Jarosław Korczyński
1,*Katarzyna Kubiak
2Edyta Węgłowska
21Centrum Doradztwa Naukowo-Badaw-czego Kawa.ska Sp. z o.o., Piaseczno 2Laboratorium Biotechnologii Molekularnej, Bionanopark Sp. z o.o., Łódź
*Centrum Doradztwa Naukowo-Badawczego Kawa.ska Sp. z o.o., ul. Techniczna 5, 05-500 Piaseczno; tel.: 667 623 100; e-mail: jaroslaw. korczynski@kawaska.pl
Artykuł otrzymano 26 stycznia 2017 r. Artykuł zaakceptowano 31 stycznia 2017 r. Słowa kluczowe: Mikroskopia konfokalna, widmo Ramana, spektroskopia ramanowska, mikroskopia CARS
Wykaz skrótów: APD – ang. Avalanche Photo-diode; CARS – ang. Coherent anti-Stokes Raman Scattering; GSD – ang. Ground State Depletion; HyD – ang. Hybrid Detector; NDDs – ang. Non--Descanned Detectors; NIR – ang. Near Infrared; PMT – ang. Photo Multiplier Tube; SHG – ang. Second Harmonic Generation; STED – ang. Stimu-lated Emission Depletion; SRS – ang. StimuStimu-lated Raman Scaterring
Obserwując tańczące molekuły – mikroskopia CARS
STRESZCZENIE
M
ikroskopia CARS (ang. Coherent Anti-Stokes Raman Scattering) jest metodąpozwa-lającą na kontrastowe obrazowanie niewybarwionych próbek: zarówno preparatów biologicznych jak również próbek w przemyśle spożywczym lub kosmetycznym. W mi-kroskopii tej światło z zakresu bliskiej podczerwieni generowane przez laser wchodzi w interakcję z wibrującymi cząsteczkami w próbce, co powoduje zmianę ich energii i emisję sygnału CARS. Sygnał ten jest wykorzystywany do specyficznej wizualizacji różnych frakcji cząsteczek w preparacie, dzięki temu możemy badać morfologię próbki jak i analizować jej skład. W niniejszym artykule pokazujemy niektóre zastosowania metody obrazowania CARS: obrazowanie kropel tłuszczu wewnątrz komórek ludzkiej linii HaCaT oraz analizę składu produktów kosmetycznych. Możliwość wykonywania trójwymiarowych rekonstruk-cji niewybarwionego materiału, jak również weryfikarekonstruk-cji jego składu chemicznego, otwiera dla mikroskopii CARS drogę do wielu innych zastosowań w biologii i medycynie.
WPROWADZENIE
„Musisz z całych sił biec, aby pozostać w tym samym miejscu. Aby posuwać się naprzód, trzeba biec dwa razy szybciej”, te ciekawe słowa Czerwonej Kró-lowej z książki „Alicja po drugiej stronie lustra” są aktualne nie tylko w książ-kowej Krainie Czarów Lewisa Carrola, ale znajdują również potwierdzenie w świecie realnym, w dziedzinie nauki! Odkrycia dokonywane w różnych dzia-łach nauki nie tylko poszerzają naszą wiedzę na dany temat, ale również mogą pomóc w rozwoju technik badawczych, które pozwolą jeszcze szybciej posuwać się naprzód w tym pędzie do wiedzy. Wystarczy wspomnieć, że odkrycia z dzie-dziny chemii i fizyki związane z rozwojem mikroskopii fluorescencyjnej wyso-kiej rozdzielczości, za które w 2014 roku została przyznana Nagroda Nobla, są już powszechnie wykorzystywane w praktyce w postaci modułów mikroskopo-wych typu STED (ang. Stimulated Emission Depletion) czy GSD (ang. Ground State
Depletion) [1]. Moduły te pozwalają na obrazowanie struktur biologicznych z
rozdzielczością wyższą niż wynosił ustalony w XIX wieku teoretyczny limit roz-dzielczości dla mikroskopii świetlnej. Przesuwanie sformułowanych wcześniej granic możliwości poznawania świata to niewątpliwie przykład tego „dwa razy szybszego biegu” z pierwszego zdania wstępu. Również tematem niniejszego artykułu będzie metoda, która obecnie pozwala przezwyciężać kolejne ograni-czenie mikroskopii świetlnej: potrzebę fluorescencyjnego znakowania materiału w mikroskopii konfokalnej.
CARS – PODSTAWY FIZYCZNE
Konwencjonalne techniki mikroskopii konfokalnej pozwalają tworzyć re-konstrukcje preparatów, jeśli wcześniej zostały one wybarwione specyficznymi sondami fluorescencyjnymi lub wykazują autofluorescencję. Ograniczenia wy-nikające z takich metod są oczywiste: barwniki fluorescencyjne często blakną z upływem czasu, a ich obecność może zakłócać subtelne procesy biochemiczne zachodzące w żywych komórkach, m.in. barwniki fluorescencyjne mogą być odpowiedzialne za powstawanie efektów fototoksycznych, a co za tym idzie wpływać na wynik eksperymentu. Co więcej, obecność fluorochromów może maskować ciekawe informacje w próbce prowadząc do powstawania nieprawi-dłowych wniosków [2]. Pewnym ograniczeniem w badaniach preparatów bar-wionych fluorescencyjnie jest również czasochłonne przygotowywanie próbek oraz brak dostępności odpowiednich barwników dla wszystkich typów próbek i eksperymentów.
