Chemische omzettingen bij de bestraling van nucleïnezuren met ultraviolet licht

CHEMISCHE OMZETTINGEN

BIJ DE BESTRALING VAN NUCLEINEZUREN

MET ULTRAVIOLET LICHT

PROEFSCHRIFT

TER VERKRJjGING VAN DE GRAAD VAN DOCTOR IN DE TECHNISCHE WETENSCHAP AAN DE TECH-NISCHE HOGESCHOOL TE DELIT OP GEZAG VAN DE RECTOR MAGNIFICUS DR. R. KRONlG, HOOG-LERAAR IN DE AFDELING DER TECHNISCHE NA-TUURKUNDE, VOOR EEN COMMISSIE UIT DE SE-NAAT TE VERDEDIGEN OP WOENSDAG 26

OKTO-BER 1960 DES NAMIDDAGS TE 2 UUR

DOOR

ROBERT BEUKERS SCHEIKUNDIG INGENIEUR GEBOREN TE S'-GRAVENHAGE

HOOFDSTUK I

ALGEMENE INLEIDING

1. Historische inleiding.

Uit vele onderzoekingen. vooral verricht in de laatste tijd. is duidelijk gebleken dat het blootstel1.en van micro-organismen,aan ultraviolette stralen (U. V.)' in bepaalde gevallen de levensver-,

richtingen in belangrijke mate kan beïnvloeden. Hoewel de eerste. hiermee verband houdende. publicatie dateert van 18771• is de be-langstelling voor dit 'onderwerp juist d'e laatste decennia sterk toegenomen. Deze ontwikkeling moet ten dele worden toegeschre-ven aan de intensieve bestudering van het werkingsmechanisme van röntgenstralen. Er kan namelijk enige overeenkomst worden geconstateerd in de verschijnselen na bestraling van het micro-organisme met U. V. of röntgensti-alen. Daarnaast is het onder-zoek gestimuleerd door een steeds grotere toepassing van de ste-riliserende werking van U. V. in de industrie en de geneeskunde. Ook voor de microbiologie en de genetica is de bestudering van de werking van U. V. van betekenis. omdat het mogeli~k is geble-ken met behulp van deze straling bepaalde mutanten te I bereiden".

Tenslotte heeft de recente, snelle ontwikkeling van nieuwe appa-ratuur er toe bijgedragen dat een .dergelijk onderzoek sterk ver-eenvoudigd en in de meeste gevallen eerst nu mogelijk werd.

De vóór deze periode in de literatuur verschenen artikelèn (tot ongeveer 1930) bepalen zich in hoofdzaak tot een beschrijving van de waargenomen verschijnselen. waarbij dan vaak de gebruikte omstandigheden onvolledig zijn opgegeve,n. Voor overzichten wordt vervy~:z;en naar de artikelen van DUGGAR2. ELUS en medewerkers3

en LOOFBOUROW4.

De bestudering van de werking van U. V. op de verschillende micro-organismen vindt in de laatste dertig jaar hoofdzakelijk plaats door a. bepaling van actiespectra.

b. gebruik te maken van bepaalde mutanten. c. het gedrag na te gaan van eenvoudige

organis-men als virussen en bacteriofagen,

1. A. DOWNES, T.P. BLUNT, Proc.Roy.Soc.Londonl2.(1877) 488

2. B. M.DUGGAR in Biological Effects of Radiation, ed. B. M.Duggar, McGraw Hill Book Cy. luc. New York. (1936) 1119

3. C. ELLIS, A.A. WELLS, E. F. HEYROTH, The chemica I action of ultraviolet rays. Reinhold Publ.Corp. New York (1941)

4. J. R. LOOFBOUROW, Growth !,g. suppl. (1948) 77 •

• Daar het merendeel der recente literatuur over de nucleinezurenen de bestralingsproeven in de engelse taal is geschreven en de algemeen toegepaste afkortin$en op de engelse termen zijn ge6aseerd hebben wij deze, om verwarring te vermijden, ook hler gebruikt. De betekenis van 'de in dit proefschrift voorkomende afkortingen is:

U. V. ultra violette straling (2537 A) 1. R. infrarood

D.N.A. desoxyribonucleinezuur N.M.R. kern magnetische resonantie R. N. A. ribonucleinezuur

IPT bestralingsproduct van thymine

IPMT gemethyleerd bestralingsl'roduct van thymine

De inschriften in de figuren zijn soms in de engelse taal gesteld omdat deze afbeeldingen ook bedoeld zijn voor publicaties en lezingen.

en

d. de invloed op bepaalde nucleinezuur-preparaten te onderzoeken,

e. vervolging van dè beïnvloeding van de eiwit- en nucleinezuur-syntheses,

f. modelproeven.

Ad. a. Een actiespectrum voor een bepaald verschijnsel wordt verkregen door de effectiviteit na te gaan irl afhankelijkheid van de golflengte. Het eerste actiespectrum voor de lethale werking van U. V., bepaald bij

Mieroeoeeus pyogenes (var. aureus) ,

werd in 1928 door Gates gepubliceerd 5. Deze onderzoeker vestigde reeds de aandacht op de overeenkomst die er bestaat tussen een derge-lijk actiespectrum en het absorptiespectrum van de nucleinezuren

6,7,8. • Ook andere bacteriën vertonen eenzelfde actiespectrum en

het is later gebleken dat bij schimmels, gisten, bacteriofagen en virussen een overeenkomstige afhankelijkheid van de golflengte bestaat. Niet alleen de lethale werking, ook andere effecten, als mutatie en faag-inductie, hebben een dergelijk actiespectrum. Voor een overzicht hiervan wordt verwezen naar het boek van

HOLLAENDER9, terwijl het belang van deze gelijkvormigheid zal worden besproken op p.24.

Ad. b. De werking van U. V. op bepaalde mutanten maakt de be-studering van de oorzaak van de wisselende gevoeligheid bij mi-cro-organismen mogelijk. Men kan op deze wijze onderscheid ma-ken tussen verschillende effecten. Een duidelijk voorbeeld hiervan is het verschil tussen het gedrag van

Eseheriehia eoli

B en de meer stralingsresistente mutant hiervan Eseheriehia eoli B/r. De laatste kan uit cultures van de eerste worden verkregen door selectie; in dit geval dus door bestraling met een hoge dosis U. V.

10,11. Het verschil in de gevoeligheid voor U. V., zoals dat weer-gegevenis in figuur 1, kon in verband worden gebri:1c.:ht met de in-vloed van de temperatuur. Wanneer beide bacteriestammen ge-kweekt werden bij verhoogde temperatuur (45°C) en vervolgens bestraald met U. V., dan lopen de inactiverings-curven niet meer uiteen 12. Dit betekent dat bij

Eseheriehia eoli

B een effect door

bestraling optreedt dat afhankelijk is van de temperatuur. De mutant B/r vertoont dit verschijnsel niet. De laatste laat derhalve een minder gecompliceerd beeld van inactivering zien en zal in bepaalde gevallen meer geschikt zijn voor de bestudering van de werking van U. V. 13.

Ad. c. Tegen het eind van de vorige eeuw werden de eerste virus-sen ontdekt. Zowel IVANOVSKI in Rusland als BEUERlNCK in

Neder-5. F.L, GATES, Science~(1928) 479 6. F.L. GATES, J.Gen.Physiol.ll(1929) 231

7. F.L. GATES, J.Gen.Physiol. 13 (1929) 249 8. F.L. GATES, J.Gen.Physiol. 14(1930) 31

9. A.HOLLAENDER, Radiation Biology Il, Ultraviolet and related radiations, McGrawHillBook Cy Inc. New York (1955)

10. E.M.WITKIN, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S. 32(1946) 59

11. E.M.WITKIN, Genetics, 32(1947) 221

-12. bv. W.HARM, W.STEIN, Z.Naturforsch. 8b(1953) 123 13. W.STEIN, W.HARM, Z.Naturforsch. lOb (1955) 519

-7-0.1

OO'~_"""T""_-.-_-....O~,_--,-_~

_{300 600 900 1200 I~ 1800}

[t,S per mm2

Figuur 1. Gevoeligheid van E. coU B en E. eoU B Ir voor U. V (volgens WITKIN 11) • land toonden aan dat het sap van een, door een bepaalde ziekte (tabaksmozaiek-ziekte) aangetaste, plant nog infectieus was, als de bacteriën door filtratie (bacteriefilter) verwijderd waren. Na ver-betering van de microscopen, eerst door gebruik te maken van ultraviolet licht, later door elektronen als "lichtbron" toe te pas-sen, gelukte het aan te tonen, dat deze filtreerbare infectieusiteit wordt veroorzaakt door zeer kleine deeltjes. die virussen werden genoemd. Omstreeks 1925 werden de afbeeldingen verkregen van enkele grote virussen; in 1938 publiceerden VON BORRIES en RUZKA de eerste fotol _{s van dergelijke deeltjes, gemaakt met behulp van} een elektronenmicroscoop. Inmiddels was door d' HERELLE in 1917 aangetoond dat ook bacteri~n hun virusziekten hebben en hij noem-de noem-de hiervoor verantwoornoem-delijke noem-deeltjes bacteriofagen. De virussen en bacteriofagen, waarvan op het ogenblik vele typen bekend zijn, zijn in wezen niet verschillend. Beide zijn zeer klein en bestaan voor het grootste deel uit nucleoproteinen. Zij kunnen zich slechts vermeerderen wanneer zij In een levende cel voor-komen en men strijdt nog steeds over de vraag, of deze

organis-men levend .of dood genoemd moeten worden. Men gebruikt daarom

de benaming "actief" i.p.v. "levend" om aan te geven, dat het deeltje nog in staat is in een gastheercel de vorming van nieuwe gelijke deeltjes te induceren. De activiteit van een gegeven "cul-tuur" kan in bepaalde gevallen slechts worden gemeten met be-hulp van proefdieren. Daarnaast heeft men echter de beschikking over eenvoudiger methoden. Het aantal actieve faagdeeltjes in een oplossing kan worden bepaald door deze ite spreiden over een met bacteriën geënte plaat. Op de plaats waar een faagdeeltje terecht komt treedt een opheldering op. Op deze wijze kan men fagen "tellen". De activiteit van het vaècin van influenza virus kan wor-den bepaald door na te gaan tot welke verdunning een gegeven sus-pensie nog in staat is ruue bloédlichaampjes te agglutineren

(haem-agglutinatie) 14.

