Uwarunkowania strukturalne inhibitorów „mechanism-based”

Rys.15. Przykłady grup funkcyjnych obecnych w cząsteczkach inhibitorów „mechanism-based”

cytochromów P450 (a) alkiny wewnętrzne i terminalne (b) furany i tiofeny (c) epoksydy (d) di- i trichloroetyleny (e) aminy drugorzędowe (f) benzodioksole (g) izotiocyjaniany (h) tioamidy (i) ditiokarbamaty (j) związki zawierające układ sprzężonych wiązań podwójnych (k) związki zawierające terminalne wiązanie podwójne [Kalgutkar i wsp., 2007].

W ciągu ostatnich 20 – 30 lat zidentyfikowano wiele inhibitorów „mechanism-based”

różnych izoenzymów cytochromu P450. Związki te zawierają w swojej strukturze specyficzne grupy funkcyjne, które czynią je podatnymi na metabolizm wobec cytochromów P450 w taki sposób, że powstają reaktywne, najczęściej elektrofilowe, metabolity pośrednie (Rys.15). Co więcej, inhibitory posiadające te same grupy funkcyjne mogą inaktywować enzym według odmiennych mechanizmów (rozdział III.2.2.). Miejsce wiązania się aktywnego intermediatu z

kowalencyjna którym taka pochodna została wygenerowana. Reaktywny intermediat może więc reagować z cząsteczką wody i opuścić miejsce aktywne enzymu jako nietoksyczny lub mniej toksyczny produkt. W innym przypadku może alkilować lub arylować resztę hemową, co powoduje destrukcję hemu lub reagować z nukleofilowymi resztami aminokwasowymi znajdującymi się w sąsiedztwie centrum aktywnego cytochromu P450. Wszystkie wymienione sytuacje prowadzą do nieodwracalnego zahamowania aktywności enzymu [Hollenberg i wsp., 2008].

Spośród grup związków hamujących aktywność izoenzymów cytochromu P450 na drodze autokatalitycznej inaktywacji (nieodwracalnie) należy wymienić alkiny, alkeny, furany i tiofeny. Obecność amin drugo- i trzeciorzędowych oraz benzo-1,3-dioksolu jest natomiast typowa w strukturze chemicznej inhibitorów quasi-nieodwracalnych, które inaktywują enzym tworząc MIC.

 Alkiny (acetyleny).

Do tej grupy związków należą liczne inhibitory „mechanism-based” izoenzymów cytochromu P450, aczkolwiek z powodu wysokiej reaktywności ich metabolitów pośrednich dokładny mechanizm hamowania aktywności enzymów nie został jeszcze poznany.

Rys.16. Proponowane mechanizmy nieodwracalnej addukcji alkinów do apoproteiny i hemu cytochromu P450 (schemat zaczerpnięty z pracy [Blobaum, 2006]).

Transfer atomu tlenu na terminalny atom węgla cząsteczki alkinu generuje pochodną, która ulega przekształceniu w reaktywny keten. Intermediat ten może ulec hydrolizie z wytworzeniem stabilnego produktu metabolizmu, kwasu karboksylowego albo reagować z resztami aminokwasowymi w centrum aktywnym enzymu, co prowadzi do inaktywacji białka (szlak a). Wprowadzenie atomu tlenu na wewnętrzny atom węgla cząsteczki alkinu prowadzi, poprzez cząsteczkę oksyrenu, do powstania reaktywnego metabolitu pośredniego, który powoduje kowalencyjną modyfikację hemu (szlak b) (na podstawie [Ortiz de Montellano, 1985, 1991]).