Z pomocą w przezwyciężeniu ograniczeń wynikających z obecności barwni-ków w preparacie może przyjść technika CARS (ang. Coherent anti-Stokes Raman
Scattering), wykorzystująca do obrazowania specyficzne wibracje
kontra-stowe uwidocznienie poszczególnych elementów próbki są odpowiedzialne już same cząsteczki tworzące tę próbkę, a nie molekuły fluorochromów dołączone do nich: czy to za pomocą przeciwciał, czy też, bezpośrednio, wiązaniami chemicznymi. Sam preparat nie wymaga w tej metodzie do-datkowych przygotowań i pozostaje prawie nie zmieniony. Nietoksyczna i małoinwazyjna technologia CARS otwiera nam więc nowe obszary zastosowań mikroskopu do ana-lizy żywych komórek, małych zwierząt, czy też do badań materiałowych [3].
Sygnał CARS jest generowany poprzez wibrację cząste-czek wchodzących w skład danej próbki. Różne rodzaje cząsteczek mają indywidualne energie drgań, które mogą
być stymulowane za pomocą różnych długości fal (Tab. 1). Sygnał CARS jest generowany poprzez dwie impulsowe wiązki laserowe: wiązkę pompującą o krótszej długości fali oraz wiązkę Stokesa o dłuższej fali, obie wiązki światła muszą jednocześnie znaleźć się w punkcie na płaszczyźnie ogniskowej preparatu. Technologia CARS jest niemal wolna od zaburzających obrazowanie zjawisk, takich jak: transfor-macje elektronowe, wyświecanie czy formowanie stanów tripletowych cząsteczek, ponieważ zoptymalizowana kon-figuracja systemów do tej techniki obejmuje wzbudzenie w bliskiej podczerwieni, które wykorzystuje mniejszą energię fotonów, niż energia potrzebna do wytworzenia przejść elektronowych [4]. Przykładowo, w dostępnych komer-cyjnie systemach [5] wiązka Stokesa ma stałą długość fali
Tabela 1. Przykładowe rodzaje związków, które mogą być obrazowane w komercyjnie dostępnym systemie CARS [5].
Związek Tryb wibracji Fala wzbudzająca [cm-1]
Alkilobenzeny wibracje C6H5-C 1205
Benzeny wibracje pierścienia 1215
n-alkany skręty i wibracje CH2 1243
Cis-dialkylo etyleny odkształcenia w płaszczyźnie CH 1261
n-alkany CH2 w fazie skrętu 1300
Trans-dialkylo etyleny odkształcenia w płaszczyźnie CH 1302
Grupa izopropylowa deformacje CH 1340
n-alkany deformacje 1377
Naftaleny rozciąganie pierścienia 1380
Antraceny rozciąganie pierścienia 1400
n-alkany deformacje CH2 1460
n-alkany deformacje CH3 1466
Pochodne benzenu rozciąganie pierścieni 1590
Aminy pierwszorzędowe wibracje NH2 1620
Cykliczne kwasy karboksylowe symetryczne rozciąganie wiązania C=O 1652
Ketony alifatyczne rozciąganie wiązania C=O 1713
Aldehydy alifatyczne rozciąganie wiązania C=O 1730
Acetyleny alkilowe rozciąganie wiązania C=O 2130
Nitryle alifatyczne rozciąganie wiązania C=N 2242
Dialkilo-acetyleny rozciąganie wiązania C=C 2266
Tiole rozciąganie wiązania SH 2575
n-alkany symetryczne rozciąganie CH2 2855
n-alkany symetryczne rozciąganie CH3 2884
Pochodne benzenu rozciąganie wiązania CH w pierścieniach aromatycznych 3050
Aminy pierwszorzędowe rozciąganie NH2 3380
1064 nm, natomiast długość fali wiązki pompującej jest re-gulowana w zakresie od 780 nm do 940 nm, w zależności od typu cząsteczki, której wibracje chcemy zobrazować. Je-śli różnica pomiędzy energią fotonów, tworzących te dwie wiązki światła, będzie odpowiadała energii drgań cząste-czek w próbce, powstanie silny sygnał CARS o długości fali krótszej, niż ma każda z wiązek użytych do wzbudzenia. Sygnał ten jest wykorzystywany do obrazowania (Ryc. 2). Jest on generowany tylko w płaszczyźnie ogniskowej obiek-tywu mikroskopu, co umożliwia, podobnie jak w mikrosko-pii konfokalnej, selektywne skanowanie poszczególnych przekrojów optycznych materiału i tworzenie trójwymiaro-wej wizualizacji próbki z rozdzielczością sub-komórkową (do około 350 nm).
WYMOGI SYSTEMU DLA TECHNIKI CARS
Aby wygenerować obraz CARS badanej próbki, należy użyć jako źródła światła dla mikroskopu idealnie skonfigu-rowanych wiązek laserowych o odpowiednich długościach fal. Praktyka wskazuje, że jak na razie, najlepszym źródłem światła dla tego typu zastosowań są pikosekundowe lase-ry impulsowe o regulowanej długości fali emisji w zakresie bliskiej podczerwieni (NIR). Emitują one światło, które ze
względu na długość fali (zwykle > 800 nm) oraz czas trwa-nia impulsu (2–7 pikosekund) wykazuje niskie prawdopo-dobieństwo wywoływania wzbudzenia wielofotonowego cząsteczek autofluorochromów w preparacie. Dzięki temu istnieje mniejsze ryzyko fotouszkodzeń badanego materia-łu, a otrzymany obraz CARS jest bardziej kontrastowy i po-siada wysoki współczynnik sygnału do szumu [3]. Dodat-kowo długofalowe światło podczerwone ulega mniejszemu rozproszeniu w próbce, a co za tym idzie umożliwia głębszą penetrację materiału. Systemy CARS pozwalają więc użyt-kownikowi badać większe próbki materiału o grubości do 300–500 µm, bez potrzeby ich wybarwiania (które przy tej wielkości preparatu może już powodować spore problemy), co otwiera szerokie możliwości aplikacyjne dla tej techniki [6].
