Walidacja procedury analitycznej oznaczania fluoru w postaci fluorku wapnia za pomocą spektroskopii TXRF

Walidacja procedury analitycznej oznaczania fluoru w postaci fluorku wapnia za pomocą spektrometrii TXRF obejmowała wyznaczenie:

 liniowości,

 zakresu pomiarowego,

 czułości,

 granicy wykrywalności (LD – ang. limit of determination),

 granicy oznaczalności (LQ– ang. limit of qualification),

 powtarzalności,

 granicy powtarzalności,

 dokładności,

 dokładności z uwzględnieniem niepewności pomiaru.

Powyższe parametry walidacyjne odnoszą się do wapnia, a nie fluoru, ponieważ walidowana procedura analityczna dotyczy pośredniego oznaczania fluoru w postaci fluorku wapnia.

8.4.1. Liniowość, zakres pomiarowy i czułość

Liniowość wyznaczono wykorzystując krzywą kalibracyjną wyznaczoną na podstawie pomiarów sześciu roztworów wzorcowych analitu o wzrastającym stężeniu a sygnałem odpowiedzi detektora wyrażonym jako iloraz pola powierzchni piku analitu i pola powierzchni wzorca wewnętrznego. Użyte stężenia roztworów wzorcowych zostały tak dobrane, aby obejmowały oczekiwane stężenia analitu w próbkach rzeczywistych.

Wartość współczynnika regresji liniowej krzywej kalibracyjnej była miarą liniowości.

W celu stwierdzenia występowania statystycznie istotnych różnic między współczynnikami równania regresji liniowej użyto testu t-Studenta. Hipotezą zerową było stwierdzenie braku istotnie statystycznej różnicy między uzyskaną wartością danego współczynnika a zerem.

Hipotezą alternatywną było stwierdzenie występowania istotnych statystycznie różnicy między uzyskaną wartością danego współczynnika a zerem.

86

Zakres pomiarowy wyznaczono jako przedział między najniższym a najwyższym stężeniem jakie mogą zostać oznaczone z założoną precyzją, dokładnością i liniowością.

Czułość detektora natomiast wyznaczono jako współczynnik kierunkowy wykresu kalibracyjnego [Namieśnik i Konieczka 2007].

Relacja między zawartością analitu we wzorcach a sygnałem detektora charakteryzuje bardzo silna korelacja liniowa (r = 0,9951; p < 0,05) opisana równaniem funkcji o wzorze:

y = 5,1847 x – 0,0255 (Rysunek 26). Potwierdzono, że wartość współczynnika kierunkowego tej krzywej jest statystycznie istotnie różna od 0 oraz wartość wyrazu wolnego statystycznie istotnie nie różni się od 0 (Tabela 9). Na tej podstawie wyznaczono zakres pomiarowy procedury wynoszący od 0,15 mg Ca do 0,45 mg Ca oraz czułość procedury równą 5,1847 mg Ca.

0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40

Zawartość Ca we wzorcach (mg)

Rysunek 26. Wyznaczenie liniowości odpowiedzi detektora spektrometru TXRF w stosunku do zawartości wapnia we wzorcach (mg) na podstawie krzywej kalibracyjnej

Tabela 9. Analiza statystyczna obliczonych współczynników równania regresji liniowej przy pomocy testu t-Studenta

Równanie regresji y = 5,1847 x – 0,0255 współczynnik kierunkowy a

wartość a 5,1847

przedział ufności a 4,8593 – 5,5102

test t-Studenta: p 0,00

wyraz wolny b

wartość b – 0,0255

przedział ufności b – 0,0667 – 0,1178

test t-Studenta: p 0,56

87 8.4.2. Granica wykrywalności i oznaczalności

Granicę wykrywalności stosowanego urządzenia pomiarowego wyznaczono na podstawie wzoru (9) zgodnie z zaleceniami producenta spektrometru TXRF [Bruker 2007].

W tym celu wykonano osiem niezależnych oznaczeń dla serii ośmiu przygotowanych niezależnie próbek o zawartości analitu równego 10 µg Ca ∙ dm^-3.

LD = ^{3,3 C}_N^{i √Nbg}

Innym sposobem obliczenia LD jest wyznaczenie bezwymiarowej wielkości stosunku sygnału do szumu (S/N – ang. signal to noise ratio) zgodnie z wzorem (10) [Hyk 2016].

S/N = ^{Ci ∙ SDS/N}

Granicę oznaczalności przyjęto jako trzykrotność wyznaczonej uprzednio granicy wykrywalności [Namiesnik i Konieczka 2007], tj. zgodnie ze wzorem (11).

LQ = 3 LD (11)

gdzie:

LQ – granica oznaczalności (µg ∙ dm^-3), LD – granica wykrywalności (µg ∙ dm^-3).

