Marta Siergiejuk, Alicja Karwowska1), Marek Gacko, Anna Worowska WPŁYW INHIBITORÓW Z NASION ROŚLIN
SPOŻYWANYCH PRZEZ CZŁOWIEKA NA AKTYWNOŚĆ ENTEROPEPTYDAZY I AKTYWACJĘ TRYPSYNOGENU
PRZEZ TEN AKTYWATOR
Klinika Chirurgii Naczyń i Transplantacji Akademii Medycznej w Białymstoku Kierownik: dr hab. M Gacko
1)Zakład Analizy Instrumentalnej Akademii Medycznej w Białymstoku
Kierownik: prof. dr hab. K. Worowski
Ekstrakt z nasion fasoli hamuje aktywność enteropeptydazy. Aktywację try-psynogenu przez trypsynę hamują ekstrakty z nasion wszystkich 14 badanych gatunków roślin.
Hasła kluczowe: nasiona roślin, enteropeptydaza, aktywacja trypsynogenu. Key words: plant seeds, enteropeptidase, trypsinogen activation.
Podstawowe znaczenie w trawieniu białek w soku dwunastniczym posiada ak-tywacja trypsynogenu do trypsyny przez enteropeptydazę (1). Trypsyna aktywuje trypsynogen, a także chymotrypsynogen, proelastazę, prekarboksypeptydazę A, pre-karboksypeptydazę B i profosfolipazę A (2).
Ekstrakty z nasion wielu gatunków roślin hamują aktywność trypsyny, chymotry-psyny i elastazy oraz proteaz wchodzących w skład preparatu Kreon, Neo-Pancrea-tin i Panzakrat (3, 4).
Celem pracy było określenie wpływu ekstraktu z nasion 14 gatunków roślin spo-żywanych przez człowieka na aktywność enterpeptydazy i aktywację trypsynogenu przez ten aktywator.
MATERIAŁ I METODY
Enteropeptydaza i trypsynogen fi rmy Sigma (USA); H-Gly-(Asp)4-Lys-βNA i Bz-L-Arg-pNA fi rmy Bachem (Szwajcaria).
Nasiona: bobu właściwego (Vicia faba major), fasoli zwykłej (Phaseolus vulga-ris), grochu siewnego (Pisum sativum), gryki zwyczajnej (Fagopyrum sagittatum), jęczmienia zwyczajnego (Hordeum vulgare), kukurydzy zwyczajnej (Zea mays), owsa siewnego (Avena sativae), prosa zwyczajnego (Panicum miliaceum), pszenicy zwyczajnej (Triticum aestivum), ryżu siewnego (Oryza sativae), słonecznika zwy-czajnego (Helianthus napus), soczewicy jadalnej (Lens culinaris), soi zwyczajnej (Glycine max) i żyta zwyczajnego (Secales cereale) rozdrabniano w młynku elek-trycznym i ekstrahowano 0,15 mol/dm3 NaCl w stosunku 1:9 w/v w ciągu 2 godz.,
stosując ciągłe mieszanie. Płyn nadosadowy otrzymany przez wirowanie (1500 × g, 4°C, 30 min.), doprowadzony do pH 8,5 użyto do badań.
Wpływ ekstraktu z nasion na aktywność enteropeptydazy oceniano wg Antonowi-cza i współpr. (5). Do 0,2 cm3 enteropeptydazy (0,9%) dodawano 0,2 cm3 ekstraktu z nasion (w kontroli 0,2 cm3 0,15 mol/dm3 NaCl, pH 8,5) i próby preinkubowano 30 min. w temp. 37°C. Następnie dodawano 0,6 cm3 6,25 mmol/dm3 H-Gly-(Asp)
4 -Lys-βNA inkubowano w tej samej temperaturze w ciągu 2 h. Reakcję przerywano przez dodanie 1 cm3 2 mol/dm3 HCl. Po odwirowaniu składników nierozpuszczal-nych, uwolniony βNA poddawano diazowaniu. Do 0,2 cm3 płynu nadosadowego dodawano w odstępach 2 min. kolejno: 0,2 cm3 0,1% azotanu (III) sodu, 0,2 cm3 0,5% siarczan (IV) amonu i 0,4 cm3 0,05% N-(1-naftylo)etylenodiaminy. Po 3 min. mierzono absorbancję przy 560 nm. Ilość uwolnionej β-naftyloaminy odczytywano z wykresu kalibracyjnego sporządzonego przy użyciu wzorcowych roztworów tego związku.
