Medycyna Weterynaryjna - Summary Medycyna Wet. 62 (9), 1059-1060, 2006

Medycyna Wet. 2006, 62 (9) 1059

Praca oryginalna Original paper

Do zakrêtu przyhipokampowego (gyrus parahippocam-palis) nale¿¹: przedpodpora (presubiculum), przypodpora (parasubiculum) i pole œródwêchowe (area entorhinalis). Obszar ten jest zwi¹zany m.in. z procesami zapamiêtywa-nia i uczezapamiêtywa-nia siê. Podpora (subiculum), nale¿¹ca do tworu hipokampa (formatio hippocampi), przechodzi w kilkuwar-stwow¹ przedpodporê (presubiculum). Presubiculum utwo-rzone jest z szerokiego pasma komórek nerwowych, w któ-rym stwierdzono obecnoœæ 4 warstw – trzy warstwy komórkowe i jedn¹ brze¿n¹. Przedpodpora zagina siê dobrzusznie i przechodzi w strukturê zwan¹ przypodpor¹ (parasubiculum), która równie¿ posiada czterowarstwow¹ budowê sk³adaj¹c¹ siê z jednej warstwy brze¿nej i trzech warstw komórkowych. Przypodpora przechodzi w pole œródwêchowe (12, 14).

Wiele obszarów mózgowia doros³ych ssaków znajduje siê pod wp³ywem estrogenów, które oddzia³ywuj¹ zarów-no na neurony, jak i astrocyty przez receptory estrogezarów-no- estrogeno-we. Astrocyty pobudzone estrogenem uwalniaj¹ czynniki neutroficzne zapobiegaj¹ce œmierci neuronów (4). W tych komórkach glejowych wykryto receptory estrogenowe a (ERa). Estrogeny wp³ywaj¹ na dojrzewanie neuronów i astrocytów, ich prze¿ywalnoœæ, a w konsekwencji mog¹ prowadziæ do rozwoju chorób neurodegeneracyjnych wraz z wiekiem. W dostêpnej literaturze ma³o jest danych doty-cz¹cych wp³ywu estrogenów i wystêpowania ERa w móz-gowiu królika (1). Króliki, jako poliestralne, s¹ interesuj¹-cym obiektem badawczym, poniewa¿ nie wykazuj¹ cykli rujowych jak inne gatunki.

Celem badañ by³o okreœlenie wp³ywu 17b estradiolu (E2) na ekspresjê immunoreaktywnoœci ERa w neuronach i astrocytach zakrêtu przyhipokampowego królików pod-danych owariektomii (OVX). By³o nim równie¿ porówna-nie intensywnoœci immunozabarwienia ERa astrocytów u samic OVX z królikami OVX, którym podawano E2.

Materia³ i metody

Do badañ u¿yto 5 samic królików w wieku od 4 do 5 lat. Sami-ce te poddano obustronnej owariektomii (OVX), w pe³nym znie-czuleniu ogólnym 5% ketamin¹ w dawce 30 mg/kg m.c. Materia³ do badañ stanowi³ zakrêt przyhipokampowy (presubiculum, pa-rasubiculum i area entorhinalis). Króliki podzielono na dwie gru-py doœwiadczalne. Pierwsz¹ grupê stanowi³y 2 samice, które nie otrzymywa³y 17b estradiolu (E2), a materia³ do badañ pobierano 4 tyg. po owariektomii (OVX). Druga grupa to 3 owariektomizo-wane samice (OVX + E2), którym po 4 tyg. od OVX do¿ylnie podawano przez 7 kolejnych dni E2 (Mesalin firmy Polfa). Kró-liki po 24 h od ostatniego podania E2 poddano eutanazji morbi-talem. Pobrany materia³ utrwalono i wykonano parafinowe skrawki o gruboœci 4 µm. Nastêpnie przeprowadzono immunocytoche-miczn¹ reakcjê wykrywania ERa w zakrêcie przyhipokampowym metod¹ DAKO LSAB+Kit Peroxidase. Skrawki inkubowano z pierwotnym, monoklonalnym przeciwcia³em mysim anty-ERa NCL-L-ER-6F11 (firmy Novocastra), potem z monoklonalnym wtórnym biotynylowanym anty-mysim IgG (firmy DAKO). Nastêpnie skrawki inkubowano z kompleksem strepotowidyna--peroksydaza (firmy DAKO). Jako chromogenu u¿yto DAB (3,3’--diaminobenzidine tetrahydrochloride firmy DAKO). Dodatko-wo skrawki podbarwiono hematoksylin¹ Mayera. Otrzymano koñ-cowy, nierozpuszczalny produkt reakcji o ró¿nej intensywnoœci br¹zowego zabarwienia. Kontrolê specyficznoœci reakcji wyko-nano omijaj¹c pierwotne przeciwcia³o dla antygenu lub zastêpo-wano je normaln¹ surowic¹ królicz¹; w preparatach nie zaobser-wowano produktu reakcji. Immunoreaktywne ERa neurony i astrocyty zakrêtu przyhipokampowego ogl¹dano i fotografowa-no w mikroskopie optycznym Jenaval (Zeiss).

