Asocjacja flawin w roztworach wodnych

H, Grajek

ASOCJACJA FLAWIN W ROZTWORACH WOONYCH

W celu zbadania wpływu asocjacji flawln FMN 1 RF na elek-tronowe widno absorpcji tych barwników wyznaczono stężeniowy zależność współczynnika ekstynkcji t(\, c) w zakresie stężeń od 10~s «ol/l do 10~* ®ol/l. Zaobserwowano zmianę widm ab-sorpcji wra* ze wzrostem stężenia barwnika. Punkt Izobesty- czny dla \ ■ 490 nn wskazuje na istnienie równowagi między monomerami 1 dinerami w roztworze. Ola poszczególnych stężert FMN określono temperaturę, w której zaczyna się proces dime- ryzacjl.

Wstęp

Flawiny należę do zwlęzków biologicznie czynnych. W natural-nych etrukturach biologicznatural-nych łączę eię z białkami tworzęc kom-pleksy zwane flewoprotelnaal. Ryboflawina (RF) - vltsmlna 8z ,

Jako flawomononukleotyd FMN, spełnia rolę koenzymu w enzymach flawinowych. Aktywność biologiczna flawln może być wyjaśniona przez dokładne pozrsnl* struktury elektronowej stanu podstawowego 1 wzbudzonego. Osetnio ukazało się wielo prac dotyczących od-działywań flawln z protein#*»! [i, 2] 1 aminokwasami [3], o po- kazujęcych wpływ tych kompleksów na elektronowe widmo absorpcji 1 emisji flawln. Prowadzone sę również badania procesu asocjacji flawln. w którym dwie molekuły barwnika oddziałuję ze sobę po-przez wlęzania wodorowe [4] lub po-przez utworzenie kompleksu C-T [5, 6]. Struktura tych dinerów oraz mechanizm ich tworzenia nie sę Jasno wytłumaczone. Niektórzy autorzy twierdzę, że flawiny two-rzę "vertically stacked" kompleksy. S a r t s a i K a i n o -s h o [8J na pod-stawie badart NMR utworzyli dwa modele pow-st-swa-

powstswa-nie takich dimerów, w których dwie molekuły tworzgce "sandwich" eę przesunięte względem siebie.

3ak dotęd nie ma prac ukazujących wpływ dimeryzacji na elek-tronowe widmo eboorpcji flewin. w tym celu zbadano atężeniow«

zależność elektronowych widm absorpcji RF i FMN oraz zależność

temperaturowę współczynnika abeorpcji a —(vT) dla X. » 510 na z entyotokosowskiego przedziału wzbudzenia,

Metody

Zmierzono widmo absorpcji flewomononuklaotydu CjyH^N^NaOgP (f m n) firmy Fluka AG w zakresie etęZeA od 10”5 aol/1 do 10 3 mol/l oraz ryboflawiny CjL7H2CN4°6 T 0DH Cheaical Ltd En-glond w zakresie stężert od 10 ^ «ol/l do 6 • 10 * aol/1 w bu- forze fosforanowym CpH 7) używając spektrofotometru "Opton* PMO MM 12 O wypoeatonego w termostatowany obudowę do kuwet. Poalar absorpcji przeprowadzono w temperaturze 2°C i 60°C,

Dla wybranej długości foli X » 510 na z przedziału anty- stokesowekiego zmierzono temperaturowy zależność współczynnika absorpcji dla kilku stężeń FMN i RF w zakreeie temperatur od 2°C do 70°C. Uwzględniono poprawkę na termiczno rozszerzalność kuwety i roztworu.

Wynlkl 1 dyskusja

Elektronowe widma flawin RF i FMN zaleniej« się wraz za stężeniem (rye. 1 , krzywe 1-3, dla FMN). Podobna zaiany wy-kazuję widma RF. Punkt izobaetyczny występuJęcy przy \ » 490 ¿władczy o istnieniu równowegi między dimerami i aonoaaraai w roztworze. W temperaturze 50°C widma absorpcji FMN dla stężo-nego i rozcieńczostężo-nego roztworu prawi« pokrywaj« aię Crye. 2), co świadczy o tym, Ze w tak wysokiej temperaturze dla«ry ule-gły dysocjecji. Maksimum widma różnicowego Crye. 1, krzywa 4) otrzymanego z różnicy widm absorpcji roztworu o aaksyaalnya i minimalnym etężeniu leży w antyetokesowskia przedziale wzbudza-nia flawin (dla FMN X Q0 - 490 n m ). W zwięzku z tya na

te»-Rys. 1, Stężeniowa zależność współczynnika ekstynkcji e(A., c) FMN w temperaturze 2 0 w buforze fosforanowym CpH 7)

Concentration dopendence of the extinction coefficient e(X, c) of FMN at a teaperature of 2°C In phosophate buffer (pH 7)

peraturowę zależność współczynnika absorpcji monomeru tym przedziale będzie alał wpływ proces dlmaryzacjl.

