CZE˛S
´
C´
IIKatedra i Zakład Bromatologii Akademii Medycznej w Warszawie Kierownik: prof. dr hab. A. Tokarz
Hasła kluczowe: nutrigenomika, profile ekspresji geno´w, mikromacierze DNA.
Key words: nutrigenomics, gene expression profiling, DNA microarrays.
S
´
wiadomos´c´, z˙e z˙ywienie odgrywa waz˙na˛ role˛ w podtrzymywaniu stanu zdrowia, łagodzeniu objawo´w choroby czy ogo´lnie mo´wia˛c w zapewnianiu dobrostanu stanowi od wieko´w podstawe˛ rozwoju wielu dziedzin nauki zwia˛zanych z zagadnieniami z˙ywienia. Poznanie po cze˛s´ci wpływu diety na zdrowie człowieka doprowadziło do wyeliminowania objawo´w wielu choro´b dietozalez˙nych, spowodo-wanych brakiem, nadmiarem, czy obecnos´cia˛ danego składnika w poz˙ywieniu, jak np. fenyloketonuria. Nalez˙y to z cała˛ pewnos´cia˛ zapisac´ na poczet zasług badan´ z˙ywieniowych. Wcia˛z˙ jednak bardzo wiele pozostaje do odkrycia czy wyjas´nienia. Prowadzone od lat badania epidemiologiczne i fizjologiczne, pomimo ich ogromnej wartos´ci, zdaja˛ sie˛ nie byc´ wystarczaja˛ce. W dobie zaawansowanych odkryc´ z dziedziny genomiki i biologii molekularnej obserwujemy zdecydowane zwro´cenie sie˛ badaczy zajmuja˛cych sie˛ problemami z˙ywieniowymi ku nowoczesnym technologiom, wykorzystywanym z po-wodzeniem przez inne gałe˛zie nauki i pro´by wykorzystania ich w badaniach nad wpływem diety na funkcjonowanie organizmu.Na obecnym etapie wiedzy wydaje sie˛ niemoz˙liwe pełne zrozumienie wpływu z˙ywienia na homeostaze˛ organizmu. Niezbe˛dnym staje sie˛ poznanie molekularnych mechanizmo´w oddziaływania składniko´w diety. Jest to realne dzie˛ki doste˛pnos´ci ogromnej ilos´ci danych generowanych przez projekty zajmuja˛ce sie˛ badaniami nad genomami, w tym nad genomem ludzkim. Nie bez znaczenia sa˛ ro´wniez˙ obserwacje czynione od lat, kto´re wskazuja˛ na znaczenie genetycznych predyspozycji w wyste˛powaniu wielu choro´b dietozalez˙nych, jak cukrzyca typu drugiego, nowotwory czy choroby układu kra˛z˙enia. Ponadto postuluje sie˛, z˙e składniki diety tj. zaro´wno tłuszcze, we˛glowodany, białka, jak i składniki regulatorowe, jak witaminy czy mikroelementy, maja˛ znaczenie jako cza˛steczki „sygnałowe” dla przebiegu wielu proceso´w i funkcjonowania szlako´w metabolicznych.
Wszystkie te przesłanki powoduja˛, z˙e badania z˙ywieniowe i badania genomiczne, kto´re do niedawna biegły zupełnie niezalez˙nymi szlakami, zostaja˛ poła˛czone w jedna˛ dziedzine˛, jaka˛ jest „z˙ywieniowa genomika” lub inaczej „nutrigenomika” (1, 2, 3, 4). Najkro´cej moz˙na ja˛ zdefiniowac´ jako dziedzine˛ badaja˛ca˛ wpływ składniko´w z˙ywnos´ci na genom przy zastosowaniu nowoczesnych technologii biologii molekularnej.
M i k r o m a c i e r z e D N A. Technika˛, kto´ra coraz bardziej zyskuje na znaczeniu w badaniu interakcji gen – z˙ywnos´c´ jest technika mikromacierzy DNA. Pozwala ona na jednoczesny pomiar ekspresji tysie˛cy geno´w, przez co stanowi pote˛z˙ne narze˛dzie w analizie transkrypto´w i doskonały przykład poła˛czenia metod biologii molekularnej, nanotechnologii i informatyki. Sama idea metody wywodzi sie˛ z klasycznych technik analizy ekspresji geno´w jak Northern blot i oparta jest na zjawisku hybrydyzacji, czyli zdolnos´ci tworzenia przez jednoniciowe kwasy nukleinowe, o w wie˛kszos´ci komplementarnych sekwencjach, dwuniciowych cza˛steczek, tzw. hybryd. Mikromacierz DNA stanowi BROMAT. CHEM. TOKSYKOL. – XXXIX, 2006, 1, str. 65 – 69
uporza˛dkowany zbio´r geno´w lub fragmento´w geno´w w postaci jednoniciowego DNA, unieruchomiony na membranie lub płytce szklanej ba˛dz´ z tworzywa. W odro´z˙nieniu od techniki Northern sondy obrazuja˛ce geny sa˛ wia˛zane w sposo´b trwały na stałym podłoz˙u, zas´ znakowana jest pro´bka badanego materiału genetycznego. Wyro´z˙nia sie˛ cztery podstawowe typy macierzy DNA (5, 6).