W przypadku alkinów terminalnych utlenianych na zewnętrznym atomie węgla przyjmuje się, iż proces inaktywacji zachodzi za pośrednictwem reaktywnego ketenu, który stanowi miejsce ataku nukleofilowych atomów reszt aminokwasowych obecnych w centrum aktywnym enzymu. Wprowadzenie atomu tlenu na wewnętrzny atom węgla alkinów wewnętrznych lub terminalnych pociąga natomiast za sobą pojawienie się pochodnej oksyrenu, która powoduje alkilację hemu na atomach azotu pierścienia porfirynowego (Rys.16) [Ortiz de Montellano, 1985, 1991; Foroozesh i wsp., 1997]. Wśród leków zawierających nienasycone wiązanie potrójne węgiel-węgiel jako nieodwracalne inhibitory

„mechanism-based” izoenzymu CYP3A4 zostały zidentyfikowane, m.in. 17α-etynyloestradiol [Lin i wsp., 2002], gestoden [Guengerich, 1990] i mifepriston [He i wsp.,1999]. W grupie pochodnych alkinów spotykane są ponadto inhibitory „mechanism-based”, które powodują w pewnym stopniu odwracalną inaktywację białek P450 [Blobaum i wsp., 2005, 2006].

Zbadano, iż architektura miejsca aktywnego enzymu oraz lokalizacja i odległość kluczowych dla procesu inhibicji reszt aminokwasowych od cząsteczki inhibitora może być wyznacznikiem „odwracalności” bądź nieodwracalności MBI. Istotne znaczenie wydaje się też mieć rozmiar i chemiczny charakter samego inaktywatora. Poznanie enzymatycznych i chemicznych wymagań obserwowanej „odwracalności” MBI przyczyniłoby się do lepszego zrozumienia procesu inaktywacji izoenzymów cytochromu P450 w układach biologicznych.

 Furany.

Rys.17. Schemat katalizowanej przez CYP2E1 reakcji bioaktywacji furanu [Kalgutkar i wsp., 2007].

Pierścień furanu spotykany jest w cząsteczkach wielu leków i produktów naturalnych (furanokumaryn). Prawdopodobnie, przekształcenia w obrębie tej struktury prowadzą do metabolitów, które są odpowiedzialne za ich wysoką toksyczność (hepatotoksyczność i kancerogenność) oraz podatność na różnego rodzaju niepożądane interakcje lek-lek. Ze względu na obecność bogatego w elektrony ugrupowania aromatycznego pochodne furanu łatwo ulegają procesowi utlenienia z utworzeniem elektrofilowego metabolitu pośredniego – furan-2,3-epoksydu. Dalsze przemiany metaboliczne mogą prowadzić do otwarcia pierścienia i powstania ostatecznego produktu, jakim jest cis-2-buten-1,4-dial [Chen i wsp., 1997; Byrns i wsp., 2002]. Obydwa produkty metabolizmu furanu mają zdolność alkilacji

reszt aminokwasowych na heteroatomach. Cytochromy P450 ulegają zatem inaktywacji poprzez modyfikację ich części białkowej. W ten sposób hamowana jest, m.in. aktywność CYP1A2 przez furafilinę [Kunze i Trager, 1993], CYP2A6 przez mentofuran [Khojasteb-Bakht i wsp., 1998] oraz CYP3A4 przez L-754 394, inhibitor proteazy wirusa HIV [Lightning i wsp., 2000].

 Alkiloaminy.

Rys.18. Schemat katalizowanych przez cytochromy P450 reakcji utleniania dialkiloaminoalkilo-podstawionych związków do pochodnej nitrozowej tworzącej kompleks z jonem żelaza centrum porfirynowego białek P450 (opracowanie własne na podstawie [Riley i wsp., 2007]). Prekursorem analogu nitrozowego mogą być aminy pierwszo- lub drugorzędowe. W przypadku amin trzeciorzędowych pierwszym etapem przemian jest katalizowana przez cytochrom P450 reakcja N-dealkilacji, po której następuje utlenianie i hydroliza do N-hydroksyloaminy drugorzędowej. Produkt ten jest dalej przekształcany do N-tlenku iminy (nitronu), który ulega hydrolizie do N-hydroksyloaminy pierwszorzędowej. Podczas dwuelektronowego utleniania cytochrom P450 przekształca N-hydroksyloaminę pierwszorzędową w reaktywną pochodną nitrozową, która tworzy stabilny kompleks z jonem Fe(II) hemu cytochromu P450 [Murray, 1997].