W badaniach nad wpływem ekstraktów z nasion na aktywację trypsynogenu przez enteropeptydazę posłużono się jako substratem trypsyny Bz-L-Arg-pNA (6). Oce-niano ilość produktu reakcji jakim jest p-nitroanilina (pNA). W celu ustalenia ha-mowania aktywacji trypsynogenu, haha-mowania aktywności trypsyny i haha-mowania równocześnie obu procesów przez ekstrakty z nasion posłużono się trzema testami (7). Wszystkie testy zawierały 0,2 cm3 trypsynogenu. Do testu 1 i 3 dawano 0,2 cm3 enteropeptydazy i 0,2 cm3 buforu Tris-HCl o pH 8,6 zawierającego 0,01 mol/dm3 CaCl2. Do testu 3 dawano 0,2 cm3 ekstraktu z nasion i 0,2 cm3 enteropeptydazy. Wszystkie testy preinkubowano 30 min. w temp. 37°C. Do testu 1 i 3 dodawano 0,2 cm3 buforu, a do testu 2 0,2 cm3 ekstraktu z nasion. Do wszystkich testów doda-wano 0,2 cm3 4,0 mmol/cm3 Bz-L-Arg-pNA i inkubowano je 30 min. w temp. 37°C. Reakcję przerywano przez dodanie 1 cm3 10% kwasu trichlorooctowego. W otrzy-manym przez wirowanie płynie nadosadowym mierzono absorbancję przy 410 nm i odczytywano ilość uwolnionej p-nitroaniliny z wykresu kalibracyjnego sporządzo-nego przy użyciu wzorcowych roztworów tego związku.
WYNIKI I ICH OMÓWIENIE
Jak wynika z tab. I tylko ekstrakt z nasion fasoli posiada inhibitor hamujący ak-tywność enteropeptydazy w jej działaniu na specyfi czny syntetyczny substrat. Wy-stępowanie inhibitora enteropeptydazy w nasionach fasoli opisali wcześniej inni autorzy (8). O hamowaniu aktywacji trypsynogenu decyduje hamujący wpływ eks-traktów nie tylko na aktywność enteropeptydazy ale także na aktywność trypsyny, która dokonuje autoaktywacji tego proenzymu (2).
Z porównania wyników uzyskanych w teście, w którym nie dodano ekstraktu z na-sion (test 1) i w którym dodano ekstrakt z nana-sion po preinkubacji (test 2) wynika, że hamują one aktywację trypsynogenu (tab. II). Z porównania wyników uzyskanych w teście, w którym ekstrakty dodano po preinkubacji (test 2) i przed inkubacją (test 3) wynika, że hamowanie aktywacji trypsynogenu przez enteropeptydazę dokonuje je-dynie inhibitor występujący w nasionach fasoli. Inhibitory występujące w ekstraktach z nasion pozostałych roślin hamują autoaktywację trypsynogenu przez trypsynę.
Tabela I. Wpływ ekstraktu z nasion na aktywność enteropeptydazy Table I. The effect of seed extracts on enteropeptidase activity
Ekstrakt z nasion Aktywność enteropeptydazy, βNA μmol/cm3/1h Hamowanie, % Bób 6,4 1,5 Fasola 3,6 44,6 Groch 6,2 4,6 Gryka 6,5 0,0 Jęczmień 6,6 0,0 Kukurydza 6,5 0,0 Owies 6,7 0,0 Proso 6,3 3,1 Pszenica 6,6 0,0 Ryż 6,6 0,0 Słonecznik 6,2 4,6 Soczewica 6,1 6,2 Soja 6,5 0,0 Żyto 6,3 3,1
Kontrola (bez ekstraktu) 6,5 0,0
Tabela II. Wpływ ekstraktów z nasion na aktywację trypsynogenu przez enteropeptydazę Table II. The effect of seed extracts on tripsinogen activation by enteropeptidase
Ekstrakt z nasion Test 1 Test 2 Test 3 pNA nmol/cm3/30 min (hamowanie, %)
Bób 64,2 (0,0) 51,2 (20,2) 36,8 (42,7) Fasola 28,2 (56,1) 19,7 (69,3) Groch 38,8 (39,6) 27,3 (57,5) Gryka 47,3 (26,3) 38,0 (40,8) Jęczmień 51,0 (20,6) 46,9 (26,9) Kukurydza 48,3 (24,8) 40,6 (36,8) Owies 54,2 (15,6) 46,2 (28,0) Proso 39,6 (38,3) 28,6 (55,5) Pszenica 50,3 (21,7) 42,3 (34,1) Ryż 66,7 (0,0) 48,6 (24,3) Słonecznik 42,3 (34,1) 38,6 (39,9) Soczewica 36,4 (43,3) 29,6 (53,9) Soja 52,3 (18,5) 42,7 (33,5) Żyto 35,6 (44,5) 26,4 (55,9)
Znaczna oporność inhibitorów proteaz występujących w nasionach na podwyższo-ną temperaturę, zakwaszenie i działanie pepsyny wskazuje, że mogą one hamować trawienie białek w dwunastnicy zwłaszcza chorych z przewlekłą niewydolnością trzustki (9, 10), a także przyjmujących substytuty tych enzymów (4). Problematyka wpływu inhibitorów proteaz w trawieniu pokarmów białkowych podejmowana jest przez wielu autorów (3, 4, 11, 12).