Dla wygenerowania sygnału CARS molekuła, której wibracje chcemy wzbudzić i zarejestrować, musi zaabsor-bować energię fotonów z dwóch różnych wiązek światła jednocześnie. Warunki dla powstania takiego zdarzenia istnieją jedynie w ognisku obiektywu o wysokiej apertu-rze numerycznej, gdzie gęstość fotonów jest największa, sygnał CARS będzie więc generowała tylko płaszczyzna
Rycina 2. Podstawy fizyczne wzbudzenia w technice CARS. Sygnał CARS jest generowany poprzez wibracyjne ruchy cząsteczek w próbce. Różne rodzaje cząsteczek wy-kazują charakterystyczną dla nich energię drgań. Energia z fal elektromagnetycznych o odpowiedniej długości fali (podczerwień) wyzwala w cząsteczkach te drgania. (Ry-cina na podstawie literatury [5], zmieniona). Aby wygenerować wystarczająco silną energię drgań, ponad istniejący w preparacie szum, używana jest wiązka pompująca o regulowanej długości fali, która pobudza daną frakcję cząsteczek ze stanu podstawowego do stanu wirtualnego. Energia fotonu użytego do wzbudzenia musi być mniejsza niż różnica pomiędzy energią stanu podstawowego a pierwszego poziomu oscylacyjnego stanu wzbudzonego (a więc wymagane jest ustawienie odpowiedniej długości fali tej wiązki). Przy jednoczesnym oświetleniu cząsteczek przez drugą wiązkę światła (wiązkę Stokesa) o dłuższej fali, cząsteczka przechodzi ze stanu wirtualnego do żą-danego stanu wibracyjnego. Ponieważ możemy regulować różnicę częstotliwości dwóch wiązek wzbudzających ωΔ = ωp – ωS (zwaną również rytmem częstotliwości) – mo-żemy ten układ wzbudzający dopasowywać do pożądanej energii drgań cząsteczek, które chcemy zobrazować. Aby następnie zobaczyć sygnał pochodzący z wibrujących w danym miejscu molekuł, kolejny impuls z wiązki pompującej przenosi układ do drugiego energetycznego stanu wirtualnego ωp + ωΔ. Z tej pozycji cząsteczka może już powrócić do stanu podstawowego emitując foton światła użyty do obrazowania (ωCARS = ωp + ωΔ). Energia wyemitowanego fotonu jest większa od energii fotonów z wiązki pompującej – sygnał CARS jest przesunięty w kierunku niebieskiej części widma światła (przeciwnie do reguły Stokesa). Dzięki koherentnemu wzbudzeniu wibracji w cząsteczce – sygnał CARS jest około 105 razy silniejszy od sygnału generowanego przez konwencjonalne widmo Ramana. Za sprawą tego wzmocnienia możliwe jest nawet przyżyciowe obrazowanie w technice CARS z dużą prędkością odczytu.
fokalna preparatu, o największej ostrości [4]. Taka sytuacja daje możliwość akwizycji sygnału CARS z poszczególnych warstw preparatu i wykonania trójwymiarowej rekonstruk-cji próbki podobnie jak to ma miejsce w konwencjonalnej mikroskopii konfokalnej. O ile jednak w mikroskopii kon-fokalnej, przy jednofotonowym wzbudzeniu, należy użyć przysłony konfokalnej (ang. pinhole) dla odcięcia sygnału niepochodzącego z płaszczyzny fokalnej preparatu, o tyle w mikroskopii CARS przysłona pinhole staje się niepotrzebna, gdyż sygnał w próbce nie jest już emitowany z warstw poza ogniskiem obiektywu [7]. W systemach CARS możemy więc prowadzić detekcję sygnału na zewnętrznych detektorach punktowych podłączonych bezpośrednio do statywu mi-kroskopu, jak najbliżej próbki, bez potrzeby angażowania dodatkowych elementów optycznych w skanerze mikro-skopu (są to detektory NDDs, ang. Non-Descanned Detectors) [8]. Jako detektory NDDs można użyć konwencjonalnych detektorów PMT (fotopowielaczy), bądź też o wiele czul-szych detektorów HyD będących hybrydą: fotopowielacza mającego fotokatodę wykonaną z arsenku galu (GaAsP) z fotodiodą lawinową (APD) [9]. Detektory NDDs mogą być umieszczone za obiektywem mikroskopu, analizując sy-gnał, który został zebrany przez obiektyw (epi-CARS) lub też za kondensorem, do detekcji sygnału, który przeszedł przez badany materiał (trans-CARS). Pierwsza konfiguracja (epi) sprawdza się lepiej przy analizie grubszych prepara-tów, tkanek lub nawet całych organizmów, podczas gdy druga (trans) doskonale nadaje się do badania cienkich pró-bek [3].
Wiązka pompująca (ωp) i wiązka Stokesa (ωS), generowa-ne przez pikosekundowy system laserowy, są kierowagenerowa-ne do próbki przez układ zwierciadeł dichroicznych. W prób-ce powstaje sygnał CARS (ωCARS) o wyższej energii od wią-zek światła wzbudzającego, który może być zbierany przez zewnętrzne detektory NDDs do światła przechodzącego (trans-CARS) lub dla światła odbitego (epi-CARS). Kolory użyte do zaznaczania wiązek na schemacie (Ryc. 3) są sym-boliczne – do wzbudzenia próbki używane jest niewidzial-ne dla człowieka światło podczerwoniewidzial-ne.