M a k r o m a c i e r z e D N A. Stanowia˛ je nylonowe membrany pokryte fragmentami DNA lub cDNA. Sa˛ to macierze o niskiej ge˛stos´ci (1 – 2 mm odległos´c´ mie˛dzy oczkami sieci). Dzie˛ki nim moz˙na badac´ jednoczes´nie ekspresje˛ do 100 geno´w. Pro´by badane znakowane sa˛ radioaktywnie lub chemilumi-nescencyjnie.
M i k r o m a c i e r z e c D N A. Sa˛ to zwykle płytki szklane lub z tworzywa, na kto´rych umieszczone sa˛ sondy DNA. Moga˛ byc´ to fragmenty cDNA złoz˙one z 200 – 2400 nukleotydo´w, otrzymane metoda˛ PCR lub RT-PCR. Dla stworzenia takiej sondy nie jest konieczna dokładna znajomos´c´ sekwencji całego genu, wystarczy odpowiednie dopasowanie startera dla selektywnej i wydajnej amplifikacji wybranej cze˛s´ci genu. Zaleta˛ tego rodzaju macierzy jest moz˙liwos´c´ ich wykorzystania do badania ekspresji geno´w o nieznanej lub tylko cze˛s´ciowo znanej sekwencji, zas´ wada˛, wynikaja˛ca˛ gło´wnie z wielkos´ci stosowanych sond jest moz˙liwos´c´ hybrydyzacji z nimi fragmento´w o nie w pełni komplementarnej sekwencji. Kolejna˛ zaleta˛ mikromacierzy cDNA jest moz˙liwos´c´ badania i poro´wnania jednoczes´nie w jednym eksperymencie ekspresji dwo´ch pro´b, zwykle pro´by badanej i kontrolnej, dzie˛ki oznakowaniu
Ryc. 1. Schemat przebiegu eksperymentu z zastosowaniem mikromacierzy cDNA. (www.fao.org/DOCREP/003/X6884e03.htm)
Fig. 1. cDNA microarray experiment. (www.fao.org/DOCREP/003/X6884e03.htm)
ich ro´z˙nymi barwnikami fluorescencyjnymi. Do tego typu eksperymento´w najcze˛s´ciej stosuje sie˛ dwa fluorofory: cyanine 3 (Cy3) i cyanine 5 (Cy5), kto´rych widma emisji pokrywaja˛ sie˛ w niewielkim zakresie, co pozwala na odro´z˙nienie pro´by znakowanej jednym z nich od drugiej, znakowanej przy uz˙yciu drugiego fluoroforu. Po wzbudzeniu znaczniko´w s´wiatłem laserowym o odpowiednich długo-s´ciach fali uzyskany obraz badany i kontrolny moz˙na na siebie nałoz˙yc´ celem poro´wnania ekspresji pro´b. Tego typu macierze sa˛ zwykle projektowane i wykonywane samodzielnie w laboratorium na potrzeby danego eksperymentu.
Typowy eksperyment z zastosowaniem mikromacierzy cDNA składa sie˛ z naste˛puja˛cych etapo´w: • przygotowanie sond molekularnych,
• zwia˛zanie sond do powierzchni płytki • przygotowanie pro´bek:
– izolacja RNA,
– otrzymanie cDNA znakowanego fluoroforem w reakcji odwrotnej transkrypcji, – hybrydyzacja pro´b do sond na mikromacierzy,
– odczytanie sygnału hybrydyzacji, – analiza danych (ryc. 1).
