 ppm, odpowiadające połączeniom C-O, C-N, C-OH protein, peptydów, aminokwa-sów, alkoholi i grup metoksylowych. Piki występujące w zakresach od 65 do 95 ppm i od 95 do 110 ppm mogą świadczyć o obecności węgla pochodnych celulozowych i hemicelulozy. Zakres od 45 do 65 ppm obejmuje głównie

połą-czenia C-O grup metoksylowych. W obszarze obejmującym węgiel połączeń aromatycznych obserwuje się niekiedy dodatkowe pasmo w zakresie od 140 do 160 ppm, związane z obecnością węgla połączeń aromatycznych występującego w strukturach ligninowych [12, 23, 53, 133, 138, 153, 156]. Udział węgla aro-matycznych struktur ligninowych (Clig) w puli całkowitego węgla połączeń aromatycznych (Car + Clig) określono w pracy parametrem „P”.

W widmach ¹³C NMR kwasów huminowych wyizolowanych z próbek warstwy 0-25 cm gleby nawożonej przez 17 lat wyłącznie NPK stwierdzono obecność pięciu pików o wysokiej intensywności, występujących w zakresach:

0-45, 45-65, 65-90 i 90-140 ppm oraz 155-190 ppm, i piku o bardzo słabej in-tensywności, występującego w zakresie 140-155 ppm (rys. 15). Przebieg widm

13C NMR kwasów huminowych wyizolowanych z próbek gleby nawożonej najniższą dawką gnojowicy był bardzo zbliżony do widm KH wariantu NPK.

Nawożenie gnojowicą w dawkach od 50 do 200 m³·ha^-1 powodowało zwiększe-nie intensywności pasm w zakresie 45-65 ppm i 140-155 ppm. W widmach kwasów huminowych wyseparowanych z próbek gleby nawożonej gnojowicą w dawkach 100 i 200 m³·ha^-1 stwierdzono obecność dodatkowego pasma w przedziale 95-110 ppm, jednak o słabej intensywności. Nawożenie gnojowicą w dawkach 50-200 m³·ha^-1 powodowało więc zwiększenie udziału węgla wystę-pującego w połączeniach C-O (pasmo 45-65 ppm) i węgla aromatycznych struktur ligninowych (Clig, parametr P, tab. 36, 37).

Udział poszczególnych połączeń węglowych w cząsteczkach kwasów hu-minowych gleby nawożonej wyłącznie NPK nie zależał od terminu pobrania próbek do analizy. Po zakończeniu doświadczenia (1999 r.) w cząsteczkach KH gleby nawożonej wcześniej gnojowicą w dawkach 100 i 200 m³·ha^-1, w porów-naniu z KH gleby nawożonej wyłącznie NPK i gnojowicą w dawkach 25 i 50 m³·ha^-1, zaobserwowano niższy udział węgla połączeń aromatycznych i wyższy węgla aromatycznych struktur ligninowych (rys. 15, 16, tab. 36).

Kwasy huminowe warstwy gleby 25-50 cm (niezależnie od terminu pobra-nia próbek do analizy) charakteryzowały się mniejszym udziałem węgla zwią-zanego z obecnością nierozłożonych struktur ligninowych (Clig), większym udziałem węgla połączeń aromatycznych (Car) oraz mniejszą intensywnością pasma związanego z obecnością grup metoksylowych, a w konsekwencji niższą wartością stosunku Cal/Car w porównaniu z KH warstwy 0-25 cm (tab. 37, rys. 15, 16). Wprawdzie analiza statystyczna nie wykazała wpływu sposobu na-wożenia, terminu i głębokości, z jakiej były pobierane próbki do analiz, na udział w cząsteczkach kwasów huminowych węgla grupy karboksylowej, to jednak należy podkreślić, że szczególnie wysoki udział C-COOH stwierdzono w KH warstwy 25-50 cm, wyizolowanych z próbek pobranych po zakończeniu II etapu doświadczenia (1999 r., tab. 36).

Warstwa gleby – Soil layer, 0-25 cm Warstwa gleby – Soil layer, 25-50 cm

NPK

G(25)

G(50)

G(100)

G(200)

NPK

G(25)

G(50)

G(100)

G(200)

Rys. 15. Widma ¹³C NMR kwasów huminowych wyizolowanych z próbek gleby pobranych w 1989 r.

Fig. 15. ¹³C NMR spectra of humic acids isolated from soil sampled in 1989

Warstwa gleby – Soil layer, 0-25 cm Warstwa gleby – Soil layer, 25-50 cm

NPK

G(25)

G(50)

G(100)

G(200)

NPK

G(25)

G(50)

G(100)

G(200)

Rys. 16. Widma ¹³C NMR kwasów huminowych wyizolowanych z próbek gleby pobranych w 1999 r.