Na podstawie wzorów (9), (10) i (11) wyznaczono odpowiednio granicę wykrywalności i granicę oznaczalności (Tabela 10). Granica wykrywalności wynosiła 4,52 µg Ca ∙ dm^-3 albo 0,11 µg Ca, w zależności od zastosowanej metody obliczania tego parametru walidacyjnego (za pomocą wzorów odpowiednio (9) i (10). Wyznaczona wartość granicy oznaczalności była trzykrotnie większa i wynosiła odpowiednio 13,56 µg Ca ∙ dm^-3 i 0,32 µg Ca.

88

Tabela 10. Wartości granicy wykrywalności i oznaczalności obliczone na podstawie wzorów (9), (10) i (11)

Parametr

8.4.3. Powtarzalność i wpływu stanu skupienia analitu na parametry opisujące powtarzalność oznaczeń

Powtarzalność procedury analitycznej wyznaczono jako odchylenie standardowe z sześciu niezależnych pomiarów próbek na poziomie stężeń odpowiadających stężeniu analitu w próbkach rzeczywistych. Obliczono również wartość współczynnika zmienności i wyznaczono granicę powtarzalności (rpow) (wzór (12)), która z 95% prawdopodobieństwem określa wartość nie przekraczającą wartości bezwzględnej różnicy między dwoma pojedynczymi wynikami pomiarów [Hyk 2016].

rpow = 2,8 ∙ SD (12)

gdzie:

rpow – granica powtarzalności (g ∙ g^-1),

SD – odchylenie standardowe serii pomiarów (g ∙ g^-1).

W celu wyjaśnienia powodu nie w pełni satysfakcjonującej wartości powtarzalności procedury analitycznej, do badanych próbek zawierających wapń w postaci CaF2 dodano 125 µg selenu w formie roztworu Se(NO3)4, aby sprawdzić jak zmieni się wartość parametrów walidacyjnych opisujących powtarzalność procedury, gdy analitem będzie pierwiastek znajdujący się w roztworze właściwym (w odróżnieniu do wapnia, który znajduje się w fazie stałej).

W Tabeli 11 przedstawiono parametry walidacyjne charakteryzujące powtarzalność procedury analitycznej. Powtarzalność procedury analitycznej wynosiła 0,065 g Ca ∙ g^-1, a współczynnik zmienności był równy 16,94%. W przypadku, gdy oznaczanym pierwiastkiem był selen obecny w roztworze właściwym, powtarzalność i współczynnik zmienności są niższa o jeden rząd wielkości i wynoszą odpowiednio 0,005 g Se ∙ g^-1 i 3,94%.

89

Tabela 11. Parametry walidacyjne charakteryzujące powtarzalność procedury analitycznej oraz porównanie tych parametrów dla próbek zawierających dodatek 125 µg selenu

Stwierdzono o jeden rząd wielkości niższą precyzję wyników pomiarów w przypadku analizy próbek stałych niż wyników pomiarów próbek ciekłych. Obserwowane różnice mogły wynikać z dwóch czynników. Po pierwsze przygotowana zawiesina próbki jest niejednorodna przez co pobieranie jej pipetą może prowadzić do pobieranie niereprezentatywnej porcji próbki względem całości próby. Po drugie naniesiona na dysk pomiarowy porcja próbki może mieć niehomogeniczny rozkład, co również wpływa na obniżenie precyzji procedury analitycznej.

8.4.4. Dokładność

Dokładność stosowanej procedury analitycznej sprawdzono przez oznaczenie analitu w materiale odniesienia z certyfikowaną zawartością składników (fluoryt GBW 07253 (Fluorspar)), w sześciu niezależnych pomiarach przez sprawdzenie, czy uzyskana wartość różni się istotnie statystycznie z wartością odniesienia przy pomocy testu t-Studenta [Namieśnik i Konieczka 2007]. Hipotezą zerową było stwierdzenie braku istotnie statystycznej różnicy między uzyskaną wartością zawartości analitu a wartością odniesienia. Hipotezą alternatywną było stwierdzenie występowania istotnych statystycznie różnicy między uzyskaną wartością zawartości analitu a wartością odniesienia.

W Tabeli 12 umieszczono porównanie wyników pomiarów materiału odniesienia z certyfikowaną zawartością składników uzyskanego za pomocą walidowanej procedury analitycznej z rzeczywistą zawartością wapnia w badanym materiale. Potwierdzono, że brak jest statystycznie istotnych różnic w oznaczonej ilości wapnia za pomocą walidowanej procedury analitycznej a rzeczywistą wartością tego pierwiastka w tym materiale.

Tabela 12. Porównanie wyników pomiarów materiału odniesienia z certyfikowaną zawartością składników z rzeczywistą wartością bez uwzględnienia wartości niepewności pomiarów

Średnia zmierzona zawartość

Parametr walidacyjny Wapń (analit) (ciało stałe) Selen

(ciecz; roztwór właściwy)

SD (g ∙ g^-1) 0,065 0,005

CV (%) 16,94 3,94

granica powtarzalności (g ∙ g^-1) 0,18 0,01

90