O l i g o n u k l e o t y d o w e m a c i e r z e o d u z˙ e j g e˛ s t o s´ c i ( m i k r o c h i p y D N A ). Produ-kowane sa˛ zwykle fabrycznie, charakteryzyja˛ sie˛ duz˙a˛ ge˛stos´cia˛ oczek i moz˙liwos´cia˛ badania jednoczes´nie ekspresji kilkudziesie˛ciu tysie˛cy geno´w. Sondami sa˛ kro´tkie oligonukleotydowe fragmenty DNA otrzymane na drodze syntezy chemicznej lub metoda˛ fotolitografii bezpos´rednio na mikro-macierzy. Do zaprojektowania i wykonania tego typu macierzy konieczna jest znajomos´c´ sekwencji
Ryc. 2. Schemat przebiegu eksperymentu z zastosowaniem oligonukleotydowych macierzy o duz˙ej ge˛stos´ci (https://www.vbi.vt.edu/article/articleview/145).
Fig. 2. High-density oligonucleotide microarrays experiment (https://www.vbi.vt.edu/article/articleview/145).
analizowanych geno´w. Słuz˙a˛ one do zaprojektowania i wykonania zestawu oligonukleotydo´w o sekwen-cjach specyficznych dla danego genu. Jeden gen rozbity jest na macierzy na kilka sond oligonuk-leotydowych. Znakowanym materiałem jest antysensowny RNA (cRNA) o sekwencji komplementarnej do sond. W celu otrzymania cRNA, po wyizolowaniu z materiału biologocznego RNA, przepisuje sie˛ jego sekwencje˛ na cDNA w reakcji odwrotnej transkrypcji. W procesie tym ilos´c´ cza˛steczek ulega zwielokrotnieniu w wyniku liniowej amplifikacji. Otrzymany cDNA słuz˙y jako matryca do transkrypcji in vitro, w wyniku kto´rej powstaje cRNA i jest do niego doła˛czana biotyna. Taki biotynylowany cRNA poddaje sie˛ hybrydyzacji z sondami na macierzy, a naste˛pnie jest znakowany np. za pomoca˛ kompleksu streptawidyny z fikoerytryna˛ – barwnikiem fluorescencyjnym. W pojedynczym eksperymencie, w od-ro´z˙nieniu od mikromacierzy cDNA, badamy tylko jedna˛ pro´bke˛. Poziom fluorescencji zestawu oligonukleotydo´w obrazuja˛cych dany gen jest rozpatrywany jako poziom ekspresji tego genu.
Hybrydyzacja pro´b badanych z mikromacierzami cDNA i mikrochipami DNA zachodzi w specjal-nych komorach podczas kilkunastogodzinnej inkubacji. Analiza efekto´w hybrydyzacji wymaga wczes´-niejszego wymycia niezwia˛zanych fragmento´w pro´b (ryc. 2).
M i k r o e l e k t r o n i c z n e m a c i e r z e. Dzie˛ki elektronicznemu poła˛czeniu kaz˙dego oczka mikro-macierzy z komputerem i zastosowaniu elektronicznej zmiany ładunko´w, czas hybrydyzacji bio-tynylowanego RNA z sondami ulega znacznemu skro´ceniu do kilku minut oraz jest moz˙liwa bardzo szybka analiza efekto´w hybrydyzacji. Ten typ macierzy nie jest jeszcze bardzo popularny.
Z a s a d y d o b r e j p r a k t y k i w e k s p e r y m e n t a c h z z a s t o s o w a n i e m m i k r o m a -c i e r z y. Pomimo zde-cydowany-ch zalet te-chniki mikroma-cierzy, zwłasz-cza biora˛-c pod uwage˛ moz˙-liwos´c´ badania ekspresji tysie˛cy geno´w jednoczes´nie, istnieje bardzo wiele punkto´w krytycznych, kto´re rzutuja˛ na wiarygodnos´c´ otrzymanych wyniko´w. Przykładowo poro´wnano zmiane˛ ekspresji 84 geno´w podczas ro´z˙nicowania mysich embrionalnych komo´rek macierzystych przy pomocy techniki Northern blot i mikromacierzy cDNA (7). Wykazano stabilnos´c´ wyniko´w uzyskiwanych w niezmienianych warunkach przy uz˙yciu mikromacierzy, oraz udowodniono, z˙e sa˛ one poro´wnywalne z danymi uzyskanymi technika˛ Northern blot (pomimo, z˙e ekspresje˛ kilku geno´w, kto´ra˛ wykazała technika Northern blot, nie wykazała technika mikromacierzy i odwrotnie). Jednoczes´nie wskazano na pewne wady techniki mikromacierzy, kto´re wymagaja˛ korekty, np. zastosowanie odwrotnej kombinacji fluoroforo´w Cy3 i Cy5 do znakowania pro´b badanej i kontrolnej rzutuje na otrzymane wyniki. Koniecznym wydaje sie˛ dlatego zwro´cenie szczego´lnej uwagi na miejsca krytyczne i okres´lenie oraz stosowanie zasad dobrej praktyki podczas tego typu eksperymento´w (6, 8, 9).