ZASTOSOWANIA CARS W BADANIACH BIOLOGICZNYCH
Ogromną zaletą mikroskopii CARS jest możliwość wi-zualizacji różnorodnych preparatów biologicznych, bez konieczności ich utrwalania czy znakowania struktur we-wnątrzkomórkowych barwnikami fluorescencyjnymi. Do-datkowo, podobnie jak w obrazowaniu dwufotonowym, preparat pochłania sumarycznie niższą energię, skupioną jedynie w ograniczonym obszarze w płaszczyźnie ogni-skowania. Ze względu na tę niską fototoksyczność możli-wa staje się wydłużona, przyżyciomożli-wa obsermożli-wacja materiału biologicznego. Ponadto, w przeciwieństwie do wzbudzania fluorescencji, obserwuje się preparat w formie natywnej, bez zmian, które potencjalnie może wywołać proces przygoto-wania preparatu do obrazoprzygoto-wania (utrwalenie i wybarwie-nie zwykle stosowane w mikroskopii konfokalnej). Z tego powodu technika CARS już cieszy się stosunkowo dużym zainteresowaniem w naukach biologicznych. Bardzo dobre wyniki uzyskuje się m.in. w badaniach lipidów, co pozwala np. na obrazowanie tkanek także w żywych organizmach (jako alternatywa dla tradycyjnej histologii).
W badaniach biologicznych najpowszechniej dotąd wy-korzystywanym ustawieniem wiązki pompującej lasera jest wzbudzenie drgań wiązania C-H (przy częstości ra-manowskiej ~2850 cm–1), dzięki któremu jest możliwa
wi-zualizacja obszarów o dużej koncentracji takich wiązań, a zatem przede wszystkim tłuszczowców [10]. W hodowlach komórkowych i badaniach tkanek obrazowanych przy ta-kim ustawieniu modułu CARS, zwykle dobrze widoczne są struktury błoniaste, tj.: błona cytoplazmatyczna i otocz-ka jądrowa. Aparat Golgiego i siateczotocz-ka endoplazmatycz-na są endoplazmatycz-natomiast trudniejsze do rozróżnienia, obserwowane częściej jako sygnał rozproszony w cytoplazmie (Ryc. 4). Pomimo, że obrazowanie CARS nie pozwala uzyskać np. wyraźnych linii cytoszkieletu, do jakich przyzwyczajeni są badacze stosujący wybarwienie fluorescencyjne akty-ny, nadaje się znakomicie do obserwacji zmian w układzie pęcherzyków tłuszczu czy typowych struktur w głębokich warstwach tkanek. Technika CARS jako alternatywa dla badań histologicznych, możliwa do zastosowania in vivo budzi duże zainteresowanie i obok SRS (ang. Stimulated
Ra-man Scaterring) jest uważana za technikę nie tylko
wnoszą-cą nowy wkład w zrozumienie biologii komórki, ale także możliwą do wykorzystania w przyszłości w bezinwazyjnej diagnostyce oraz w celu ewaluacji efektywności terapii [10].
Przykładem na zastosowanie mikroskopii CARS w ba-daniach tkanek może być obrazowanie siatkówki w mysim oku. W badaniach tych udało się uzyskać imponująco do-kładny obraz 5 warstw zróżnicowanych komórek (od spo-jówki po fotoreceptory) bez specjalnego przygotowania pre-paratu [11]. W innych badaniach przetestowano możliwość obrazowania rogówki z całego oka myszy i oceniono przy-datność techniki CARS do uzyskiwania obrazów porówny-walnych z histologicznymi [12]. Podobnie satysfakcjonujące wyniki można uzyskać np. śledząc odróżnicowywanie ko-mórek macierzystych w kierunku osteoblastów, przy czym wykorzystując inne częstości ramanowskie uzyskiwano nie tylko sygnał uwidaczniający typowe struktury komórkowe ale także sygnał CARS od odkładanego hydroksyapatytu
[13,14]. W ocenie stopnia regeneracji tkanek łącznych szcze-gólnie często stosuje się także generowanie efektu drugiej harmonicznej (SHG, ang. second harmonic generation), które jest dostępne w systemach mikroskopii dwufotonowej ta-kich jak CARS i uwidacznia struktury równoległe tworzone przez prawidłowo odkładający się kolagen. Badania pro-wadzone na skórze wydają się szczególnie bliskie poten-cjalnemu wykorzystaniu techniki CARS komercyjnie, przez firmy kosmetyczne czy farmaceutyczne. Obecnie jest już możliwa ocena „stanu zdrowia” skóry z wykorzystaniem CARS [15]. Natomiast dzięki specjalnej konstrukcji stoso-wanego mikroskopu wykonywane jest także obrazowanie skóry myszy in vivo oraz śledzenie transportu przez nią np. oleju mineralnego [16]. Obrazowanie transportu konkretne-go, niewyznakowanego fluorescencyjnie związku poprzez tkanki lub wręcz wewnątrz komórki to jedno z najatrakcyj-niejszych potencjalnych zastosowań CARS. Jest ono teore-tycznie możliwe, jednak w praktyce sukces podobnych ba-dań zależy po pierwsze od istnienia odpowiedniego piku w widmie badanego związku, który nie nakładałby się na częstotliwości używane do obrazowania komórek oraz od lokalnego stężenia tego związku, aby siła sygnału była wy-starczająca do uzyskania wyraźnego obrazu. Za przykład
badań z tej dziedziny może posłużyć obrazowanie CARS procesu wnikania leków w skórę świni [17].