Wyniki i omówienie

U samic królików z pierwszej grupy doœwiadczalnej po OVX, bez podawania E2, od których pobrano materia³ do badañ po 2 tygodniach, astrocyty cechowa³y siê brakiem immunoreaktywnoœci ERa i podbarwione by³y jedynie

he-Ekspresja receptorów estrogenowych a w zakrêcie

przyhipokampowym samic królików po 17b estradiolu

IZABELA KRAKOWSKA, JADWIGA JAWORSKA-ADAMU

Katedra Anatomii i Histologii Zwierz¹t Wydzia³u Medycyny Weterynaryjnej AR, ul. Akademicka 12, 20-033 Lublin Krakowska I., Jaworska-Adamu J.

Expression of estrogen receptors a in parahippocampal gyrus following 17b estradiol application

in female rabbits

Summary

The aim of the study was to determine the localization of estrogen receptors a in the parahippocampal gyrus (gyrus parahippocampalis) following 17b application in ovariectomized rabbits. Studies were carried out using an immunocytochemical method. Estrogen receptors a immunoreactivity in neurons and astrocytes were detected in the cellular layers of parasubiculum, perisubiculum and entorhinalis region. However ERa immunoreactivity was not detected in astrocytes ovariectomized rabbits in the experimental group where there was no E2 application. On the other hand, the neurons showed very weak colorization. The results obtained indicate that the structure of rabbit parahippocampal gyrus is under the influence of estrogen, which causes an increase in ERa expression.

Medycyna Wet. 2006, 62 (9) 1060

matoksylin¹ Mayera na niebiesko we wszystkich warstwach komórkowych presubiculum, parasubiculum oraz area entorhinalis. Neurony wykazywa³y bardzo s³abe immuno-zabarwienie ERa we wszystkich wy¿ej opisanych struktu-rach (ryc. 1).

W drugiej grupie królików po OVX + E2, od których materia³ pobrano po 24 h od zaprzestania podawania estra-diolu, obserwowano intensywnie immunozabarwione ERa w neuronach oraz astrocyty o ró¿nej intensywnoœci br¹zo-wego immunozabarwienia w warstwach komórkowych pre-subiculum, parasubiculum oraz area entorhinalis. Za astro-cyty przyjêto komórki znacznie mniejsze od neuronów. Na podstawie immunozabarwienia okreœlono wewn¹trzkomór-kow¹ lokalizacjê ERa w astrocytach. Immunoreaktywnoœæ we wszystkich badanych obszarach lokalizowa³a siê zw³asz-cza w cytoplazmie cia³ komórkowych i niektórych g³ów-nych wypustkach oraz w niektórych j¹drach komórkowych astrocytów. Nale¿y zaznaczyæ, ¿e nie wszystkie astrocyty badanych obszarów wykazywa³y immunozabarwienie (ryc. 2, 3).

U doros³ych osobników E2 oddzia³ywuje nie tylko na obszary w³¹czone w procesy neurohormonalne, ale tak¿e na inne pola mózgowia, przyczyniaj¹c siê do zmian morfo-logicznych i czynnoœciowych astrocytów w celu prawid³o-wego funkcjonowania neuronów (6, 7, 9). Astrocyty s¹ najliczniejszymi komórkami glejowymi, s³u¿¹cymi do utrzymania homeostazy mózgowia w³¹czone s¹ w remode-lacjê synaps oraz neuroprotekcjê. Estrogen stymuluje astro-cyty do uwalniania czynników neurotroficznych (4). Wy-stêpowanie ERa w astrocytach wykryto, zaœ w innych ko-mórkach glejowych sugeruje siê ich brak (8). Podobnie jak w badaniach w³asnych zakrêtu przyhipokampowego u OVX królików, tak¿e w hipokampie OVX szczurów opisano brak lub s³ab¹ immunoreaktywnoœæ ERa w neuronach i astro-cytach (8, 9). Sugeruje siê, ¿e mo¿e to byæ zwi¹zane ze spadkiem endogennych estrogenów we krwi po owariekto-mii zwierz¹t, co w konsekwencji powoduje spadek ekspre-sji ERa (13).