Pierwszym strategicznym punktem jest ilos´c´ i jakos´c´ wyizolowanego RNA, gdyz˙ z´le wyizolowane lub cze˛s´ciowo rozłoz˙one pro´bki nie be˛da˛ dawały wiarygodnych wyniko´w. Zaleca sie˛ zamraz˙anie pro´bki w ciekłym azocie lub stosowanie specjalnych roztworo´w inhibitoro´w RN-azy, celem zapewnienia odpowiedniej ilos´ci, oraz oszacowanie jakos´ci wyizolowanego RNA poprzez np.: okres´lenie ewentual-nych zanieczyszczen´ czy stopnia degradacji. W sytuacji, gdy ilos´c´ RNA doste˛pnego do badan´ jest ograniczona moz˙na teoretycznie:
– poła˛czyc´ kilka pro´bek RNA otrzymanych z tej samej grupy badanej, – poprawic´ efektywnos´c´ znakowania i hybrydyzacji cDNA,
– dokonac´ amplifikacji pro´b podczas przepisywania informacji z RNA na cDNA pamie˛taja˛c jednak, z˙e stopien´ powielenia powinien byc´ ograniczony do minimum i nie powinien wprowadzac´ zmian w proporcjach pomie˛dzy poszczego´lnymi cza˛steczkami RNA (8).
Kolejnym waz˙nym etapem jest znakowanie pro´b badanych. Najpopularniejsze sposoby to: – znakowanie bezpos´rednie za pomoca˛ fluoroforo´w Cy3 i Cy5,
– znakowanie pos´rednie poprzez estry barwniko´w Cy3 i Cy5, – znakowanie dendrymerowe (8),
z kto´rych kaz˙dy ma swoich zwolenniko´w i przeciwniko´w.
Bardzo istotne znaczenia ma ro´wniez˙ samo przygotowanie mikromacierzy, gdzie wiele czynniko´w nalez˙y brac´ pod uwage˛, jak: sposo´b nanoszenia sond, rodzaj powierzchni, temperature˛ itp., oraz przebieg hybrydyzacji, dla kto´rego waz˙na jest dobra, ro´wnomierna dystrybucja roztworu hybrydyzacyjnego (6, 8). Dla normalizacji danych uzyskiwanych ta˛ technika˛ kluczowe znaczenie ma ro´wniez˙ wyeliminowanie obrazu tła, dlatego wskazane jest np. umieszczanie na macierzy kontroli negatywnych, tj. sond DNA, kto´re nie powinny hybrydyzowac´ z badana˛ pro´bka˛, np. geno´w ros´linnych na mikromacierzach z genami zwierze˛cymi.
Dla poro´wnania wyniko´w konieczne jest ustalenie, jaka˛ ro´z˙nice˛ w ekspresji geno´w moz˙na uznac´ za znacza˛ca˛ statystycznie – zwykle jest to ro´z˙nica dwu – czterokrotna (6).
Uzyskiwanie danych, ich analiza i interpretacja wymagaja˛ odpowiedniego zaplecza informatycznego. Rozwo´j techniki mikromacierzy DNA wymusza jednoczes´nie rozwo´j bioinformatyki, aby ogromne ilos´ci danych potencjalnie generowane za pomoca˛ mikromacierzy, mogły zostac´ przetworzone i wyko-rzystane. S
´
cisła kooperacja i wspo´lne wysiłki badaczy, statystyko´w i informatyko´w zmierzaja˛ w celu stworzenia i upowszechnienia odpowiednich bioinformatycznych narze˛dzi, kto´re usprawnia˛ stosowanie tej techniki.Z a s t o s o w a n i e m i k r o m a c i e r z y D N A w b a d a n i a c h n u t r i g e n o m i c z n y c h. Stosowanie techniki mikromacierzy DNA, kto´ra pozwala na pomiar poziomo´w mRNA tysie˛cy ro´z˙nych geno´w jednoczes´nie, znajduje coraz cze˛stsze zastosowanie w badaniach z˙ywieniowych. Jest to bardzo uz˙yteczna metoda biora˛c pod uwage˛ złoz˙onos´c´ efekto´w, jakie składnik diety wywiera na organizm. Moz˙na wyro´z˙nic´ kilka podstawowych kierunko´w badan´ z˙ywieniowych, w jakich moz˙na zastosowac´ matryce DNA (9). Macierze DNA moga˛ dostarczyc´ danych na temat mechanizmo´w lez˙a˛cych u podstaw korzystnych lub szkodliwych efekto´w oddziaływania na organizm danego składnika z˙ywnos´ci lub modelu diety. Moga˛ takz˙e słuz˙yc´ do okres´lania optymalnej ilos´ci danego składnika, kto´ra wywoła poz˙a˛dany efekt pro zdrowotny w danej subpopulacji. Okres´lenie profili ekspresji geno´w moz˙e ponadto pomo´c zidentyfikowac´ waz˙ne geny, białka lub metabolity, kto´re ulegaja˛ zmianie w stanie przed-chorobowym i moga˛ słuz˙yc´ jako biomarkery, gdyz˙ wczesne rozpoznanie zmian na poziomie molekular-nym przed wysta˛pieniem zmian klinicznych moz˙e pomo´c zapobiec wysta˛pieniu choroby, lub zmniejszyc´ cie˛z˙kos´c´ jej objawo´w. Jednak podstawowym zastosowaniem macierzy DNA jest poznanie i scharak-teryzowanie podstawowych szlako´w, poprzez kto´re składniki diety wpływaja˛ na regulacje˛ ekspresji geno´w.