Zgodnie z pra;f [9] współczynnik monomerowej absorpcji a m (\*T) związany z Jednofotonowy* przejście» singlet-alnglet może być wyrażonyt

» # (v. T) • a Q(v )*exp

f

kT

(

)

gdziet '5oo * częstość elektronowego przejścia między etanem pod-stawowym a wzbudzonym Sj^i

v? - częstość światła wzbudzającego; fi - etała Planca:

k - stała Boltz^ana; t - temperatura w K.

1.0

- 0.9

i 08

£ 0.7

£

0.6

0.4

02

FMN

_

j

temp 60 °C

1 -c = 10"5mol/l

2-c =10*3mot/l

\

350

400

450

500 Mrvn

600

600

200

Ry<*. 2. Stężeniowa zależność współczynnika ekstynkcji e( X, c) FMN w temperaturze 60°C w buforze fosforanowym (pH 7)

Concentration dependence of the extinction coefficient e(\, c) of FMN at a temperature of 60°C in phoeophate buffer (pH 7>

Ponieważ częstość antyetokeaowakiego wzbudzenia v eza niż V_ (tf <oo " ^oo^ *«PĆłczynnik absorpcji a„(v, T) wykazywać silno akeponencjslnę zależność od 1/T. Po

jeat mniej- będzle zlogerytmo-wsniu wyrażenia (1) o trzystu jeny t

in « (VT)

_{~ ï --- T}

(

)

wykres funkcji Ir* T) w zależności od 1/T jee.t linią proste o współczynniku kierunkowy» a * **b('>00**’i)/k. Ola FMN za-leżność ta przy wzbudzaniu k * SIO na pokazana jeet na rys. 3. Współczynnik absorpcji monomeru maleje ze spadkiem temperatury. Absorpcja dimeru wzrasta ze spadkiem temperatury. Odchylenie od liniowości wskazuje na pojawienie elę dlmerów w roztworze.

Ina

7.5

7.4

7.3

7.2

7.1

70

6.9

6.8

6.7

Rye. 3. Wykres zależności In amod 1/1 dla kilku stężeń FMN bu-for fosbu-foranowy (.pH 7)

Plot of the dependence of lnom on 1/T for several concentration of FMN in phosophate buffer (pH 7)

Na podstawie wykresu, dla poszczególnych stężert pmn określono temperaturę, w której zaczyna się proces di^eryzacjis dla c^- » 10"^ »ol/l temperatura ta wynosi temp. * 53 C, dla c ■» 10 noi/1, temp. ■ 45°C oraz dla c • 10 A mol/5, temp. ** 22°C. Widać, te temperatura t* rośnie wraz ze wzrostom stężenia. Stwierdzono, że w pokojowej temperaturze istnieje dimery przy stężeniach więk-szych nli 10~4 «o1/1.

l i t e r a t u r a

[1] Y u n g-0 o C h o i M c C o r m i c k B. O., Archiv. Blochea. Biophys. 204, 41-51 (i960).

[2] W • l • h C., F i s h o r 0., J a c o b s o n P„, S p • n c e r R., [im] Flawins and Flawoprotelns. eds. K U i n o Y a g l , T o s h i o Y a m a n o , Tokio (1980).

[ 3 ] u l b r y c h K., Zeaz. Nauk. ART Olsztyn, Technologie 2yvmo6cl 15, 3-14 (1979).

[4] « ii 1 1 • r F., S t • p h • n G.t Blochealstry 12. 4654-4662 (.1973).

[ 5] P o r t e r O, 3. T., Lin t] Flawlns and Flawoprotelns, eds. K u l n o Y e g l , ‘ T o e h l e Y e a a n o, To-kio (1980).

[6] Gibson, M e e s s y V,, Altherton, Blochea. 3, 85, 569 (1962). [7] S »' r a » R. H., D a n n l s s P., K a p ł a n N. a, Blochemtetry 7, 4359-4367 (1968). [.8] K s l n o s h o M., K y o g o k u Y., Blochealstry 11, 741-752 (1972). ’ [9j 3 a 1 n R. K., 0. Appl. Phys. 44, 3157-3161 (1973).

Instytut Fizyki 1 Cheall Żywności Akademia Rolniczo-Techniczna w Olsztynie

H. Grajek

FLAVIN ASSOCIATIONS IN AQUEOUS SOLUTIONS

In order to deteralne the effect of eeeoclatlon of flavin* (FMN end RF) on the electron obeorpflon epectra of these dyes, co-ncentration dependence of the abaorptlon coefficient e(Jl.c)«ae studied In the concentration range 10 5 aol/1 up to 10-® aol/1.

A chenge In absorption epectra was observed with increese of the dye concentration. An lsoebeetlo point et X » 490 na indica-tes an equilibrium between dlaere and aonoaers In the solution. For chosen FMN concentrations teaperaturee of onset of the diae- rizstion process were deterained.