Badania nad poznaniem molekularnego mechanizmu przemian metabolicznych pochodnych imidazoakrydonu rozpoczęto od badań ich związku wzorcowego, 2-hydroksyakrydonu, w warunkach modelowych wobec enzymów utleniających – peroksydaz (w tym peroksydazy z korzenia chrzanu – HRP i ludzkiej mieloperoksydazy – MPO) [Mazerska, 2003]. Dysponując wiedzą na temat mechanizmu utleniania 2-hydroksyakrydonu przeprowadzono następnie analogiczne badania nad aktywacją enzymatyczną związku C-1311 [Mazerska i wsp., 2003]. Wyniki tych badań, jak również badania produktów reakcji elektro- i fotochemicznych [Mazerska i wsp., 1997, 2002] pozwoliły poznać możliwe kierunki przemian aktywacyjnych i miejsca reaktywne w cząsteczce badanej pochodnej imidazoakrydonu. Otrzymane produkty metabolizmu stały się związkami wzorcowymi w dalszych pracach, które skupiły się nad metabolizmem C-1311 zachodzącym wobec różnych enzymów frakcji mikrosomalnej pochodzącej z komórek wątroby szczura i człowieka, w szczególności cytochromów P450 [Wiśniewska i wsp., 2007]. Badania te miały na celu poznanie całościowych przemian, czyli aktywacji i detoksykacji, jakim związek C-1311, jako potencjalny chemoterapeutyk, będzie ulegał w organizmie pacjenta.
Cytochromy P450 uczestniczą przede wszystkim w pierwszej fazie przemian ksenobiotyków w organizmie. Szczególny i niezwykle ważny jest ich udział w metabolizmie wielu leków [Smith i wsp., 1997; Guengerich, 2006]. Po pierwsze, niektóre leki zostają przekształcone do ich formy farmakologicznie czynnej dopiero po transformacji przez te enzymy. Z drugiej strony, pod wpływem izoenzymów cytochromu P450 może nastąpić efekt wręcz przeciwny, dający zmniejszenie aktywności lub całkowitą dezaktywację związku biologicznie czynnego. Zdarza się także, iż powstające metabolity są toksyczne dla organizmu. Natomiast w terapii wielolekowej często dochodzi do interakcji pomiędzy dwoma lub więcej podawanymi farmaceutykami. Konsekwencją tego zjawiska może być zanik działania jednego z nich, gdy inny lek hamuje aktywność enzymu odpowiedzialnego za metabolizm drugiego [Wrighton i Stevens, 1992]. Z tych powodów niezmiernie ważne jest zbadanie podatności potencjalnego leku na przemiany wobec różnych enzymów metabolizujących, jak również poznanie jego wpływu na aktywność katalityczną enzymów, co z kolei pozwoliłoby na ustalenie ewentualnych oddziaływań lek (badany związek)-lek.
Wobec powyższego, dalsze badanie przemian metabolicznych zsyntetyzowanej w zespole Profesora Konopy przeciwnowotworowej pochodnej imidazoakrydonu, C-1311, jest szczególnie uzasadnione, zważywszy, że związek ten ma szansę zostać nowym lekiem przeciwnowotworowym.
Celem niniejszej pracy doktorskiej było zatem, z jednej strony, poznanie molekularnego mechanizmu przemian metabolicznych odpowiedzialnych za działanie przeciwnowotworowe oraz toksyczność wybranej pochodnej imidazoakrydonu, z drugiej strony, określenie, które grupy enzymów metabolizujących pierwszej i drugiej fazy metabolizmu biorą udział w przemianach związku C-1311 w organizmie pacjenta.
Realizacja przedstawionego celu obejmowała następujące zadania badawcze:
Określenie podatności związków C-1311 i C-1330 na transformacje metaboliczne wobec wybranych enzymów metabolizujących obecnych we frakcji mikrosomalnej komórek wątroby.