Zaleta˛ uz˙ycia mikromacierzy, zwłaszcza zawieraja˛cych sondy obrazuja˛ce cały genom, jest brak koniecznos´ci stawiania hipotezy badawczej poprzez szacowanie, jakie waz˙ne geny czy szlaki sa˛ modulowane przez dany składnik (9). Rzeczywista˛ wartos´cia˛ danych uzyskiwanych z badania profili ekspresji geno´w nie jest okres´lenie listy wielu geno´w, kto´re sa˛ regulowane przez dany składnik diety, ale moz˙liwos´c´ okres´lania na jej podstawie całkowitych zmian biochemicznych zachodza˛cych w organizmie pod wpływem tego czynnika. Zastosowanie techniki mikromacierzy DNA w badaniach interakcji genom – z˙ywnos´c´ moz˙e przyczynic´ sie˛ do okres´lenia molekularnych podstaw oddziaływania składniko´w pokarmu na procesy zachodza˛ce w organizmie, zwłaszcza te zwia˛zane z rozwojem ro´z˙norodnych choro´b, a w przyszłos´ci do bardziej s´wiadomego stosowania z˙ywnos´ci w prewencji i leczeniu choro´b.
A. B i a ł e k, A. T o k a r z
DNA MICROARRAY TECHNIQUE IN GENE EXPRESSION STUDIES. Part II
PIS
´
MIENNICTWO1. Gillies P.J.: Nutrigenomics: The Rubicon of molecular nutrition. J. Am. Diet. Assoc. Suppl.2 2003; (103)12: S50-S55. – 2. Nowicka G.: Geny, z˙ywienie, zdrowie. Gdzie jestes´my i doka˛d zmierzamy. Z
˙
yw. Człow. Metab. 2001; 28(3): 247-253. – 3. Roberts M.A., Mutch D.M., German J.B.: Genomics: food and nutrition. Curr. Opin. Biotechnol. 2001; 12: 516-522. – 4. Kaput J., Rodriguez R.L.: Nutritional genomics: the next frontier in the postgenomic era. Physiol. Genomics 2004; 16: 166-177. – 5. Liu-Stratton Y., Roy S., Sen C.K.: DNA microarray technology in nutriceutical and food safety. Toxicol. Letters 2004; 150: 29-42. – 6. Kisiel A., Ska˛pska A., Markiewicz W.T., Figlerowicz M.: Mikromacierze DNA. Kosmos 2004; Tom 53, 3-4 (264-265): 295-303. – 7. Taniguchi M., Miura K., Iwao H., Yamanaka S.: Quantitative Assessment of DNA Microarray – Comparison with Northern Blot Analyses. Genomics 2001; 71: 34-39. – 8. Garosi P., De Filippo C., van Erk M., Rocca-Serra P., Sansone S.A., Elliott R.: Defining best practice for microarray analyses in nutrigenomic studies. Br. J. Nutr. 2005; 93: 425-432. – 9. Hirschi K.D., Kreps J.A., Hirschi K.K.: Molecular Approaches to Studying Nutrient Metabolism and Function: An Array of Possibilities. J. Nutr. Suppl. 2001; 1605S-1609S.Adres: 02-097 Warszawa, ul. Banacha 1.