Lipidy zgromadzone w postaci kropel wewnątrz ko-mórek są obserwowane w mikroskopii CARS jako wysoce kontrastowy, intensywny sygnał przy częstości ramanow-skiej ~2850 cm–1 (Ryc. 4). W prezentowanym eksperymencie
wywołano efekt gromadzenia kropel tłuszczu wewnątrz ludzkich keratynocytów celem porównania możliwości obserwacji mikroskopowej przy pomocy CARS i barwienia fluorescencyjnego barwnikiem NileRed, powszechnie wy-korzystywanego do określania ilości lipidów. Obrazowanie CARS ma przewagę nad barwieniem zarówno z punktu widzenia czasochłonności przygotowania preparatu jak i czytelnego rozróżnienia poszczególnych kropel tłuszczu z możliwością ich ilościowej oceny przy dalszej analizie uzyskanych obrazów (pomiar wielkości i zliczenie ilości) (Ryc. 4). Badanie dystrybucji i dynamiki tworzenia kropel lipidowych wewnątrz adipocytów (komórek tłuszczowych) jest jednym z najczęściej publikowanych zastosowań bio-logicznych CARS. Widowiskowym przykładem takich ba-dań są przyżyciowe analizy CARS w czasie rzeczywistym, których wyniki dostępne także w postaci filmów, ujawniły przebieg procesu tworzenia się i wchłaniania mniejszych
Rycina 4. Ludzkie keratynocyty (komórki linii HaCaT) stymulowane do gromadzenia kropel tłuszczu przy pomocy kwasu oleinowego i SDS, obrazowane przy pomocy mikroskopii CARS (a, b, c) w porównaniu do obrazowania fluorescencyjnego po wybarwieniu NileRed (d, e, f). Keratynocyty linii HaCaT hodowano w DMEM o stężeniu glukozy 4,5 g/l, 1% FBS, 100 U/ml penicyliny, 100 µg/ml streptomycyny (37°C, 5% CO2), komórki kontrolne –zdjęcia a, d; komórki inkubowane przez 48 godz. z kwasem oleinowym o roboczym stężeniu 300 µM – zdjęcia b, e; komórki inkubowane przez 20 godz. z SDS o końcowym stężeniu 15 µg/ml – zdjęcia c, f. Skala: 10 µm. Badania wykonano w Laboratorium Biotechnologii Molekularnej Bionanoparku w Łodzi z zastosowaniem laserowo skanującego mikroskopu konfokalnego Leica TCS SP8 z modułem CARS.
kropel lipidowych przez większe [18]. Inne prace świadczą natomiast, że ocena ilości kropel tłuszczu zgromadzonych w komórkach wątroby przy pomocy CARS może stanowić bardziej czułą alternatywę dla tradycyjnych badań histolo-gicznych wybarwianych preparatów tkanek. Przeprowa-dzono ocenę skrawków wątroby myszy w różnych stop-niach zaawansowania stłuszczenia wątroby i pokazano, że obrazowanie CARS, w połączeniu z analizą intensywności sygnału pochodzącego od kropel tłuszczu z użyciem pro-gramu ImageJ, pozwala na identyfikację wcześniejszych eta-pów rozwoju choroby niż tradycyjne metody histologiczne [19]. Możliwe jest też zastosowanie analizy ilości i rozkładu kropel lipidowych w komórkach nowotworu piersi do oce-ny stopnia złośliwości komórek [20]. W tych badaniach wy-korzystano fakt stopniowego zmniejszania się ilości tłusz-czu gromadzonego wewnątrz komórek prawidłowych w miarę postępu procesu nowotworzenia. Innym przykładem możliwości rozróżnienia tkanki guza od otaczającej zdrowej tkanki, na podstawie niższej zawartości tłuszczu, uwidacz-nianej przez technikę CARS jako ciemniejsze obszary pre-paratu tkankowego, są badania mózgowia myszy z zaindu-kowanymi ludzkimi guzami glejaka, czerniaka i raka piersi [21]. Uzyskane obrazy mają rozdzielczość porównywalną z klasycznie barwionymi preparatami, a nawet pozwalają na
rozróżnienie pojedynczych komórek na granicy guz/zdro-wa tkanka.
Obrazowanie żywych komórek z zastosowaniem mikro-skopii konfokalnej z modułem CARS otwiera przed bada-czami specjalizującymi się w inżynierii tkankowej wcześniej niedostępną możliwość monitorowania procesu integracji komórek z trójwymiarowym rusztowaniem w czasie rze-czywistym, bez ingerencji w próbkę [22]. W cytowanych badaniach uzyskano także sygnał drugiej harmonicznej po-chodzący od włóknistego biomateriału zastosowanego jako rusztowanie (ang. scaffold). Jedynym warunkiem, jaki musi spełnić badana w ten sposób trójwymiarowa hodowla ko-mórkowa to przejrzystość materiału. Jeżeli preparat prze-puszcza promieniowanie możliwe jest wykonanie skanu w osi Z w głąb testowanego rusztowania z wrastającymi komórkami na głębokość nawet do 500 µm, co zostało osią-gnięte podczas obrazowania procesu wrastania neurytów w hydrożel GAG [23]. Jeżeli eksperyment jest wykonywany w odpowiednich naczynkach hodowlanych (o dnie szklanym grubości szkiełka nakrywkowego) po wykonaniu obrazo-wania komórki mogą nadal być hodowane i monitorowane w kolejnych odstępach czasu bez wpływu na badaną prób-kę nawet przez 8 tygodni.
Rycina 5. Obrazowanie frakcji: lipidowej (zdjęcia a i d) i wodnej (zdjęcia b i e) w dwóch emulsjach z użyciem mikroskopii CARS. Badane produkty kosmetyczne to: krem ochronny do rąk (zdjęcia: a, b, c) i nawilżające mleczko do ciała (zdjęcia: d, e, f). Zastosowane częstości ramanowskie: 2848 cm-1 dla frakcji tłuszczowej (a, d) oraz 3150 cm-1 dla frakcji wodnej (b, e). Zdjęcia c i f stanowią złożenie obrazów dla obu frakcji. Skala: 10 µm. Badania wykonano w Laboratorium Biotechnologii Molekularnej Bion-anoparku w Łodzi z zastosowaniem laserowo skanującego mikroskopu konfokalnego Leica TCS SP8 z modułem CARS.
ZASTOSOWANIA CARS W BADANIACH (BIO)MATERIAŁOWYCH
Do jednych z pierwszych opisanych zastosowań techniki CARS należą analizy struktury emulsji typu WOW (water--oli-water) [24], a także zastosowanie jej do rozróżniania na-syconych i nienana-syconych kwasów tłuszczowych w olejach wchłoniętych przez adipocyty [25]. Drugie z wymienionych osiągnięć jest szczególnie atrakcyjne w badaniach metabo-lizmu tłuszczowców, a zostało zrealizowane poprzez ana-lizę zmian stosunku intensywności sygnałów uzyskanych dla wibracji wiązania C-H (silny sygnał przy częstości 2850 cm−1) i wiązania =C-H (słaby sygnał przy częstości około
3015 cm−1) [25].