,-Door hun eenvoudige b r ' waardoor complicaties ten gevolge

van omringende celbestanddelen voor. een goed deel zijn verdwe-nen. zijn virussen zeer geliefde objecten voor de bestudering van bepaalde vraagstukken. Omdat het mogelijk is de aètiviteit van fagen te verminderen door bestraling met U. V .• worden zij ook in dit onderzoekingsgebied gebruikt. In deelS van dit hoofdstuk zal op de hierbij bereikte resultaten worden teruggekomen.

Ad. d. NU"C!leinezuren zijn. zoals nog nader zal worden uiteenge-zet, van groot belang voor de levende cel. Zij hebben zeer waar-schijnlijk te maken met de overdracht van de eigenschappen van het 9rganisme op het nakomelingschap. Het was derhalve van· zeer groot belang voor de wetenschap dat het in 1928 aan GRIFFITH . ge-lukte het vermogen van een bepaalde pneumococcus mutant om eenkapsel te vormen over te dragen op een andere mutant van de,... zelfde stam.15 Dooor werk v·an latere onderzoekers is gebleken dat bij deze overdracht. welke transformatie wordt genoemd, een polymere substantie van de donor-bacterie naar de acceptor-bac-terie wordt overgevoerd. Overzichten van de ontwikkeling van dit onderzoek zijn o. m. gepubliceerd door ZAMENHOF16 en °1WACKER17.

De getransformeerde substantie is gelsoleerd en het mag nu wel als vaststaand worden aangenomen dat het een verbinding is van het nucleinezuurtype . . We bezitten in de biologische activiteit van dergelijke agentia een kriterium om de invloed van verschillende factoren op ee~ nucleinezuur

in vitro

na te gaan. Eventuele ver-anderin~en kunnen zichtbaar worden gemaakt door het preparaat. de zgn I transformingfactor". te brengen i:r;t. een daartoe geschikte bacterie. Ook de invloed van U. V. is op deze wijze bestudeerd. De resultaten van deze onderzoekingen zullen worden besproken in deel 5 van dit hoofdstuk,

Ad. e. Door bestraling met U. V. kan de nucleinezuur- en/9f

eiwit-synthese worden geremd. Eenzelfde resultaat kan worden

verkregen met behulp v~ bepaalde verbindingen, remstoffen. Het

vergelijken van de invloed van deze stoffen en van U. V. kan soms tot nuttige conclusies leiden. Daarnaast kan men belangrijke ge-gevens verzamelen· door na te gaan weIKe gevo1gen combinatles van U. V. en remslriffen hebben op deze syntheses.

Ad. f. In het voor gaande is er reeds op gewezen dat het gelijk-·

tijdig optreden van verschillende effecten, zoals dat

in vivo

bij de bestraling van micro-organismen zeker het geval is. een gecom-pliceerd geheel van verschijnselen kan geven, waardoor de

pri-maire oorzaak verborgen blijft. Om tot verklarin~en te kunnen

komen voor de verkregen effecten moeten we derhalve zoveel mQgelijkstrevennaar een vereenvoudiging van de proefopzet. Eén van de Il).ogelijkheden hiertoe is gebruik te maken van geschikte modelproeven

in vitro.

Na het werk van SINSHEIMER, het bestu-deren van de invloed van U. V. op één van.de in de nucleinezuren voor komende verbindingen 18, 19 ,0 gaat men steeds meer over tot

15. F.GRIFFITH, J.Hyg. 27 (1928) 130 .

16. S. ZAMENHOF, Progress in Biophysics VI (1956) 85

17. A. WACKER, ChemIe der Genettk. p. 85 Springer Verlag Berlin 1959 18. R.L. SINSHEIMER, R. HASTINGS, Science.llQ (1949) 525

-9-dergelijke proeven. Deze gedachte heeft ook ten grondslag ge-legen aan het in dit proefschrift te beschrijven onderzoek.

2. Effecten van U. V. op micro-organismen.

Het merendeel van de bestralingsproeven

in

vivo

is uitgevoerd met micro-organismen (hieronder zullen worden verstaan pro-tozoën, bacteriën, schimmels, gisten, sporen en virussen). De, resultaten van fundamenteel onderzoek over de mutagene werking van U .. V. zijn bij hogere organismen slechts goed te interprete-ren, indien deze voor cytologisch onderzoek goed waarneembare chromosomen bezitten. Enkele klassieke voorbeelden zijn

Droso-Phila melanogaster

en

Zea mays.

Bij deze objecten is een

verge-lijking gemaakt met de invloed van röntgenstralen.

ván

enkele stammen van

Antirrhinum majus

(leeuwenbekje) en

Sphaerocarpus

dorinellia

(mossoort) werd de effectiviteit van verschillende golf-lengten ten aanzien van mutagene veranderingen nagegaan. Voor een overzicht mag weer worden verwezen naar het boek van HOL-LAENDER9.

De bestraling van micro-organismen met U. V. kan leiden tot een groot aantal verschijnselen die we kunnen onderverdelen in drie groepen, a. inactiveringen, b. erfelijke wijzigingen en c. niet erfelijke afwijkingen.

Ad. a. Omdat het in de meeste gevallen niet mogelijk is de on-middellijke dood bij een micro-organisme aan te tonen heeft men het begrip "inactivering" ingevoerd. Hieronder verstaat men het verlies van het vermogen tot een blijvende vermeerdering. Bij bacteriën betekent dit dat het getroffen individu geen kolonie meer kan vormen; bacteriofagen zijn niet meer in staat ophelderingen ("plaques") op een met baCteriën o~ergroeide voedingsplaat te' geven; sporen zijn niet meer tot kieming in staat etc. Er is een sterke gradatie in de beschadiging te onderkennen bij een wijziging van de grootte van de dosis en van de golflengte. Hoge doses lei-den tot een snel afsterven, wat geconstateerd kan worlei-den aan het stopzetten van de .groei, de deling, de ademhaling en andere le-vensuitingen. Cellen, die door een lage dosis getroffen zijn, kun-nen zich dikwijls nog enkele malen delen, alvorens zij ten gronde gaan 20. Bij virussen en bacteriofagen kunnen nog meer stadia worden onderscheiden.' Met toenemende dosis verdwijnt bijvoor-beeld bij het influenza virus eerst het vermogen tot reproductie, vervolgens de toxiciteit voor de gastheer, daarna de mogelijkheid genetisch materiaal uit te wisselen met andere virussen in de gastheer en tenslotte de eigenschap rode bloedlichaampjes te ag-glutineren 21. De bij bacteriofagen in afhankelijkheid van de dosis

verdwijnende eigenschappen zijn: ó.dsorptie aan de bacterie, lethale effect t. a. v. de gastheer, destructiviteit t. o. v. het kern-materiaal van de bacterie, remming van de nucleinezuur- en ei-wit-synthese van de bacterie, nieuwvorming van faagdeeltjes (te

20. L.W. LABAW, V.M. MOSLEY, R.W.G. WUCKOFF, Bioch.Bioph.Acta 5(1950) 327

-constateren na openbreken van de bacterie)22, 23. Het lethale ef-fect van U. V. blijkt sterk atbankelijk van de omstandigheden. Herstel kan namelijk worden belemmerd door het ontbreken van bepaalde bouwstoffen in het medium. Ook een te rijk medium kan echter schadelijk zijn. Een door straling beschadigd micro-orga-nisme blijkt soms in staat tot vervanging resp. regeneratie van de getroffen celbestanddelen, wanneer de groei ent of deling door be-paalde oorzaken onmogelijk is (actief resp. passief herstel). Een stimuleren van de groei kan derhalve in bepaalde gevallen tot een ongewenste labiele toestand leiden. Ingeval de DNA-synthese wordt geremd, terwijl de eiwit- en RNA-synthese normaal door~aan, ontstaat een dergelijke instabiele toestand ("unbalanced growth ') 24 . In het verhinderen van de groei zou een verklaring kunnen worden gevonden voor de beschermende werking tegen U. V. van verschil-lende gifstoffen als koolmonoxyde 25, ar senaat 26,27 , streptomy-cine 28, kaliumcyanide 29, natriumazide 26 etc. Door toevoeging van genoemde stoffen wordt het metabolisme ti~delijk geheel of ge-deeltelijk stilgelegd, zodat "unbalanced growth' niet op kan treden. Het dientengevolge tot rust gedwongen organisme kan zich dan her-stellen van de UV schade en doorgroeien, wanneer de toegevoegde gifstoffen zijn uitgewerkt of verwijderd. Tenslotte kunnen in een medium stoffen voorkomen in een bepaalde concentratie die niet schadelijk is voor de normale micro-organismen maar wel voor de door U. V. beschadigde.