Potwierdzono obecnoœæ ERa w ok. 50% astrocytów, co wskazuje na ich heterogennoœæ w wynios³oœci przyœrodko-wej œwinki morskiej (8). Inni autorzy sugeruj¹, ¿e ERa nie wystêpuj¹ w ca³ym mózgowiu (4, 13). Opisano wewn¹trz-komórkow¹ lokalizacjê ERa w ciele komórkowym, nie-których j¹drach i pewnych pocz¹tkowych wypustkach astro-cytów, co jest zgodne z wynikami badañ w³asnych (7, 15). Poznano mechanizm oddzia³ywania estrogenu w neuronach przez j¹drowe ERa, w celu transkrypcji i wzrostu produk-Ryc. 1. S³aba immunoreaktywnoœæ ERa

w neuronach i brak immunozabarwienia w astrocytach presubiculum OVX króli-ków (pow. ok. 450 ×)

Ryc. 2. Immunoreaktywnoœæ ERa w strukturach parasubiculum u OVX+E2 królików (pow. ok. 35 ×)

Ryc. 3. Intensywna immunoreaktywnoœæ ERa w neuronach, pewnych astrocytach (¯) z area entorhinalis u OVX+E2 króli-ków (pow. ok. 450 ×)

cji bia³ek. Nadto opisano cytoplazmatyczn¹ lokalizacjê ERa w neuronach, która wskazuje na ich syntezê na siateczce œródplazmatycznej szorstkiej, sk¹d mog¹ byæ przemiesz-czane do j¹dra komórkowego (10). Ostatnio ERa opisano w b³onie komórkowej (2, 3). Podobnie jak w neuronach, tak¿e w astrocytach ERa mog¹ s³u¿yæ do bezpoœredniego wp³ywu estrogenu na te komórki glejowe w celu ich pra-wid³owego funkcjonowania, mog¹ te¿ regulowaæ interak-cje neuron–astrocyt.

Wyniki badañ w³asnych dostarczy³y dowodów, ¿e egzo-genny estrogen podany OVX królikom powoduje znaczny wzrost ekspresji ERa w neuronach i niektórych astrocy-tach, co mo¿e œwiadczyæ o ich ró¿nej specjalizacji czynno-œciowej.

Piœmiennictwo

1.Caba M., Beyer C., Gonzáles-Mariscal G., Morrell J. I.: Immunocytochemical detection of estrogen receptor-a in the female rabbit forebrain: topography and regulation by estradiol. Cell Neuroendocrinol. 2003, 77, 208-222.

2.Caldwell J. D.: A sexual arousability model involving steroid effects at the plasma membrane. Neurosci. Behav. Rev. 2002, 26, 13-30.

3.Dhanadapani K. M., Brann D. W.: Estrogen-astrocyte interactions: implications for neuroprotection. BMC Neurosci. 2002, 3, 6.

4.Donahue J. E., Stopa E. G., Chorsky R. L., King J. C., Schipper H. M., Tobet S. A., Blaustein J. D., Reichlin S.: Cells containing immunoreactive estro-gen receptor-a in the human basal forebrain. Brain Res. 2000, 856, 142-151. 5.Garcia-Segura L. M., Chowen J. A., Dueñas M., Torres-Aleman I., Naftalin F.:

Gonadal steroids as promoters of neuro-glial plasticity. Psychoneuroendocrinol. 1994, 19, 445-453.

6.Hõsli E., Rûhl W., Hõsli L.: Histochemical and electrophysiological evidence for estrogen receptors on cultured astrocytes: colocalization with cholinergic receptors. Int. J. Devl. Neurosci. 2000, 18, 101-111.

7.Jaworska-Adamu J., Cybulska R., Kalinowska M.: Zmiany morfologii astrocy-tów w istocie szarej œrodkowej i j¹drze ³ukowatym w cyklu rujowym szczura. Medycyna Wet. 2004, 60, 1114-1117.

8.Langub M. C., Watson R. E.: Estrogen receptor-immunoreactive glia, endothe-lia and ependyma in guinea pig preoptic area and median eminence: electron microscopy. Endocrinology 1992, 130, 364-372.

9.Luquin S., Naftolin F., Garcia-Segura L. M.: Natural fluctuation and gonadal hormone regulation of astrocytes immunoreactivity in dentate gyrus. J. Neuro-biol. 1993, 24, 913-924.

10.Milner T. A., McEwen B. S., Hayashi S., Li C. J., Reagan L. P., Alves S. E.: Ultrastructural evidence that hippocampal alpha receptors are located at extra-nuclear sites. J. Comp. Neurol. 2001, 429, 355-371.

11.Mitra S. W., Hoskin E., Yudkovitz J., Pear L., Wilkinson H. A., Hayashi S., Pfaff D. W., Ogawa S., Rohrer S. P., Schaeffer J. M., McEwen B. S., Alves S. E.: Immunolocalization of estrogen receptor b in the mouse brain comparison with estrogen receptor a. Endocrinol. 2003, 144, 2055-2067.

12.Oswald S.: Topographic organization of the projections from the entorhinal area to the hippocampal formation of the rat. J. Comp. Neurol. 1986, 167, 285-314. 13.Rune G. M., Wehrenberg U., Prange-Kiel J., Zhou L., Adelmann G., Frotscher M.: Estrogen up-regulates estrogen receptor a and synaptophysin in slice cultures of rat hippocampus. Neurosci. 2002, 113, 167-172.

14.Szczech J.: Mielinizacja uk³adu limbicznego w rozwoju ontogenetycznym szczu-ra. Neuropatol. Pol. 1978, 16, 25.