Obserwacja rozmieszczenia przestrzennego tłuszczu w emulsjach może okazać się interesująca z praktycznego punktu widzenia – np. dla przemysłu spożywczego czy kosmetycznego podczas opracowywania formulacji no-wych produktów. Wielkość i stopień jednorodności kropel tłuszczu ma wpływ na konsystencję, a zatem właściwości organoleptyczne produktu. Natomiast np. zawartość frak-cji tłuszczowej w stosunku do frakfrak-cji wodnej zmienia prze-znaczenie kosmetyku. Ewidentne różnice w strukturach wewnętrznych dwóch emulsji uwidocznione przy pomocy CARS (Ryc. 5) dobrze odzwierciedlają odmienne funkcje, jakie mają spełniać badane produkty (porównano ochronny krem do rąk z nawilżającym mleczkiem do ciała).
Innym aspektem badań biologicznych na styku z mate-riałowymi jest śledzenie losu cząsteczek, w tym nanoczą-steczek, podawanych do hodowli komórkowych bez
ko-nieczności chemicznej modyfikacji badanych związków po-legającej na dodaniu ugrupowań fluoroforowych, których obecność może w sposób znaczący wpływać na transport przez błonę komórkową i końcową lokalizację wewnątrz komórki. Przykładowo, przy pomocy mikroskopii CARS dowiedziono możliwości wnikania nanodiamentów do wnętrza komórek HeLa [26].
Dotychczas nieliczne są prace wykorzystujące mikrosko-pię CARS w badaniach komórek roślinnych, ale powstało dość obszerne opracowanie dotyczące obrazowania mate-riałów pochodzenia roślinnego: skrobi oraz włókien baweł-ny [27], co poszerza możliwości zastosowania tego sposobu charakteryzowania próbek spożywczych czy tekstylnych. Konfokalna mikroskopia CARS jest również wykorzysty-wana w badaniach materiałowych sensu stricto – np. do obrazowania trójwymiarowej sieci porowatej membrany PVDF optymalizowanej do zastosowania np. w bateriach litowo-jonowych [28], zatem zainteresowanie tą techniką przekracza nauki pokrewne biologii i biochemii.
Podsumowując, dotychczasowe zastosowania mikrosko-pii CARS w badaniach biologicznych i (bio)materiałowych świadczą o dużym potencjale techniki i w najbliższym cza-sie należy spodziewać się poszerzenia listy znanych apli-kacji CARS, jaka została przedstawiona w Tabeli 2. Mamy nadzieję, że do pomnożenia znanych aplikacji CARS przy-czyni się dostępność pierwszego takiego systemu w Polsce w Bionanoparku w Łodzi. Możliwa jest współpraca z Labo-ratorium Biotechnologii Molekularnej zarówno na zasadach komercyjnych jak i naukowych.
Tabela 2. Obszary potencjalnych zastosowań mikroskopii CARS.
Dziedzina Przykład możliwych badań
Diagnostyka medyczna histologia na nieutrwalonym preparacie; ocena stopnia zaawansowania stłuszczenia wątroby; ocena z rozdzielczością komórkową granicy tkanki zmienionej nowotworowo; zmiany skórne; choroby neurodegeneracyjne Nowotwory gęstość jądra komórkowego, rozproszenie związków o znanych pasmach ramanowskich w komórkach, stopień zaawansowania procesów nowotworowych w komórkach z bioptatu
Neurologia mechanizmy transdukcji sygnału, analizy błon, zawartość lipidów w mózgu
Dermatologia transport i metabolizm lipidów i substancji czynnych w skórze, diagnostyka nowotworów, szlaki sygnałowe transportu przez skórę, dobór formulacji produktów (np. emulsji) do leczenia i pielęgnacji skóry Choroby cywilizacyjne cukrzyca, otyłość, choroby kardiologiczne, choroby związane z zaburzeniami procesów gromadzenia kropel lipidowych wewnątrz komórek (np. stłuszczenie wątroby)
Inżynieria tkankowa monitorowanie procesu wrastania komórek w materiał stanowiący rusztowanie 3D przez długi czas hodowli; ocena prawidłowości odtworzenia typowych struktur tkankowych, analiza procesu różnicowania komórek macierzystych (np. w kierunku osteoblastów)
Nauki farmaceutyczne mechanizmy transportu leków, analiza toksykologiczna, szlaki sygnałowe lipidów, oddziaływania pomiędzy związkami, rozwój właściwej formulacji produktów zdrowotnych w postaci emulsji
Przemysł spożywczy skład żywności, zawartość i rozproszenie tłuszczu, rozwój nowych składników żywności, kontrola jakości żywności, opracowywanie nowych dodatków do żywności poprawiających np. trwałość emulsji czy konsystencję produktu
Przemysł kosmetyczny badanie kondycji skóry po aplikacji produktów kosmetycznych, dobór właściwego składu produktu dla uzyskania odpowiedniej konsystencji (emulsje), kontrola wpływu składników preparatów kosmetycznych na komórki w czasie długotrwałej ekspozycji
PODSUMOWANIE
Nauka ciągle rozwija się, biegnie, wymykając się utartym schematom. Być może wykorzystanie widm Ramana w ge-nerowaniu obrazów niewyznakowanych cząsteczek w pre-paracie otworzy furtkę do zupełnie nowego działu mikro-skopii? Istnieją niewątpliwe zalety tego typu obrazowania [3], które można podsumować w kilku punktach:
1. Przede wszystkim technologia CARS pozwala na obra-zowanie próbek z wykorzystaniem kontrastu tworzone-go na podstawie wewnętrznych drgań molekularnych próbki. Eliminuje to potrzebę stosowania zewnętrznych znaczników fluorescencyjnych oraz zmniejsza możliwość występowania efektów fototoksycznych w preparacie. 2. Technologia Coherent Anti-Stokes Raman Scattering
za-pewnia 105 razy silniejszy sygnał niż analogiczny,
spon-taniczny sygnał z widma Ramana generowany przez wi-brację cząsteczek. Pozwala to na szybszą akwizycję obra-zów w mikroskopie, a więc również obserwację żywych próbek biologicznych w czasie rzeczywistym.