Behalve door factoren in het medium kan ook door andere oor-zaken het al of niet optreden van inactivering worden beïnvloed. Een hoger overlevings-percentage na bestralen met U. V. is in be-paalde gevallen te constateren, wanneer daarna een belichting met zichtbaar licht wordt toegepast (fotoreactivering)30. Wijzigingen in het inactiverings-percentage kunnen verder optreden door ver-anderen van de kweektemperatuur 31. Als gevolg van deze mogelijk-heden tot herstel door secundaire factoren moet de werkelijke, directe afsterving door U. V. vele malen kleiner worden gesteld, dan uiteindelijk wordt waargenomen.

Ad. b. Wanneer een verandering in het erfelijk patroon ontstaat, dan spreken we van een mutatie. In de meeste gevallen is de wijzi-ging gering. Een te' ingrijpende verandering zal het micro-orga-nisme meestal immer.g niet meer levensvatbaar maken en dan heb-ben we met een bijzonder geval van inactivering te doen: de le-th ale mutatie. Bij micro-organismen komt een mutatie vrijwel steeds tot uiting in het al dan niet meer nodig hebben van een be-paalde stof in het voedingsmedium, het optreden van een bebe-paalde resiotentie of het te voorschijn komen van een, eerder niet aan-wezige, gevoeligheid voor schadelijke verbindingen (we kunnen 22. S.E. LURlA, M. DELBRUCK. Arch.Bloch.-1.(1942) 207

23. S.E. LURJA, M.L. HUMAN, J.Bact . ..@.(1950) 551

24. S.S. COHEN. H.D. BARNER, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.40 (1954) 885 25. R.B. MEFFERD jr. T .S. MATNEY, Sclence 115 (1952) 116

26. S.D. WAINWRIGHT, A. NEVILL, Can.J.Microbiol. 1 (1955) 416 27. D. Bll.LEN, Arch.Bioch.Blophys. 21(1957) 333

-28. R.F. KIMBALL, Rad.Research..,l!.(1958) 138

29. V.G. BRUCE, o. MAAL<*:. Bloch.Biophys.Acta 21 (1956) 227

30. A. KELNER. J.Bact. 58 (1949) 511

-11-hieronder ook bacteriofagen rangschikken). Daarnaast kan een mu-tatie aanleiding geven tot een morfologische verandering. Wanneer de wijziging zeer gering is of wanneer er geen reactie OP aanwe-zig is zal de mutatie onopgemerkt blijven. In tegenstelling tot de inaetivering j s de werkelijke mutatie-frequentie in het algemeen

hog-er dan wordt waargenomen Dikwijls merkt men eerst bij se-lectie deze mutanten, die men "slapende mutantenlt

zou kunnen noemen-, op ëm het blijkt dat in een gegeven populatie bijna altijd wel eeu individu voorkomt met de, voor een bepaald onderzoek ge-wenste, eigenschap.

Ad. c. De mate, waarin de inactivering en de mutatie tot uiting komen, is sterk afhankelijk van de omstandigheden, waaronder het betreffende micro-organisme voór, tijdens en ná de bestraling verkeert. De gevoeligheid voor U. V. wordt onder meer bepaald door de zuurgraad 32, het groei stadium, het aanwezir zijn van be-paalde enzrnen op het tijdstip van de bestraling 33, ,het

vocht-gehalte 35,3 , de temperatuur 37, de ouderdom van de cultuur etc, 9 Op grond hiervan is het niet te verwonderen dat onder gunstige omstandigheden een herstel van een groot deel van de be-schadigingen nog mogelijk js en dat juist deze derde groep, die van de niet-erfelijke veranderingen, bijzonder groot is, Naast de bedoelde reactiveringen kan in bepaalde gevallen fotoreactivering optreden. Dit verschijnsel, al even genoemd, is in 1949 ontdekt door KELNER 30, . Herstel langs deze weg is niet altijd mogelijk; slechts bepaalde organismen vertonen deze eigenschap. Het me-chanisme van de fotoreactivering is nog duister. Voor overzich-ten van dit onderwerp wordt verwezen naar het artikel van DUL-BECCO in het boek van HOLLAENDER9 en de publicatie van IAGGER38 .

Fotoreactivering van bacteriofagen en virussen buiten de gast-heercel is nog nimmer aangetoond 39. Het is wel gelukt "trans-forming factor" te fotoreactiveren, wanneer gelijktijdig een ex-tract van een bacterie wordt toegevoegd 40. Behalve, het lethale ef-fect kunnen ook de remming van de DNA-synthese, de remming van de celdeling en de verhoging van de mutatiefrequentie, opge-treden als gevolg van U. V. bestraling, door belichting gedeelte-lijk worden teniet gedaan 41-47 •

In deze groep van niet erfelijke verschijnselen horen onder meer thuis: de remming van de celdelin~, waardoor draadvormige

cel-32. R.S. WEATHERWAX. I.Bact. 72 (1956) 329

33. I.E. OGG. H.l. ADLER, M.R, ZELLE. I. Bact. ~(1956) 494 34. S. MlTTLER, I.A. LAVERTY, Nature 171 (1953) 793

35. R. W. KA PLAN , Naturwissensch. 42 (1955) 184

36. R. W. KAPLAN, CH. KAPLAN, Exptl.Cell.Res. 11 (1956) 378 37. w. STElN, W. HARM, Naturwissensch. 39 (1952) 113

38. I. IAGGER. Bact.Rev. 22 (1958) 99 39. R. DULBECCO, I.Bact. 59 (1950) 329

40. C.S. RUPERT, S.H. GOODGAL, R.M. HERRIOTT, I. Gen.Physiol41 (1958) 451 41. H.B. NEWCOMBE, Genetics 35 (1950) 682

42. H.B. NEWCOMBE, H.A. WHlTEHEAD. I. Bact. §.! (1951) 243 43, A. KELNER,'Bact.Proc. P14(1949)

44. A. KELNER, Bull.N. Y .Acad.Med. 26 (1950) 189 45. A. KELNER, I.Bact. 65 (1953) 252

46. M. ERRERA, Brit.I.Radiol. 27 (1954) 76

len ontstaan 48-51 ; de tijdelijke kernsegregatie 52,53; de

vertra-ging in de faagproductie 54; de verstoring van de nucleinezuur~

entof eiwit-synthese 55 ; het verlies van het vermogen adaptieve

enzymen te vormen 56; de vertraagde' adsorptie van

bactériofa-gen; de beïnvloeding van de ademhaling; het onbeweeglijk worden; het verdwijnen van de luminescentie en nog enkele andere, minder

vaak voorkomende verschijnselen 9.

3. Hypotheses over de werking van U. V. op micro-organismen.

In de loop der jaren zijn een aantal hypotheses opgesteld over

het werkingsmechanisme van U. V. stralen. Bij een acceptabele hypothese moeten uiteraard de gemaakte veronderstellingen in overeenstemming zijn met de experimentele gegevens. Niet alle

opgestelde hypotheses voldeden aan deze eis. Vooral de'

verkla-ring van het verloop van de overleving als functie van de b_e~t:ra­

lingsdosis baarde veel zorgen, omdat niet alleen de opmerkelijk

grote snelheid van de afneming, maar ook de vorm van de curve, voor verschillende micro-organismen onderling sterk afwijkt (zie

bijvoorbeeld figliur 1). Men kan tweètypen overlevings-krommen

onderscheiden:

a. met een exponentieel verloop (bijvoorbeeld~!j

Escherichia

coli B)

waarbij één treffer al voldoende is voor de

ina:cti-vering (" single hit 11 curve);

b. meteen sigmoiä verloop

(Escherichia coli

B/~)waaruit de

noodzaak voor meer treffers per cel voor inaftivering blijkt ("multiple hit" curve).

Het exponentiële verloop wordt het meest aangetroffen. Men mag echter niet te veel waarde hechten aan deze curven, omdat zij niet nauwkeurig zijn voor lage stralingsdoses, waardoor juist de primaire en dus belangrijkste inwerking optreedt. Het verdere verloop van de curve kan daarnaast sterk worden beïnvloed door de secundaire factoren, welke in het vorige deel van dit hoofdstuk (p. 11 ) al uitvoerig zijn besproken. Het is dus begrijpelijk, dat de resulterende krommen ontstaan door het gelijktijdig optreden van verschillende reacties. In de meeste gevallen zal men derhalve zeer voorzichtig moeten zijn bij het interpreteren van de experi-menteel bepaalde curven. De verschillende, in de literatuur

ver-melde, conclusies hebben o. i. dan ook weinig waarde"

Eenzelfde moeilijkheid ondervond men aanvankelijk bij de

po-gingen de geldigheid van de wet van BUNSEN-ROSCOE te bewijzen.