Ugrupowanie alkiloaminowe jest elementem struktury cząsteczek wielu klas związków terapeutycznych (m.in. leków przeciwhistaminowych, leków przeciwdepresyjnych, antybiotyków makrolidowych) i związków naturalnych. Efektywność oraz skuteczność alkiloamin jako inhibitorów „mechanism-based” różnych cytochromów P450 jest natomiast bardzo zróżnicowana. Proponuje się, że aminy drugo- i trzeciorzędowe w obecności izoenzymów cytochromu P450 ulegają kilku kolejnym reakcjom dealkilacji, utleniania i hydrolizy (Rys.18). Końcowym produktem tych przemian może być pochodna nitrozowa, która poprzez tworzenie kompleksu z jonem żelaza hemu cytochromu P450 (MIC) może

odpowiadać za zahamowanie aktywności enzymu [Murray, 1997; Murray i Murray, 2003].

Jak dotąd, nie wykazano jednak jej obecności w mieszaninie reakcyjnej. Tworzenie kompleksu P450-Fe(II)-reaktywny metabolit pośredni w obecności NADPH zachodzi bardzo szybko, podczas gdy proces nieenzymatyczny przebiega powoli. Istnieje także pewna specyficzność w kompleksowaniu metabolitu pośredniego przez niektóre białka P450: nie wszystkie izoenzymy cytochromu P450 reagują z reaktywnym intermediatem z jednakową wydajnością. Przykłady związków zawierających ugrupowanie alkiloaminowe, których produkty pośrednie zdolne są do tworzenia koordynacyjnych kompleksów z jonem żelaza grupy prostetycznej cytochromu P450, szczególnie CYP3A4, to werapamil, diltiazem [Yeo i Yeo, 2001], troleandomycyna i erytromycyna [Periti i wsp., 1992; Yamazaki i Shimada, 1998].

 Benzo-1,3-dioksole (metylenodioksyfenyle).

Związki zawierające ugrupowanie benzo-1,3-dioksolu często hamują aktywność cytochromów P450 poprzez tworzenie MIC z enzymem. Przykładem takich inhibitorów izoenzymów CYP3A4 i CYP2D6 są odpowiednio: paroksetyna, selektywny inhibitor zwrotnego wychwytu serotoniny, oraz tadalafil, inhibitor fosfodiesterazy-5 [Ring i wsp., 2005;

Bertelsen i wsp., 2003]. Mechanizm inaktywacji białek P450 przez pochodne benzo-1,3-dioksolu nie został jeszcze dokładnie wyjaśniony, istnieją wszakże przesłanki, iż to reaktywny i elektrofilowy karben, powstający w wyniku usunięcia atomu wodoru z metylenowego atomu węgla lub eliminacji cząsteczki wody z pochodnej hydroksymetylenowej, tworzy stabilny kompleks z atomem żelaza hemu białka cytochromowego (Rys.19). Podobnie, jak w przypadku alkiloamin, kompleks ten wykazuje charakterystyczne maksimum absorbancji w widmie UV-vis przy około 455 nm.

Rys.19. Schemat reakcji prowadzących do inaktywacji cytochromu P450 przez związki zawierające benzo-1,3-dioksol [Kalgutkar i wsp., 2007].

katechol

katechol chinon

karben tworzenie MIC

kowalencyjna modyfikacja

Drugi szlak przemian metabolicznych pochodnych benzo-1,3-dioksolu prowadzi do powstania, poprzez katechol, orto-chinonu, który ze względu na właściwości elektrofilowe może reagować z nukleofilowymi resztami aminokwasowymi makromolekuł komórkowych, np. białek P450. Tę alternatywną drogę inaktywacji enzymu wykorzystują, m.in. saflor i 3,4-metylenodioksymetamfetamina (MDMA, ekstaza) [Bolton i wsp., 1994; Wu i wsp., 1997].