Fig. 16. ¹³C NMR spectra of humic acids isolated from soil sampled in 1999

77 Tabela 36. Procentowy udział wybranych połączeń węgla w cząsteczkach kwasów huminowych obliczony na podstawie widm13 C NMR Table 36. Percentages of some carbon links in humic acids molecules calculated from the 13 C NMR spectra Rok – Year 1989 1999Wariant Treatment Car CligC-COOHP Cal/CarCar CligC-COOHP Cal/Car Warstwa gleby – Soil layer, 0-25 cm NPK* 26,9 6,5 16,0 19,4 1,88 27,0 6,6 16,6 19,5 1,84 G(25)** 26,7 7,0 15,1 20,8 1,91 29,0 6,8 15,1 18,7 1,69 G(50)** 26,0 8,3 16,9 24,2 1,87 27,3 6,6 15,4 19,5 1,86 G(100)**26,9 7,6 14,5 22,0 1,89 26,6 7,6 14,5 22,3 1,93 G(200)**26,6 9,0 12,3 25,3 1,96 26,2 7,2 14,4 21,6 1,99 Warstwa gleby – Soil layer, 25-50 cm NPK* 30,7 5,1 16,6 14,3 1,55 34,4 2,6 19,0 7,0 1,28 G(25)** 30,7 5,1 16,6 14,3 1,55 35,0 2,3 15,6 6,1 1,33 G(50)** 29,8 6,5 13,6 17,9 1,68 34,4 3,1 18,2 8,2 1,29 G(100)**29,3 7,0 14,6 19,3 1,68 29,6 3,7 16,2 11,0 1,71 G(200)**29,3 7,3 14,6 20,0 1,67 29,8 3,6 16,9 10,7 1,67 P = (Clig/(Car + Clig))⋅100% * wartości średnie dla NPK1 – NPK4 average values for NPK1 – NPK4 ** wartości średnie z 4 kombinacji nawozowych (G1, G1+N, G2 i G2+N) average values of four fertilization treatments (G1, G1+N, G2 and G2+N)

78 Tabela 37. Wyniki analizy wariancji dla udziału wybranych połączeń węgla w cząsteczkach kwasów huminowych wyznaczonych na podstawie widm13 C NMR Table 37. Results of variance analysis of the percentage of some carbon links in humic acids molecules calculated from the 13 C NMR spectra Czynnik – Factor Car CligC-COOH P Cal/Car 28,3 6,9 15,1 19,8 1,76 I czynnik: rok Factor I: year 1989 199929,9

NIR LSD = 0,85 5,0

NIR LSD = 0,41 16,2 ni – ns 14,5

NIR LSD = 0,91 1,66

NIR LSD = 0,089 0-25 cm26,9 7,3 15,1 21,3 1,88 II czynnik: warstwa gleby Factor II: soil layer 25-50 cm31,3

NIR LSD = 0,85 4,6

NIR LSD = 0,41 16,2 ni – ns 12,9

NIR LSD = 0,91 1,54

NIR LSD = 0,089 NPK 29,8 5,2 17,1 15,1 1,64 G(25) 30,4 5,3 15,7 15,0 1,62 G(50) 29,4 6,1 16,0 17,5 1,68 G(100)28,1 6,5 15,0 18,7 1,80

III czynnik: sposób nawożenia Factor III: mode of fertilization G(200) 28,0

NIR LSD = 2,15 6,8

NIR LSD =1,03 14,5

ni – ns 19,4

NIR LSD = 2,30 1,82

ni – ns Interakcje – Interactions: Car – I/II, II/I – 1,20, 1,20; Clig – I/II, II/I – 0,58, 0,58; P – I/II, II/I – 1,19, 1,19

Zech i Guggenberger [157] podają, że w glebach mineralnych wraz ze zwiększeniem głębokości następuje zmniejszenie udziału węgla połączeń C-O grup metoksylowych, jak również zwiększenie udziału węgla w połączeniach aromatycznych i węgla grupy karboksylowej. Zwiększenie udziału C-połączeń aromatycznych i węgla grupy karboksylowej oraz zmniejszenie udziału C-O związane jest przede wszystkim z degradacją lignin. Zmniejszenie udziału połą-czeń C-O, zdaniem autorów, może być także wynikiem mineralizacji polisacha-rydów, jak również mniejszej ilości resztek roślinnych dostających się do głęb-szych warstw gleby.

Stąd też obserwowany w doświadczeniu niższy udział węgla występującego w połączeniach aromatycznych i węgla grupy karboksylowej (choć nieistotny statystycznie) oraz wyższy udział nierozłożonych struktur ligninowych (Clig, parametr P) w cząsteczkach kwasów huminowych warstwy gleby 25-50 cm na-wożonej gnojowicą w dawkach 100 i 200 m³·ha^-1 – w porównaniu z KH tej war-stwy wariantów NPK – jest najprawdopodobniej konsekwencją migracji substan-cji organicznych wprowadzanych do gleby w dużej ilości z gnojowicą, których obecność utrzymuje się jeszcze po 10 latach od zaprzestania jej stosowania (tab. 36). Również Trenner i Rauhe (cyt. za [77]) stwierdzili, że gnojowica z du-żym udziałem frakcji stałej trudniej ulega rozkładowi w glebie, co zdaniem auto-rów jest związane z zawartością w gnojowicy odpornych na rozkład niestrawio-nych resztek paszy.

Na podstawie otrzymanych zależności (tab. 36, 37, rys. 15, 16) można przy-puszczać, że właściwości (budowa) cząsteczek kwasów huminowych gleby są modyfikowane zarówno w wyniku dostarczenia wraz z gnojowicą świeżej materii organicznej, jak i właściwościami resztek pozbiorowych pozostawianych po sprzęcie uprawianych roślin. O udziale resztek pozbiorowych w kształtowaniu właściwości kwasów huminowych może świadczyć stosunkowo wysoki udział węgla aromatycznych połączeń ligninowych w cząsteczkach kwasów humino-wych warstwy powierzchniowej gleby nawożonej wyłącznie NPK.

Należy również podkreślić, że analiza widm ¹³C NMR nie wykazała wpły-wu sposobu nawożenia gnojowicą na ich przebieg, stąd też omówiono tylko zmiany przebiegu widm w zależności od rodzaju stosowanego nawozu i dawki gnojowicy, jaką wprowadzano do gleby.