Deze wet bepaalt dat het effect van een bestraling niet afhanke-lijk is van de intensiteit van de straling of van de bestralingstijd alleen, maar van de in totaal toegevoerde energie. Het is

ge-48. R.A. DEERING, J.Bact. 76 (1958) 123

49. M. ERRERA-, Arch.lotem.PIiysiol. 61 (1953) ~(i7 _

50. M.R. ZELLE, A. HOLLAENDER, Radlation Bi~logy 11 (1955) 365 51. ].C. DAVIS, S. MUDD, J. Gen. Microbiol. 14 ([956) 527

52. J:.J. RYAN, P. FRlED, M.'SCHWARTZ, J.Gen.Micropiol. 11 (1954) 380 53. E.M. WITKlN, A.M. LACY, Camegie lost. of Wash. Yearbook 53 (1953-54) 241 54. R.F. HlLL, J.Bact. 71'(1956) 231

55. J.H. STUY, J.Bact:'78 (1959) 49

-13-bleken dat hieraan wel wordt voldaan, mits alle andere fac-toren constant blijven. Dit houdt in het geval van de micro-orga-nismen in dat men de bestralingstijden zeer klein moet kiezen in vergelijking tot de generatietijd 4,57.

De belangrijkste, in de loop der tijden voorgestelde, hypotheses zullen in het kort worden besproken. De effecten kunnen in prin-cipe slechts op twee manieren worden veroorzaakt. De stralings-energie kan eerst door de absorberende moleculen worden opge-nomen en vervolgens op de een of andere wijze worden door-gegeven naar andere, meer essentiële moleculen, waardoor hierin bepaalde veranderingen optreden die de directe oorzaak zijn van de waar te nemen verschijnselen (indirecte werking). In

het tweede geval wordt de stralingsenergie geabsorbeerd door de essentiële moleculen zelf (directe werking).

Algemeen wordt aangenomen dat, evenals bij het blootstellen aan röntgenstralen, een belangrijk deel van de effecten van U. V. moet worden toegeschreven aan de indirecte werking. Sommige onder-zoekers, o. m. ROBERTS en ALDOUS, hebben deze indirecte werking nader willen preciseren door de tussentijdse vorming van een cel-gif aan te nemen 58. Dit gil zou dan uit de absorberende stof ont-staan en fataal werken op bepaalde vitale celbestanddelen. Hier-bij moesten dan enkele eisen aan het voorgestelde celgil worden gesteld, zoals bijvoorbeeld een exponentiële ontleding, onafhan-kelijk van de bestraling en een zeer efficiënte werk·ing. Verder werd aangenomen dat dit celgil identiek zou zijn met waterstofper-oxyde of een organisch perwaterstofper-oxyde 59. Men heeft getracht, met behulp van deze theorie, de beschermende werking van katalase bij sommige bacteriën te verklaren 60.61 • De juistheid van deze opvatting valt echter te betwijfelen. Er is namelijk geen bescher-mende werking van katalase te constateren bij bestralen met röntgenstralen, terwijl toch mag worden aangenomen dat juist hierbij wel een peroxyde-vorming optreedt 62. De aangevoerde ar-gumenten voor de aanname, dat de indirecte werking van groot belang is bij de inactivering door U. V., zijn echter niet sterk te noemen. Herhaaldelijk tracht men de verschijnselen te vergelijken met soortgelijke effecten, verkregen na bestraling met röntgen-stralen. Hoewel in sommige gevallen inderdaad enige overeen-komst kan worden geconstateerd, moet toch direct worden gewe-zen op het totaal verschillende karakter van beide soorten stra-ling. Röntgenstralen werken in de eerste plaats ioniserend; als gevolg daarvan zullen zij elk willekeurig molecuul kunnen veran-deren of vernietigen. De vorming van radicalen door röntgenstra-len is dikwijls aangetoond. Dat radicaröntgenstra-len in staat zijn een wille-keurig molecuul te vernietigen, behoeft geen nader betoog. De meer langgolvige ultraviolette stralen kunnen evenwel uitsluitend

57. H.C. RENTSCHLER, R. NAGY, G. MOUROMSEFF, J.Bact. 41 (1941) 745

58. R.B. ROBERTS, E. ALDOUS, J.Bact. 57 (1949) 363

-59. Z.M. BACQ, Experientia.l(l951) 11

-60. R. LA TARJET, L.R. CALDAS, J. Gen. Physiol. 35 (1952) 455

61. J. MONOD, A.M. TORRIANI, M. JALIT, Compt.rend. 229(1949) 557

62. J. WEISS in M. HAlSSINSKI, Organic peroxydes in RadioliIOlogy, PergamonPressLondon

worden opgenom.en door verbindingen die een bepaald, zeer speci-fiek • .absorptievermogen bezitten (wat tot uitdrukking komt in het absorptiespectrum). Deze hoofdwet van de fotochemie is al door

EINSTEIN geform.uleerd: "a photon can inducé a photochem.ical

reaction only by being absorbed .•••.• " . Verbindingen als water. die door röntgenstraling gemakkelijk worden geïoniseerd. kunnen U. V. stralen niet of nauwelijks absorberen. Men constateert in deze gevallen slechts een omzetting wanneer kortgolvig U. V. (omstreeks 200 m,u) wordt gebruikt, daar in dit gebied enige ab-sorptie mogelijk is. De verschijnselen bij m.icro-organismen tre-den evenwel reeds op met zeer lage doses straling van ca 260 m,u en we mogen dan ook aannem.en dat de indirecte werking zeker niet zo'n belangrijke plaats inneemt bij de inactivering, als in de literatuur dikwijls wordt gesuggereerd. Een van de gebruikelijke argumenten vóor de indirecte werking is daarbij, dat men meent langs andere weg onmogeli~k het verschijnsel van de fotoreactive-ring te kunnen verklaren 3. Deze conclusie kan al voorbarig

ge-noemd worden (zie bijvoorbeeld het overzichtsartikel van SHUGAR

en WIERZCHOWSKl64), terwijl een aanname van een indirecte

wer-kingbovendien direct nieuwe veronderstellingen nodig maa,kt (ver-nietigingvanhet "celgif" door de belichting). Zolang het werkings-mechanisme van de fotoreactivering nog onbekend is, blijft het niet geoorloofd uit het verloop van dit verschijnsel con lusiés te trekken met betrekking tot wellicht geheel andere fenomenen. In verband met eigen resultaten zal nog worden teruggekomen op de indirecte werking (p. 51 ) en de fotoreactivering (p.82 ).

De hypothese van een directe werking wordt meestal aangeduid m.et de naam utreffertheoriel1

• Hierin stelt men dat een bepaald deel van de c el. ongeacht de aard en afmetinfien. gevoelig is voor de straling. Dit deel noèmt men de "target. Deze aanname kan in overeenstem.ming worden gebracht m.et de kinetic.a van de in-activeringsreactie. Hoe men zich evenwel de "target" en de wijze van beschadiging voorstelt is nooit duidelijk uitgesproken of aan het licht gebracht. Het is te begrijp.en dat deze theorie, dermate algemeen gesteld, een groot aantal mogelijkheden omvat.

LEA en medewerkers namen aan, dat de kern als "target" diende te worden beschouwd en dat de inactivering het gevolg zou zijn van eenlethale mutatie 65. Beide veronderstellingen zijn hevig bestre-den. Een uitgebreid overzicht over deze materie is gepubliceerd door ZELLE en HOLLAENDER in het boek van de laatste 9, terwijl

ZELLE bovendien nogmaals hieraan aandacht besteed heeft op een

symposium over bestralingseffecten bij cellen en bacteriën 63. Behalve beschadiging van de kern kan men ook de inactivering van bepaalde enzymen als oorzaak van de effecten van U. V. be-straling beschouwen. Hoewel eiwitten in het algemeen niet erg gevoelig zijn voor U. V. (zie bijvoorbeeld 66, 67), toonde DALE aan.

63. A. KELNER, W.D. BELLAMY, G.E. STAPLETON, M.R. ZELLE, Baet.Rev. 19(1955) 22

64. D. SHUGAR, K.L. WIERZCHOWSKI, Postepy Bioehemii.i(l958) 243

-65. D.E. LEA, Aetion of radiation in living eells, Cambridge Universiry Press, London. (1946).

66. A. KLECZKOWSKI, Bioch.J. 56 (1954) 345 67. R. SETLOW, Bioeh.Biophys.ACta 16 (1955) 444

-15-dat gezuiverde enzymen in sterk verdunde oplossing bijzonder snel w.orden geInactiveerd door rtmtgenstralen 68. In hoeverre dit effect, dat zeker een indirect effect zal zijn, ook na bestraling met U. V. optreedt, zal moeten worden afgewacht. Dergelijke enzym-inactiveringen zullen bij bestralen van micro-organismen met r<5ntgenstralen ongetwijfeld van grote betekenis zijn.

Een andere mogelijkheid is dat de opbouw van de, inderdaad zeer belangrijke, celmembranen wordt verhinderd. Recente onderzoe-kingen hebben waarschijnlijk gemaakt, dat de activering en het transport van de bouwstenen plaats vindt met behulp van bepaalde pyrimidine-dinucleotiden 69. Hoewel in de celwand zelf geen aan-toonbare hoeveelheden purine- of pyrimidine-derivaten voorko-men, kan een beschadiging van deze complexen door bijvoorbeeld U. V. een belemmering van de synthese van de celmembranen tot gevolg hebben. Een dergelijke inwerking zal zeer zeker resulte-ren in merkbare effecten.