3. Sygnał CARS emitowany przez próbkę ma większą ener-gię, niż wiązki fali wzbudzającej (jest więc przeciwny do reguły Stokesa). Stąd też jego detekcja odbywa się przy krótszych długościach fali co eliminuje nakładanie się sygnału CARS z sygnałem z fluorescencji wzbudzanych cząsteczek.
4. Nieliniowy charakter wzbudzania sygnału CARS powo-duje jego generowanie tylko w płaszczyźnie ogniskowej obiektywu. To z kolei daje możliwość tworzenia sekcji optycznych i trójwymiarowej rekonstrukcji preparatu. 5. Światło podczerwone (NIR) użyte do wzbudzania
sygna-łu CARS mniej rozprasza się w próbce i może ją pene-trować do głębokości 0,5 mm. Technika CARS nadaje się więc do analizy grubszych preparatów.
Należy również wspomnieć o istniejących obecnie ogra-niczeniach mikroskopii CARS, które trzeba jeszcze prze-zwyciężyć, m.in.:
1. Ograniczona liczba rodzajów cząsteczek, które mogą być modułem CARS wzbudzane – praca nad źródłami świa-tła o szerszym zakresie emitowanych długości fal świaświa-tła powinna pomóc poszerzyć tę listę.
2. Rozdzielczość powstałego w technice CARS obrazu obecnie wynosi powyżej 350 nm – w dobie mikrosko-pów superrozdzielczych (rozdzielczość poniżej 200 nm) nie jest to technika umożliwiająca dokładną rejestrację morfologii nanometrowych organelli komórkowych. Z drugiej jednak strony rozdzielczość ta jest zupełnie wy-starczająca do analizy materiałowej większych próbek czy grubszych fragmentów tkanek.
3. Technika CARS wymaga wykonywania dokładnej kali-bracji wiązek wzbudzających dla pikosekundowych la-serów NIR. Są już jednak obecnie na rynku komercyjne systemy do obrazowania CARS dostępne jako moduł dla
laserowego mikroskopu konfokalnego [5] z intuicyjnym oprogramowaniem sterującym, które może maksymalnie uprościć procedurę akwizycji obrazu CARS.
Pomimo jednak tych ograniczeń postępy jakie dokonały się w ostatniej dekadzie w rozwoju techniki CARS stawiają ją w gronie najnowocześniejszych i dobrze rozwijających się technik mikroskopowych. Możliwość wykonywania trój-wymiarowych rekonstrukcji niewybarwionego badanego materiału, jak również weryfikacji jego składu chemicznego, otwiera dla tej techniki drogę do wykorzystania w biologii i medycynie i analizie materiałowej. W tej pracy wymienio-no jedynie niektóre z zastosowań tej techniki. Należy obec-nie liczyć na kreatywność i innowacyjność badaczy, którzy znajdą dla metody CARS wiele innych, nawet niekonwen-cjonalnych i trudnych do przewidzenia zastosowań.
PIŚMIENNICTWO
1. Lalkens B, Testa I, Willig KI, Hell SW (2012) MRT letter: Nanoscopy of protein colocalization in living cells by STED and GSDIM. Microsc Res Tech 75: 1-6
2. Mullins JM (1994) Overview of fluorophores. Methods Mol Biol 34: 107-116
3. Evans CL, Xie XS (2008) Coherent anti-Stokes Raman Scattering mi-croscopy: chemical imaging for biology and medicine. Annu Rev Anal Chem 1: 883-909
4. Rodriguez LG, Lockett SJ, Holtom GR (2006) Coherent anti-Stokes Raman Scattering microscopy: a biological review. Cytometry A 69: 779-791
5. Degenhartt S (2011) An introduction to CARS microscopy. Leica Sci-ence Lab http://www.leica-microsystems.com/sciSci-ence-lab/an-intro- http://www.leica-microsystems.com/science-lab/an-intro-duction-to-cars-microscopy/
6. Ganikhanov F, Carrasco S, Xie XS, Katz M, Seitz W, Kopf D (2006) Broadly tunable dual-wavelength light source for Coherent an-ti-Stokes Raman scattering microscopy. Opt Lett 31: 1292–1294 7. Korczyński J (2013) Nowy wymiar mikroskopii – skanujący laserowy
mikroskop konfokalny. Kosmos 299: 149-160
8. Cheng JX (2007) Coherent anti-Stokes Raman Scattering microscopy. Appl Spectrosc 61: 197-208
9. Suyama M, Lares M (2008) Photomultipliers: Hybrid detector combi-nes PMT and semiconductor-diode technologies. Laser Focus World 44
10. Cheng J-X, Xie XS (2015) Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine. Science 350: aaa8870
11. Masihzadeh O, Ammar DA, Kahook MY, Lei TC (2013) Coherent anti-Stokes Raman Scattering (CARS) microscopy: a novel technique for imaging the retina. Invest Ophthalmol Vis Sci 54: 3094-3101
12. Ammar DA, Lei TC, Kahook MY, Masihzadeh O (2013) Imaging the intact mouse cornea using Coherent anti-Stokes Raman Scattering (CARS). Invest Ophthalmol Vis Sci 54: 5258-5265
13. Hofemeier AD, Hachmeister H, Pilger C, Schürmann M, Greiner JF, Nolte L, Sudhoff H, Kaltschmidt C, Huser T, Kaltschmidt B (2016) Label-free nonlinear optical microscopy detects early markers for os-teogenic differentiation of human stem cells. Sci Rep 6: 26716 14. Moura CC, Tare RS, Oreffo RO, Mahajan S (2016) Raman