WNIOSKI
Ekstrakty z nasion roślin spożywanych przez człowieka hamują aktywność try-psynogenu:
1. Ekstrakt z nasion fasoli hamuje aktywność trypsynogenu przez enteropeptyda-zę i autoaktywację tego proenzymu.
2. Ekstrakty z nasion innych roślin strączkowych i nasion zbóż hamują wyłącznie autoaktywację trypsynogenu.
M. S i e r g i e j u k, A. K a r w o w s k a1), M. G a c k o, A. W o r o w s k a THE EFFECT OF INHIBITORS FROM THE SEEDS OF PLANTS CONSUMED BY HUMANS ON THE ENTEROPEPTIDASE ACTIVITY AND TRYPSINOGEN ACTIVATION
BY THIS ACTIVATOR S u m m a r y
Extract from the seeds of kidney bean inhibits enteropeptidase activity. Extracts from the seeds of broad bean, pea, buckwheat, barley, mize, oat, millet, wheat, rice, sunfl ower, lentis, soya bean and rye inhibit trypsinogen autoactivation by tripsin.
PIŚMIENNICTWO
1. Sadler J. E.: Enteropeptidase, in: Handbook of proteolytic enzymes, ed. Barret A.J., Rawling N.D., Woessner J.F. Elsevier, Amsterdam, 2004; 2: 1513-1517. – 2. Antonow V.K.: Chemistry of proteolysis. Springer Verlag, Berlin, 1993; 215-217. – 3. Billings P.C., Longnecker M.P., Keary M., Taylor P.R.: Pro-teinase inhibitor content of human dietary samples. Nutr. Canc., 1990; 14: 85-93. – 4. Bruzgo M., Ga-cko M., Guzowski A., Chlabicz M., Bańkowska A.: Wpływ inhibitorów z nasion roślin spożywanych przez człowieka na aktywność proteaz preparatów stosowanych w substytucyjnym leczeniu niewydolności ze-wnątrzwydzielniczej trzustki. Bromat. Chem. Toksykol., 2005; 37 (supl.): 345-347. – 5. Antonowicz I., Itesford F.I., Green I.R., Grogg P., Hadorn B.: The application of a new synthetic substrate to the de-termination of enteropeptidase in rat small intestine and human intestinal biopsies. Clin. Chim. Acta., 1980; 101: 69-76. – 6. Somarin O., Tokura S., Nishi N., Noguchi J.: The action of trypsin on synthetic chromogenic arginine substrates. J. Biochem., 1979; 85: 157-162. – 7. Worowski K., Gabryelewicz A., Roszkowska W., Bajko K.: The action of potato inhibitors on activation of zymogen forms of digestive system proteases. Acta Hepato-Gastroenterol., 1979; 26: 413-416. – 8. Jacob R.T., Bhat P.G., Pattabira-man T.N.: Isolation and characterization of a specifi c enterokinase inhibitor from kidney bean (Phaseolus vulgaris). Biochem. J., 1983; 209: 91-97. – 9. Chlabicz M., Gacko M., Guzowski A., Krupkowska A., Bańkowska A.: Termostabilność roślinnych inhibitorów proteaz przewodu pokarmowego. Bromat. Chem. Toksykol., 2005; 37 (supl.): 337-339. – 10. Karwowska A., Gacko M., Guzowski A., Krupkowska A., Chojnacka-Zdrodowska A.: Inaktywacja roślinnych inhibitorów trypsyny i chymotrypsyny przez pepsynę. Bromat. Chem. Toksykol., 2005; 37 (supl.): 349-351.
11. Leontowicz H., Kulasek G.: Naturalne pokarmowe inhibitory enzymów trawiennych. Med. Wet., 1998; 54: 159-165. – 12. Birk Y.: Protease inhibitors of plant origin and role of protease inhibitors in hu-man nutrition, in: Protease inhibitors as cancer chemopreventive agents, ed. W. Troll, R. Kennedy. Plenum Press, New York, 1993; 97-106.