De laatste, hier te behandelen, hypothese mag wel als de meest omvattende worden aangemerkt. Hierin wordt aangenomen dat de nucleinezuren en de nucleinezuur-achtige verbindingen de gevoelige stoffen zijn in de cel. Deze theorie mag dan ook weer als een s.oort treffertheorie worden beschouwd. Er bestaan sterke aan-wijzingen dat een groot deel van de U. V. effecten een direct ge-volg zijn van de absorptie van de stralingsenergie door deze ver-bindingen. Het is echter ook nu niet mogelijk alle verschijnselen met behulp van deze theorie te verklaren. We hebbener echter

al op gewezen dat pogingen in deze richting niet tot volledig

be-vredigend resulfaat zullen kunnen leiden, omdat altijd andere mechanismen als indirecte werkingen, enzym-inactivering e. d. een zekere rol blijven spelen. Voordat de verschillende aanwij-zingen voor de juistheid van deze theorie worden besproken, zal eerst nog een zeer kort overzicht worden gegeven van hetgeen te-genwoordig bekend is over de chemie van de nucleinezuren. 4. De nucleinezuren.

a. Voorkomen,

Nucleinezuren ZIJn voor het eerst in 18ti8 door MIESCHER in het

kernmateriaal van puscellen aangetoond. Men slaagde er in vrij zuivere preparaten te bereiden uit zalmsperma, gist en thymus-klieren. In verband met het zure karakter en het voorkomen in het kernmateriaal (kern=nucleus) werd de naam nucleinezuren door

ALTMANN ingevoerd. Later is gebleken dat de aanwezigheid in de

cel geenszins beperkt is tot de-'kern, maar dat gelijksoortige ver-bindingen ook voorkomen in het cytoplasma. Door bepaalde kleur-methoden en door gebruik te maken van de sterke absorptie van U. V. stralen door nucleinezuren werd het mogelijk de aanwezig-heid van deze stoffen in de cel onder het microscoop zichtbaar te maken. Hierdoor werd al snel duidelijk dat deze verbindingen

68. W.M. DALE, Bioch.J. 34(1940) 1367 69. F, ZILLEKEN, Fed.Proc-:-18 (1959) 966

in alle cellen voorkomen. Zij worden aangetroffen in de chromo-somen van elk organisme, in het kernmateriaal van de micro-organismen en in alle virussen. Deze ontdekking suggereert een verband tussen nucleinezuren en de overdracht van de erfelijke eigenschappen op het nakomelingschap. Hoewel dit tot op heden niet exact is bewezen, mag uit de veelheid van gegevens wel worden aangenomen dat deze veronderstelling juist is.

De localisatie van de genen of erfelijkheidsfactoren, die zich, zoals bekend, bevinden in de chromosomen, is vooral bestudeerd in de speekselklieren van

Drosophila.

Hiervoor zijn enkele rede-nen. In de eerste plaats bevatten deze klieren relatief zeer grote chromosomen, doordat wel chromosomen-delingen, maar geen cel-delingen plaats vinden. Dientengevolge blijven de nieuw ge-vormde chromosomen aan elkaar gebonden en zijn zij ook zicht-baar in de periode tussen twee delingen (interfase). Bij andere organismen zijn zij in deze fase niet te bestuderen, omdat het chromosome-materiaal dan over de cel is verspreid.

IndeDroso-Phila

chromosomen zijn zones aanwezig, loodrecht op de

lengte-richting, die zeer sterk in het U. V. absorberen. Tussen deze seg-menten bevinden zich zwak absorberende gebieden, welke uit ei-witten bestaan (figuur 2). De sterk absorberende zones blijken

op-u .... u: 1I u u IJ U U J.t U U U U 1LA W JU 17.1 at aJ,.... JU KJ DJ liJ JU

IC K ... . , . . . , . al ti -.Jf .. ril 'I Q' . .

...,

-JU DJ JU JU., 41.1 at.u.u 4U 4lJ KJ su IU IU IU

tl.l"''''

tIJ IU Rl... UI!

Figuur 2. Schets van reuzenchromosoom van Drosophila melanogaster (uit ANFINSEN 91).

gebouwd te zijn uit een combinatie van nucleinezuur en eiwit (om-streeks 10 - 30

%

nucleinezuur). De hoeveelheid nucleinezuur per cel varieert tijdens de groei, maar is op het tijdstip vlak vóór de c eIdeling juist maximaal. Aangezien de genen gedupliceerd moeten worden om een overdracht van de erfelijkheid te kunnen verklaren, ligt het voor de hand te veronderstellen, dat deze nucleinezuur-houdende zones zelf de genen zijn. CASPERSSON en SCHULTZ konden in 1938 aantonen dat bepaalde erfelijke veranderingen in

Droso-Phila

gepaard gaan met het geheel of gedeeltelijk verdwijnen van

nucleinezuur-houdende segmenten 70 •

Was dit al een sterke aanwijzing, het reeds vermelde onderzoek over de transformatie van bepaalde eigenschappen bij bacteriën, dat ongeveer in deze tijd intensief werd ingezet, maakte andere 70. T. CASPERSSON, J. SCHULTZ, Nature 142(1938) 294

-17-mogelijkheden voor erfelijkheids-overdracht zeer

onwaarschijn-lijk. De belangrijkste resultaten welke hierbij zijn bereikt, z-

ul-len nu kort worden besproken.

Transformatie van bepaalde eigenschappen is gelukt met

prepa-raten, die minder dan 0,020/0 eiwit bevatten. Eiwitsplitsende

en-zymen hebben geen invloed op het transformerend vermogen. Het is dus bijzonder onwaarschijnlijk dat de eigenschappen worden overgebracht door de eiwitfractie. Zeer kleine hoeveelheden van een, sterk gezuiverd, nucleinezuur-splitsend enzym zijn daaren-tegen al voldoende om de overdracht snel en irreversibel onmo-gelijk te maken. Hierbij kunnen magnesium ionen, die bij de in-werking van dit enzym noodzakelijk zijn, niet worden gemist. Dit feit maakt de afbraak van de transformerende stof door een ander, toevallig in het enzympreparaat aanwezig, enzym weer onwaar-schijnlijk. Door de nog te bespreken bouw van nucleinezuren zijn

een groot aantal variatiemogelijkheden voorhanden, waardoor

voldaan kan worden aan de eis dat elke erfelijkheidsfactor een ei-gen specifieke structuur bezit. De door transformatie overgedra-gen eiovergedra-genschappen zijn niet tijdelijk maar blijven behouden in het gehele nageslacht. Het grootste deel van dit werk is verricht door de scholen van A VERYen ZAMENHOF 71. 16 . De laatste toonde o. a. aan, dat chemisch aangebrachte wijzigingen in de "trans-forming factor" aanleiding geven tot het optreden van andere mu-taties bij de acceptor.

Ook uit het onderzoek met bacteriofagen en virussen is zeer duidelijk naar voren gekomen dat nucleinezuren gezien moeten

worden als de dragers van de erfelijke eigenschappen. Deze·

or-ganismen hebben een relatief eenvoudige bouw. Dit geldt in het bijzonder voor de bacteriofagen. Deze deeltjes kunnen we ons schematisch voorstellen als te bestaan uit een kern van nucleine-zuur, omgeven door een eiwithuidje. Uit het prachtige werk van

HERSHEY 72 en PUCK 73 is gebleken, dat bacteriofagen, na

ad-sorptie aan de bacterie wand, slechts hun nucleinezuur in de bac-terie brengen. Aangezien deze injectie van nucleinezuur al vol-doende is om de vermeerdering van de faag te waarborgen, kan hieruit weer worden geconcludeerd dat de erfelijkheid in het nu-cleinezuurdeel opgesloten ligt. Het is bij bepaalde virussen (ta-baksmozaiek-virus) gelukt het nucleinezuur op zodanige wijze van het eiwit te scheiden dat de activiteit van eerstgenoemde stof

be-houden blijft. Dit kon worden geconstateerd doordat het tevens

mogelijk bleek beide delen te recombineren. Het aldus 11

gerege-nereerde" virus was weer in staat tabaksplanten te infecteren. Door nu het nucleinezuur te combineren met het eiwit van een ver-want virus kon worden aangetoond dat de eigenschappen worden bepaald door het nuclemezuurdeel. Dit onderzoek is uitgevoerd

door FRAENKEL-CONRAT en medewerkers 74 Het op gelijke wijze

71. O.T. AVERY. C.M. MACLEOD. M. MACCARTY. J.Exptl.Med. 79(1944) 137

72. A.D. HERSHEY. Adv. Virus. Res. 4 (1957) 25

-73. T.T. PUCK. Cold Spring HarboursymposiaM(1953) 149

74. H. FRAENKEL-CONRAT, B.A. SlNGER, R.C. WlLLlAMS in A symposium on the chemical basis of heredity. Ed. MacElroy en Glass, The John Hopkins Press. Baltimore (1957)

geïsoleerde nucleinezuurdeel van tab aks moz ai ek-virus is door GIERER

en MUNDRY langs chemische weg veranderd 75 • Na recombinatie

bleek nu een groot deel van het niet geinactiveerde deel van de virus-suspensie erfelijk gewijzigd (gemuteerd) te zijn.

De resultaten van al deze onderzoekingen zijn sterke aanwijzin-gen, dat de erfelijke overdracht nauw verbonden is met de nucleine-zuren. Hierbij kunnen nog worden gevoegd het constant zijn van de hoeveelheid nucleinezuur, die van c el naar cel wordt over gebracht. wat voor ander kernmateriaal niet geldt en het metabolisch stabiel blijven van, voor de erfelijkheid verantwoordelijk geachte, nucleine-zuren tijdens de groei.

b. Chemische samenstelling.