spectrosco-py and Coherent anti-Stokes Raman Scattering imaging: prospective tools for monitoring skeletal cells and skeletal regeneration. J R Soc Interface 13
15. Breunig HG, Bückle R, Kellner-Höfer M, Weinigel M, Lademann J, Sterry W, König K (2012) Combined in vivo multiphoton and CARS imaging of healthy and disease-affected human skin. Microsc Res Tech 75: 492-498
16. Evans CL, Potma EO, Puoris’haag M, Cote D, Lin CP, Xie XS (2005) Chemical imaging of tissue in vivo with video-rate Coherent anti-Stokes Raman Scattering microscopy. PNAS 102: 16807-16812
Watching dance of the molecules – CARS microscopy
Jaroslaw Korczynski
1,*, Katarzyna Kubiak
2, Edyta Weglowska
21Scientific Research Advisory Centre Kawa.ska Sp. z o.o. 5 Techniczna St., 05-500 Piaseczno, Poland 2 Molecular Biotechnology Laboratory,Bionanopark Sp. z o.o., 114/116 Dubois St., 93-465 Lodz, Poland *e-mail: jaroslaw.korczynski@kawaska.pl
Key words: Confocal microscopy, Raman spectrum, Raman spectroscopy, CARS microscopy ABSTRACT
CARS (Coherent Anti-Stokes Raman Scattering) microscopy is an imaging method for living cells visualization as well as for food or cosme-tics material analysis without the need for staining. The near infrared laser source generates the CARS signal – the characteristic intrinsic vi-brational contrast of the molecules in a sample which is no longer caused by staining, but by the molecules themselves. It provides the benefit of a non-toxic, non-destructive and almost noninvasive method for sample imaging. CARS can easily be combined with fluorescence confocal microscopy so it is an excellent complementary imaging method. In this article we showed some of the applications for this technology: ima-ging of lipid droplets inside human HaCaT cells and analysis of the composition of cosmetic products. Moreover we believe, that soon new fields of application become accessible for this rapidly developing branch of microscopy.
17. Belsey NA, Garrett NL, Contreras-Rojas LR, Pickup-Gerlaugh AJ, Price GJ, Moger J, Guy RH (2014) Evaluation of drug delivery to intact and porated skin by Coherent Raman Scattering and fluorescence mi-croscopies. J Control Release 174: 37-42
18. Paar M, Jüngst C, Steiner NA, Magnes C, Sinner F, Kolb D, Lass A, Zimmermann R, Zumbusch A, Kohlwein SD, Wolinski H (2012) Re-modeling of lipid droplets during lipolysis and growth in adipocytes. J Biol Chem 287: 11164-11173
19. Le TT, Ziemba A, Urasaki Y, Brotman S, Pizzorno G (2012) Label-free evaluation of hepatic microvesicular steatosis with multimodal Cohe-rent anti-Stokes Raman Scattering microscopy. PLoS ONE 7: e51092 20. Potma EO (2010) Tissue Imaging with Coherent Anti-Stokes Raman
Scattering Microscopy, W: Gokulakrishnan S (red) Vibrational Spec-troscopic Imaging for Biomedical Applications. McGraw-Hill Proffe-sional, AccessEngineering, New York, Chicago, San Francisco, Lisbon, London, Madrid, Mexico City, Milan, New Delhi, San Juan, Seoul, Sin-gapore, Sydney, Toronto, str. 319-342
21. Uckermann O, Galli R, Tamosaityte S, Leipnitz E, Geiger KD, Schac-kert G, Koch E, Steiner G, Kirsch M (2014) Label-free delineation of brain tumors by Coherent anti-Stokes Raman Scattering microscopy in an orthotopic mouse model and human glioblastoma. PLoS ONE 9: e107115
22. Brackmann C, Esguerra M, Olausson D, Delbro D, Krettek A, Gaten-holm P, Enejder A (2011) Coherent anti-Stokes Raman Scattering
mi-croscopy of human smooth muscle cells in bioengineered tissue scaf-folds. J Biomed Opt 16: 021115
23. Conovaloff A, Wang H-W, Cheng J-X, Panitch A (2009) Imaging growth of neurites in conditioned hydrogel by coherent anti-stokes raman scattering microscopy. Organogenesis 5: 231-237
24. Meyer T, Akimov D, Tarcea N, Chatzipapadopoulos S, Muschiolik G, Kobow J, Schmitt M, Popp J (2008) Three-dimensional molecular map-ping of a multiple emulsion by means of CARS microscopy. J Phys Chem B 112: 1420-1426
25. Heinrich C, Hofer A, Ritsch A, Ciardi C, Bernet S, Ritsch-Marte M (2008) Selective imaging of saturated and unsaturated lipids by wide--field CARS-microscopy. Opt Express 16: 2699-2708
26. Pope I, Payne L, Zoriniants G, Thomas E, Williams O, Watson P, Lang-bein W, Borri P (2014) Coherent anti-Stokes Raman Scattering micro-scopy of single nanodiamonds. Nat Nanotechnol 9: 940-946
27. Slepkov AD, Ridsdale A, Pegoraro AF, Moffatt DJ, Stolow A (2010) Multimodal CARS microscopy of structured carbohydrate biopoly-mers. Biomed Opt Express 1: 1347-1357
28. Jeschke S, Mutke M, Jiang Z, Alt B, Wiemhöfer HD (2014) Study of car-bamate-modified disiloxane in porous PVDF-HFP membranes: new electrolytes/separators for lithium-ion batteries. Chemphyschem 15: 1761-1771