Poznanie szlaków przemian metabolicznych mogących mieć miejsce w organizmie różnych pacjentów jest niezbędne dla każdego leku a zwłaszcza leku przeciwnowotworowego. Wynika to ze zjawiska polimorfizmu genów enzymów metabolizujących, które powoduje, że metabolizm leków u każdego człowieka przebiega w sposób odmienny i specyficzny [Guengerich, 2006]. Przeprowadzone w ramach niniejszej pracy badania nad metabolizmem C-1311 zachodzącym wobec różnych enzymów mikrosomalnych obecnych w komórkach wątroby oraz badania struktur produktów tych reakcji enzymatycznych dążyły do poznania możliwych kierunków przemian aktywacyjnych i/lub detoksykacyjnych jakim związek ten, jako potencjalny lek, będzie ulegał w organizmie pacjenta.
Badania dla analogu strukturalnego C-1311 z grupą metoksylową zamiast hydroksylowej w pozycji 8 pierścienia imidazoakrydonu, związku C-1330, miały na celu ustalenie potencjalnych właściwości substratowych tej grupy związków wobec różnych enzymów metabolizujących, a określenie różnic w metabolizmie C-1311 i C-1330 wskazałoby na jedną z przyczyn ich różnej aktywności przeciwnowotworowej.
Poznanie wpływu związku C-1311 na aktywność enzymów metabolizujących pierwszej fazy metabolizmu, głównie z rodziny cytochromów P450.
Określenie efektu działania potencjalnego leku na funkcjonowanie enzymów uczestniczących w procesach biotransformacji jest istotne ze względu na interakcje zachodzące pomiędzy różnymi lekami [Wrighton i Stevens, 1992]. Poznanie biochemicznych i molekularnych mechanizmów hamowania bądź indukcji aktywności białek P450 jest szczególnie ważne w terapii wielolekowej, gdyż na tej podstawie można przewidzieć czy i w jaki sposób zmieni się efekt leku podawanego razem z lekiem będącym inhibitorem lub
induktorem enzymu. Określenie tych mechanizmów dla potencjalnego leku przeciwnowotworowego, związku C-1311, było głównym zadaniem badawczym prezentowanej pracy doktorskiej.
Obserwacje przemian metabolicznych związków C-1311 i C-1330 w komórkach ludzkich nowotworów wątroby.
Realizacja tego etapu pracy doktorskiej miała na celu poznanie profilu przemian metabolicznych badanych pochodnych imidazoakrydonu w jednym z miejsc ich oczekiwanego działania terapeutycznego i jednoczesne porównanie go ze zbiorem metabolitów uzyskiwanych podczas przemian C-1311 i C-1330 w wielu różnych układach modelowych. Badania te zostały przeprowadzone na liniach komórkowych ludzkiego raka wątroby, HepG2 i Hep3A4. Ta ostatnia charakteryzuje się wyższym niż w innych komórkach nowotworowych poziomem ekspresji genu izoenzymu CYP3A4.
Zbadanie czy związek C-1311 ma wpływ na poziom enzymów P450 w komórkach nowotworowych.
Wyniki takich badań mogłyby zostać wykorzystane w terapii przeciwnowotworowej w świetle opisywanych w literaturze różnic pomiędzy poziomem ekspresji genów enzymów metabolizujących w komórce zdrowej i nowotworowej oraz w świetle różnic ekspresji genów tych enzymów u poszczególnych pacjentów.
Jednym z zagadnień badawczych było więc sprawdzenie czy i jak C-1311 wpływa na funkcjonowanie izoenzymów cytochromu P450 w miejscu oczekiwanego działania związku w terapii, czyli w komórkach nowotworowych, głównie w komórkach ludzkiego nowotworu wątroby, HepG2, stanowiących bogate źródło białek P450.
Podsumowując, wyniki badań podejmowanych w prezentowanej pracy doktorskiej poszerzą dotychczasową wiedzę o przemianach metabolicznych C-1311, który może wkrótce stać się lekiem przeciwnowotworowym. Dostarczą one, m.in. wskazówek jak przyszli pacjenci, wykazujący międzyosobnicze różnice w sposobie biotransformacji leków, zareagują na C-1311. Przyczynić się więc mogą do planowania nowoczesnej wielolekowej terapii przeciwnowotworowej z udziałem badanego związku, w tym dodatkowo terapii ukierunkowanej na poszczególnych pacjentów.