Op grond van de chemische samenstelling kunnen de

nucleine-zuren in twee groepen worden verdeeld, de "RiboNucleicAcids"

(RNA) en de "DeoxyriboNucleicAcidstl _{(DNA). Vroeger meende}

men dat de eerste uitsluitend in plantaardig materiaal (bijvoor-beeld gist) en de tweede alleen in dierlijk materiaal (bijvoor(bijvoor-beeld thymus) voor zouden komen. Dit is later onjuist gebleken. De nu-cleinezuren zijn keten-polymeren opgebouwd uit bepaalde een-heden, nucleotiden genaamd. Een nucleotide bestaat uit een puri-ne- of pyrimidipuri-ne-derivaat, een monosaccharide en een fosfaat-groep. Het monosaccharide, dat in de nucleotiden van ribonuclei-nezuren voorkomt, is ribose; in de desoxyribonucleiribonuclei-nezuren treft men daarentegen uitsluitend 2-desoxyribose aan. Op een enkele

uitzondering na (glucose in het DNA van bepaalde bacteriofagen 76)

zijn nooit andere suikers in de nucleinezuren aangetoond. Er is nog een tweede verschil in samenstelling tussen RNA en DNA.

RNA bevat als pyrimidine-derivaten uracil (1) en cytosine (TI); in

DNA komt echter in plaats van uracil thymine (III) voor. Verder

zijn in beide nucleinezuurtypen de purine-derivaten adenine (IV)

en guanine (V) aanwezig. 0 _Nf\ 0 ~~ 0 n I

•

•

"c,

~c, Á

,c,

~~,

,c,

N H-N34 SC-H N

c-

H-N C-CH₃ NI 5C"~ H-N C' '\. I

•

I

"

I

•

I i C-H , U, ,C-H

O-C{I~C-H

o-c

,

,

C-H O=C, ,C-H _{H-~~4"C,~1 N~-C~ ,,"N}

N N N N I

I _{I I H H}

H H H

I. 11. 111. IV. V.

Weergegeven zijn die tautomere vormen, welke waarschijnlijk in een waterige oplossing aanwezig zijn. Deze structuren zijn opge-steld op grond van de overeenkomst van het U. V. en I. R.

spec-trum (gemeten in D 20) van de beschouwde verbinding en eep.

ge-75. A. GIERER, K. W. MUNDRY, Nature 182 (1958) 1457 76. M.A. JESAITIS. Nature 178 (1956) 637

-19-schikt gekozen homoloog. Als voorbeeld zullen wij noemen uracil, Deze verbinding kan, afgezien van enkele zeer onwaarschijnlijke structuren waarbij de waterstofatomen op de 5 en 6 plaats zich zouden moeten verplaatsen, in de volgende vier tautomere vor-men voorkovor-men.

o

11 ,.c, H-N C-H I 11 Ü"'c, /C-H ~ H OH

"

.,.ë,

N C-H I I1 O-C C-H '~/ H OH _I LoC, N'" C-H 1 11 Ho-C C-H ~N/

Nu werden de volgende verbindingen bereid. Elk dezer heeft door de methylering een vé..3tgelegde structuur. (Me duidt een me-thylgroep aan). o 11 ,c, Me-N C-H I 11 O=C C-H 'NI'

Me

o

•

,.C, Me-N C-H I 11 MeOoC" C-H ~N" OMe

•

C, N" C-H J I o=c C-H

'N"

t!1e

Het U. V. en het 1. R. spectrum (in D20) vaneen uracil-oplos-sing stemt overeen met dat van de eerstgenoemde dimetnyl-ver-binding. Dit is één van de aanwijzingen, welke hebben geleid tot aanname van de diketo-structuur voor uracil in waterige oplos-sing 77.

Beh?lve de vijf genoemde purine- en pyrimidine-derivaten zijn nog enkele andere aangetoond, zij het meestal in zeer kleine hoe-veelheden. hl het DNA van hogere planten en dieren komt enig 5-methyl-cytosine (VI) voor 78. DUNN en SMITH hebben in RNA een reeks gemethyleerde purines, zoals 6-methy1amino-purine (VIl)

aangetoond en hierin ook de aanwezigheid van thymine, dat ge-woonlijk alleen in DNA wordt aangetroffen, geconstateerd 79. Deze kleine afwijkingen kunnen niettemin van groot belang zijn (zie p. 24 ), doch over de juiste invloed is evenwel nog niets bekend. hl de even genummerde T fagen van

Escherichiacoli,

die zich on-derscheiden, doordat zij naast desoxyribose ook glucose bevatten, is verder J6een cytosine aanwezig, maar 5-hydroxymethyl-cyto-sine (Vlm .

77. J.R. MARSHALL, J. WALKER, J.Chem,Sec; 1951, 1004 78. W,E. COHN, J.Am.Chem.Sec.12.(1951) 1539 79. D.B. DUNN, J.D. SMlTH, Bioch.J. g(1958) 627 81). G.R. WYATT, S.S. COHEN, Nature 170(1952) 1072

~H2 ;C, N C-GH3 I \I O=C C·H 'N/

•

H VI. VII. ';lH2 C, N~ C-CH20H I • O;C C·H 'N/

.

H VIII.

De purine- en pyrimidine-derivaten zijn resp. via het N 9 en N 1

ge-bonden aan het eerste koolstof atoom van het monosaccharide. Deze combinaties noemt men nucleosiden. De formules van adenine-desoxyriboside (IX) en uridine (X) zijn weergegeven.

De nucleosiden zijn in de nucleinezuren aan elkaar gebonden door eenfosfaatgroep. Deze groep is veresterd aan de hydroxylgroepen van de pentosen. Zeer waarschijnlijk is de brug gelegen tussen de C 3 en de Cs van de twee suikers (Xp.

X. o

•

C, H-N/ C-H I • o-c C-H 'N/ :HHH ,-ç-ç-Ç-<:-CH 20H , H ÖHÓH, :·---0---: purine I purine

_,

ç ç

g

l·o-~

~-O-ç 0 OH CO/OH

c/

è/ XI.

Tot '1948 heerste de opvatting dat een nucleinezuur een lang ke-ten-molecuul zou zijn, waarin bepaalde gedeelten steeds werden herhaald. Deze gedeelten, tetranucleotiden genaamd, dacht men zich opgebouwd uit de vier nucleotiden van de verschillende basen adenine, guanine, cytosine en thymine (voor RNA uracil). Nadat het gelukt was met behulp van ionenwisselaars de zeldzame aar-den te scheiaar-den, werd in hetzelfde laboratorium in Oak Ridge door COHN met succes de scheiding berroefd van de nucleotiden in het hydrolysaat van de nucleinezuren 8 • Uit dit onderzoek kwam naar

voren, dat de nucleotiden zeker niet in equimoleculaire hoeveel-heden in de nucleinezuren aanwezig zijn, wat vereist zou zijn bij de juistheid van de tetranucleotide-theorie. De uitkomst betekende dus het einde van deze hypothese. Dit resultaat kon gemakkelijk worden bevestigd nadat, door de vorderingen bij de papierchroma-tografie, ook de scheiding van de purine- enpyrimidine-derivaten zelf mogelijk werd 82. 83. Uit kwantitatieve onderzoekingen van B1. W.E. COHN in E. CHARGAFF en J.N. DAVWSON, The Nucleic Acids I. Acad. Press. New

York(1955) p. 211

82. E. VISCHER, E. CHARGAFF. J. Biol. Chem. 168 (1947) 781 83. R.D. HOTCHKISS, J.Biol.Chem. 175 (1948) alS

-21-DNA preparaten van verschillende origine kwamen evenwel enke-le nieuwe regelmatigheden naar voren, die de basis zouden vor-men voor de later door WATSON en CRICK opgestelde structuur voor desoxyribonuc leinezuur;

a. het aantal purine-moleculen is gelijk aan het aantal pyri-midine-moleculen;

b. de hoeveelheid adenine is equivalent aan die van thymine; de hoeveelheid guanine aan die van cytosine;

c. het aantal aminogroepen op de 4 (pyrimidine) en 6 (purine) plaats is gelijk aan het aantal ketogroepen op dezelfde plaats.

Dit wijst er op dat in de bouW van de DNA moleculen een be-paalde regelmatigheid bestaat, een feit. dat later door r' öntgeno-grafisch onderzoek is bevestigd en waarop wij nog terug zullen komen.

De laatste jaren is enig werk verricht over de volgorde waarin de nucleotiden voorkomen. Dit geschiedqe door de hydrolyse van de nucleinezuren niet volledig te laten verlopen, waardoor

ver-bindingen opgebouwd uit twee of meer nucleotiden ontstonden. Na scheiden hiervan bleek dat bepaalde opeenvolgingen veel vaker optrede.n dan andere. Rijen van drie of meer pyrimidine-nucleo-tiden achtereen komen vaak voor 84,85 • Op het belang van dit re-sultaat met betrekking tot ons eigen onderzoek komen wij nog te-rug.

c. Structuur.

:Oe laatste jaren zijn grote vorderingen gemaakt bij de ophelde-ring van de ruimtelijke structuur van de nucleinezuren. Door

röntgenografisch onderzoek van Wn.KINS en medewerkers werd

duidelijk dat er een grote overeenkomst bestaat tussen de

struc-tuur van DNA preparaten van verschillende herkomst 86. De

ge-gevens wez.en er op dat DNA is opgebouwd uit twee of meer po-lynucleotide-ketens, welke om elkaar heen zijn gedraaid als de strengen in een. touw. Deze rangschikking noemt men een helix. Met behulp van titratie kon worden bepaald dat deze ketens aan

elkaar zijn gebonden door waterstofbruggen 87; eenzelfde

con-clusie kon worden getrokken uit de waarneming, dat na behandeling met ureum de viscositeit en het molecuulgewicht sterk worden

ver-laagd 88. Met de verschillende experiménteel bepaalde

wetmatig-hedenmet betrekking tot het aantal purine- en pyrimidine-deriva-ten voor ogen, kwamen WATSON en CRICK tot een, sindsdien naar

hen genoemde, hypothese over de structuur van het DNA 89. Twee

polynucleotide-ketens zijn in een helix gerangschikt op dusdanige wijze, dat de purine- en pyrimidine-derivaten naar de as wijzen.

84. H.S. SHAPIRO, E. CHARGAFF, Bioch.Biophys.Acta 23 (1957) 451 85. R.L. SINSHEIMER, Science 125 (1957) 1123

86. M.H.F. Wn.KINS, A.R. STOKES. H.R. Wn.SON. Nature 171(1953) 738 .

87. R.A. COX, A.S. JONES, G.E. MARSH, A.R. PEACOCKE. Bioch.Biophys.Acta ~ (1956) 576

88. L.F. CAVALIERl, B.H. ROSENBERG, J.Am.Chem.Soc. 79(1957) 5352 89. J.D. WATSON, F.H.C. ÇRlCK, Nature 171 (1953) 737

Een purine van één keten is steetls. door middel van waterstof-bruggen. gebonden aan een pyrimidine van de andere en wel steeds adenine aan thymine en guanine aan cytosine. Deze paren zijn ruimtelijk mogelijk. wanneer zij in een bepaalde tautomere vorm voorkomen (gelijkgesteld aan die in waterige oplossing. zie p.19). Door deze aannaxne wordt voldaan aan de analytisch gevonden wet-matigheden in de relatieve hoeveelheden van de verschillende ba-sen. De schematische voorstelling van deze structuur is. naast een molecuulmodel. weergegeven in figuur 3. Hieruit kan men iien dat nog een derde keten kan worden ingevoegd. een mogehjkheid door

(n) (b)

I

r

Figuur 3. Molecuulmodel en schematische voorstelling van het model van WATSON en CRICK voor DNA (uit ANFlNSEN91).

STENT aangegrepen om tot een nieuwe hypothese van de DNA-dupli-cering te komen. De oorspronkelijke opvatting dat de twee poly-nucleotide-ketens uiteen gaan, waarna op elke een complementaire keten wordt gevormd. wordt door sommige onderzoekers betwij-feld. Met een dergelijk eenvoudig model is het bijvoorbeeld be-zwaarlijk bepaalde fenomenen als genetische uitwisseling en het verband met RNA- en eiwit-synthes·e op redelijke wijze te ver-klaren. De hypothese van STENT biedt ten aanzien hiervan meer mogelijkheden, doch aangezien een bespreking hiervan ons ver buiten het in deze dissertatie behandelde onderwerp zou voeren, zal moeten worden volstaan met te verwijzen naar de oorspron-kelijke literatuur 90 •

-23-Naast de bovengenoemde beschikt men nog over enkele andere aanwijzingen dat het model voor de structuur van DNA, gegeven door WATSON en CRICK, waarschijnlijk juist is. Door bepaalde mi-crobiologische proeven met radioactieve voedingsstoffen, door toepassing van lichtverstrooiing en titraties heeft de betreffende hypothese sterke steun gekregen (overzicht ANFINSEN 91 ). Een re-cent onderzoek van CAVALIERI en medewerkers wijst op de moge-lijkheid dat de DNA-moleculen nog weer als dimeer aan elkaar zijn gebonden 92.

OCHOA en KORNBERG en hun resp. medewerkers slaagden er in

op DNA gelijkende polymeren te verkrijgen door nucleoside-difos-faten resp. - trifosnucleoside-difos-faten samen te bren~en met bepaalde, uit bac-teriën verkregen, enzympreparaten 93, 4,95. Voor dit onderzoek is aan beide onderzoekers in 1959 de Nobelprijs verleend. OCHOA

bereidde op deze wijze o. a. ketens, bestaande uit uitsluitend ade-nine bevattende nucleotiden en toonde aan dat deze vlot combine-ren met, op gelijke wijze verkregen, thymidylzuur-ketens tot een gel-achtig polymeer met nucleinezuur-eigenschappen. KORNBERG

constateerde, dat bij het aanbieden van de vier verschillende tri-fosfaten in willekeurige verhouding toch een, op een toegevoegd DNA gelijkend, polymeer wordt gevormd.

In tegenstelling tot DNA komt RNA in enkelvoudige ketens voor. Op grond van hun localisatie en vermoedelijke functie in de cel kunnen minstE:ns drie soorten worden onderscheiden. In het kern-materiaal komt een hoog-moleculaire vorm voor (nucleair of nRNA) welke waarschijnlijk een belangrijke rol speelt bij de DNA dupli-cering 90 en bij de synthese van een tweede RNA soort (cytoplas-matisch of eRNA). Men heeft een overgang van cRNA vanuit de kern naar het cytoplasma geconstateerd 96 en men meent dat dit cRNA van belang is voor de eiwits~these 97. Tenslotte is nog een laag-moleculair RNA aangetoond ( 'soluble" of sRNA) dat mis-schien dienst doet bij de activering van de aminozuren v66r hun incorporatie in de eiwitten 98.

De veronderstelling, dat eiwitten op nucleinezuren als matrijs worden gesynthetiseerd is door GAMOV en YCAS op haar kwanti-tatieve merites

getest9~.

Door het uitsluitend mogelijk zijn van bepaalde purine-pyrimidine paren, zoals dat gesteld wordt in de hypothese van WATSON en CRICK, is de continu1teit van een een-maal aanwezige structuur bij duplicering gegeven. Aangezien er

91. C.B. ANFINSEN, Molecular basis of evolution, J. Wiley Sons New York (1959).

92. L.F. CAVALIERI, B.H. ROSENBERG, J.F. DEUTSCH, Bioch.Biophys. Research Comm. 1

(1959) 124

93. M. GRUNBERG-MANAGO, P.J. ORTlZ, S. OCHOA, Bioch.Biophys.Acta 20 (1956) 269

94. LR. LEHMAN, M.J. BESSMAN, E.S. SIMMS, A. KORNBERG, J. Biol. ChëiTi. 233 (1958)

163 en 171

-95. A. KORNBERG, Science 131 (1960) 1503

96. M. ZALOKAR, Nature 183( 1959) 1330

97. S. SPIEGELMAN , A Symposium on the chemica I basis of heredity, Ed. McElroy en Glass,

Baltimore 1957, p. 232

98. L.1. HECHT, M.L. STEPHENSON, P.C. ZAMECNIK, Proc.Natl.Acad.Sci. U.S. 45(1959)

505

--99. G. GAMOV, 1vI.yCAS, Symposium on information theory in biology, Ed. P. YOCKEY,

echter slechts vier combinatie-mogelijkheden bestaan, moet men, om het inbouwen van één bepaald aminozuur (uit een totaal van twintig) door een nucleinezuur te laten regelen, aannemen, dat minstens drie naast elkaar gelegen nucleotiden nodig zijn om de specificiteit te bepalen. Met drie nucleotiden per aminozuur zijn juist twintig mogelijkheden voorhanden, zonder dat verwarringen op kunnen treden. Tot dusverre hebben deze en dergelijke be-schouwingen nog slechts theoretische waarde (zie ook hèt artikel van SINSHEIMER 100 ).

In dit overzicht is er dus de aandacht op gevestigd dat nucleine-zuren in staat kunnen zijn de erfelijke eigenschappen door hun structuur voor het ,organisme te conserveren en dat zij tevens een belangrijke rol kunnen spelen bij de nucleinezuur- en eiwit-syn-the!3e: Voor deze hypothese bestaan nog talrijke aanwijzingen, die hier evenwel niet besproken zqllen worden. Het is, in verband met het volgende, voldoende om er op te wijzen, dat een beschadiging van nucleinezurendoor bestraling met U. V. ongetwijfeld een gro-te invloed kan hebben op de verschillende verrichtingen van de cel. 5. Nucleinezuren, gezien als tltarget tl .

Het is in de regel niet eenvoudig op directe wijze na te gaan of inderdaad een beschadigil)g van een nucleinezuur de oorzaak is voor een bepaald effect. Dit is dan ook de reden, dat er meer dan één theorie is voorgesteld voor het werkingsmechanisme van U. V.

Voor de verond~rstelling dat veranderingen in de nucleinezuren

kunnen optreden als primair gevolg van de absorptie van. stra-lingsenergie door deze polymeren, pleiten echter de volgende waarnemingen.

a. Op de overeenkomst tussen het actiespectrum van

verschil-lende effecten en het absorptiespectrum van de nucleinezuren (zie figuur 4), zoals dat kon worden geconstateerd bij vele micro":oI -ganismen, werd reeds gewezen door GATES5,6 .. 7,8. Van verschil-'lende zijden is gewaarschuwd voor het te snel trekken van con-clusies uit deze gelijkheid 9. Door LOOFBOUROW zijn een aantal

ei-sen opgesteld, waaraan moet worden voldaan4 • Enkele hiervan

zijn:

1. Een waarneembaar biologisch effect moet in het algemeen

wor-den toegeschreven aan een fotochemische verandering in een aantal moleculen van een

essentiële

verbinding,

2. De !lquantum efficiency ti van het fotochemische proces is niet

afhankelijk van de golflengte van de straling

in het gebied

van de voor de reactie verantwoordelijke absorptieband.

3. Oe reciprociteitswet ( BUN SEN - RosëoÉ wet) moet opgaan voor de tijdén, gebruikt bij de proefneming (zie ook p. 12·).

Uit nauwkeurige Pcroeven, door ZELLE en HOLLAENDER101 en ZELLE, OGG en HOLLAENDER 02 met

Eseheriehia eoli

en de colifagen Ti en T2 verricht, is gebleken dat àan de tweede eis van LOOFBOUROW in 100. ,R.L. SINSHEIMER,J.Mol.Biol. 1(1959) 218

101. M.R. ZELLE, ,A. HOLLAENDER, I.Bact. §.lt(1954) 210

-25-,

Extinction

Figuur 4. U. V. absorptiespecitllffi van DNA.

deze gevallen wordt voldaan. Het maximum van het actiespec-trum blijkt in de meeste gevallen bij een iets langere golflengte

te liggen dan dat van hei absorptiespectrum. Het

absorptiemaxi-mum van nucleinezuur wordt namelijk veroorzaakt door de ge-zamenlijke extincties van de purine- en pyrimidine-derivaten. Nu is het zeez: wel mogelijk dat een specifieke gevoeligheid van één van deze derivaten met een absorptiemaximum bij een iets langere golflengte het actiespectrum bepaalt. Hierop zal bij de bespre-king van het eigen onderzoek worden teruggekomen.

B~j enkele bacteriofagen is een enigszins afwijkend

actiespec-trum . geconstateerd 103. Naast het maximum bij 265 mf..! kan nog

een minder géprononceerde top (schouder) bij 280 mf..! worden waargenomen. Dit zou bijvoorbeeld een gevolg kunnen zijn van een

relatief grote, gevoeligheid van cytosine. Het is echter

waarschijn-lijker dat bij dit verschijnsel ook de absorptie van U. V, door eiwitten van belang is. De eiwitten absorberen in dit gebied door de aanwezigheid van tyrosine, tryptofaan en/of fenylalanine, Er zijn twee opvattingen over de rol van de eiwitten bij de stralings-verschijnselen. De eerste en vermoedelijk juiste is, dat de ener-gie wel wordt opgenomen door de eiwitten, maar vervolgens wordt doorgegeven aan de nucleinezuren, waar de inactiverende werking tot uiting komt. De tweede opvatting neemt een energieoverdracht in omgekeerde richting aan. Dergelijke overdrachten door ketens

zijn bekend 104. Bovendien zijn eiwit en nucleinezuur meestal via

waterstofbruggen verbonden tot nucleoproteinen.

Dat de gevoeligheid van nucleinezuren inderdaad wordt bem-vloed door de aanwezigheid van eiwit is gebleken uit proeven met

103. D,J. FLUKE, E.C. POLLARD, Science 110 (1949) 2'14

tabaksmozaiek-virus. Doordat het mogelijk is het nucleinezuur hiervan met behoud van activiteit te scheiden van het eiwit (zie p.17), kan men de gevoeligheid voor U. V. van de nucleinezuren van verschillende stammen vergelijken. Bij een dergelijk onder-zoek is tot uiting gekomen dat, ondanks een sterke variatie in de gevoeligheid voor U. V. van de "complete" virussen, de in activering van de nucleinezuur-fracties bij bestralen met eenzelfde dosis voor

alle stammen gelijk is 105. Deze experimenten maken duidelijk hoe

gecompliceerd en onberekenbaar de proefnemingen

in

vivo

zullen

zijn.

b. Door de ontdekking van de "transforming factors" werd even-eens de mogelijkheid gegeven, de invloed van U. V. stralen op een zeer ver gezuiverd, actief nucleinezuur

in vitro

na te gaan. Een eventuele vermindering van activiteit kan dan

in vivo

worden ge-constateerd aan een minder efficiënte overdracht van een bepaalde, genetisch vastgelegde, eigenschap. Kleine doses blijken in de regel voldoende om een transformatie onmogelijk te maken 106. Dit wil

nog niet altijd zeggen dat hierdoor de "transforming factor" is geïnactiveerd. Deze kan in principe nog in staat zijn tot over-dracht van eigenschappen waarop in het beschouwde experiment niet wordt gereageerd of die de acceptorstam reeds bezit. Men heeft een dergelijke partiële inactivering inderdaad kunnen aanto-nen door de invloed van straling na te gaan op preparaten, welke in staat waren meer dan één eigenschap over te brengen. Het was hierbij mogelijk te constateren dat er een verschil bestaat in de inactiverings-doses voor de diverse eigenschappen. Deze uit-komsten wijzen er op, dat een al dan niet tot uiting komen van een bepaalde transformatie afhangt van de gevoeligheid van het daar-mede corresponderende fragment van de nucleinezuren. De door bestraling van "transforming factors" verkregen resultaten zijn bijzonder belangrijk, daar zij steun verlenen aan de in dit proef-schrütverdedigdeveronderstelling, dat de onder invloed van U. V.

straling

in vivo

waargenomen verschijnselen waarschijnlijk voor

een groot deel worden veroorzaakt door in de nucleinezuren te-weeggebrachte veranderingen.

c. Bacteriofagen en virussen kunnen, zoals reeds enkele malen is aangehaald, eveneens worden geïnactiveerd door U. V. Nucleine-zuren spelen hierbij zeer waarschijnlijk weer de hoofdrol. Dit kan al worden geconstateerd aan de hand van de resultaten van de hierboven vermelde proeven met tabaksmozaiek-virus. Daar-naast wijzen de uitkomsten van het, nu kort te bespreken, on-derzoek met bacteriofagen eveneens sterk in deze richting. Het is uit vele aanwijzingen duidelijk geworden dat slechts het nucleine-zuurdeel van de faag in de bacterie komt. Nu kunnen de bacterio-fagen op grond van hun genetisch gedrag in twee groepen worden onderscheiden. Die van de eerste groep worden geacht niet of moeilijk genetisch materiaal uit te wisselen met de gastheer of met andere, tegelijk aanwezige, fagen. De tweede groep bestaat

105. A. SlEGEL. S.G. WILDMAN. W. GINOZA. Nature 178 (1956) 1117

-27-uit bacteriofagen die hiertoe wel in staat zijn. Dit vermogen kan bijvoorbeeld worden aangetoond door tegelijk te infecteren met twee verwante, maar genetisch verschillende, fagen. Het blijkt dat wanneer deze behoren tot de tweede groep, naast de normale, ook fagen van een nieuw type ontstaan. Deze bevatten een combinatie van bepaalde eigenschappen van beide typen fagen. Er heeft hier-bij een uitwisseling plaats gevonden van genen of, daar vrijwel vaststaat dat deze identiek zijn met DNA moleculen, van nucleine-zuur. Bij gelijktijdig infecteren van de bacterie met een door U. V. geïnactiveerde faag (die nog wel in staat is door te dringen in de cel, vergelijk p. 9) en met een genetisch iets afwijkende faag worden nieuwe faagdeeltjes gevormd die enige kenmerken bezitten van de gernactiveerde soort. Dit verschijnsel, dat bekend staat onder de naam "cross reactivation", mag als een verder be-wijs voor de uitwisseling van DNA dienen. In bepaalde gevallen is het nu verder mogelijk gebleken actieve fagen te verkrijgen na in-fectie met twee verwante, door U. V. geïnactiveerde, faagtypen ("multiplicity reactivationlt

) . Hieruit blijkt dat door combinatie van genetisch materiaal de inactivering door U. V. ongedaan kan worden gemaakt. Uit bovengenoemde experimenten mogen we aan-nemen dat hierbij een nucleinezuur-uitwisseling is opgetreden. De conclusie mag dan ook worden getrokken dat inactivering door U. V. zeer waarschijnlijk wordt veroorzaakt door een inwerking op het nucleinezuur van de faag (literatuuroverzicht van deze on-derzoekingen 90).

d. De bestudering van de U. V. invloed op de nlicleinezuren als zodanig is in hogere organismen uiteraard zeer moeilijk en de waargenomen verschijnselen zullen niet gemakkelijk in verband kunnen worden gebracht met op moleculair niveau veroorzaakte veranderingen. Wel is een vergelijking gemaakt tussen de invloed van U. V. op het kernmateriaal en het cytoplasma bij het ei van een

bepaalde wesp (Habrobacon). In het begin van de ontwikkeling

wordt de kern door het omringende cytoplasma beschermd. In een later stadium zwermen de dochterkernen echter uit en kunnen dan selectief worden bestraald. Het blijkt dat een blootstellen aan U. V. in de eerste periode kan resulteren in morfologisch sterk gewijzigde larven, maar dat de bestraling in de tweede periode leidt tot een stopzetten van de ontwikkeling in een vroeg stadium 107 •

Het absorptiespectrum van nucleinezuren wordt vrijwel uit-sluitend veroorzaakt door de daarin voorkomende pyrimidine- en purine-derivaten. De stralingsenergie moet dan ook worden opge-nomen door deze verbindingen. Doordat men bij modelproeven steeds streeft naar een zo eenvoudig mogelijke proefopzet is het begrijpelijk dat de invloed van U. V. op deze heterocyclische ver-bindingen tamelijk intensief is bestudeerd. In de meeste gevallen

heeft men water als oplosmiddel gebruikt. Uit de in dit proef-schrift beschreven resultaten zal blijken, dat deze laatste vereen-voudiging, waarbij dus het straling absorberende object zich in

een homogene waterige fase bevindt, een van de werkelijkheid