1
INSTYTUT CHEMII BIOORGANICZNEJ POLSKIEJ
AKADEMII NAUK W POZNANIU
Paula Michalak
STRUKTURA DRUGORZĘDOWA PIĄTEGO
SEGMENTU vRNA WIRUSA GRYPY TYPU A I JEJ
WYKORZYSTANIE W PROJEKTOWANIU
ANTYSENSOWYCH OLIGONUKLEOTYDÓW
Praca doktorska została wykonana
w Zakładzie Genomiki Strukturalnej RNA
Promotor:
dr hab. Elżbieta Kierzek, prof. IChB PAN
2
Serdeczne podziękowania składam
Pani Profesor Elżbiecie Kierzek
za wyrozumiałość, okazaną pomoc oraz opiekę promotorską
Panu Profesorowi Ryszardowi Kierzkowi
dziękuję za cenne rady i uwagi
Zakładowi Genomiki Strukturalnej RNA dziękuję za wspólne rozmowy i
wspaniałą atmosferę koleżeńską
Pracę dedykuję mojej Rodzinie, a w szczególności Tomaszowi,
w podziękowaniu za wieloletnie wsparcie oraz
3
SPIS TREŚCI
CEL PRACY ... 6 STRESZCZENIE ... 8 ABSTRACT ... 10 WYKAZ STOSOWANYCH SKRÓTÓW ... 12 II. WSTĘP TEORETYCZNY ... 14 1. Wprowadzenie ... 142. Wirus grypy typu A ... 14
2.1. Podstawowe informacje o wirusie ... 14
2.2. Wirus ptasiej grypy ... 16
2.3. Budowa wirionu wirusa grypy typu A ... 17
2.4. Znaczenie struktury vRNP ... 18
2.5. Cykl replikacyjny wirusa grypy typu A ... 19
3. Wirusy grypy pozostałych typów ... 25
4. Kierunki terapeutyczne w leczeniu grypy ... 28
4.1. Leki stosowane w leczeniu grypy... 28
4.2. Nanotechnologia w walce z grypą ... 31
4.3. Oligonukleotydy antysensowe ... 32
4.4. Modyfikacje i dokomórkowy transport antysensowych oligonukleotydów ... 34
5. Profilaktyka zakażeń wirusem grypy ... 36
6. Pozostałe wirusy z rodziny Orthomyxoviridae ... 37
7. Motywy strukturalne RNA wirusa grypy ... 40
8. Metody przewidywania struktur RNA ... 43
8.1. Przewidywanie struktury drugorzędowej RNA ... 43
8.2. Przewidywanie struktury trzeciorzędowej RNA ... 46
III. WYNIKI I DYSKUSJA ... 49
1. Badania struktury drugorzędowej vRNA5 ... 49
1.1. Otrzymanie i fałdowanie vRNA5 ... 49
1.2. Mapowanie chemiczne struktury drugorzędowej vRNA5 ... 50
1.3. Optymalizacja reakcji odwrotnej transkrypcji ... 51
1.4. Reaktywność vRNA5 wobec odczynników mapujących ... 56
1.5. Model struktury drugorzędowej vRNA5 ... 59
1.6. Prawdopodobieństwo występowania par zasad i niesparowań w strukturze drugorzędowej vRNA5 wirusa grypy typu A ... 61
1.7. Analiza dostępności struktury vRNA5 do wiązania sond mikromacierzy izoenergetycznych ... 63
1.8. Analiza dostępności rejonów jednoniciowych cząsteczki vRNA5 dla hybrydyzacji oligonukleotydów z wykorzystaniem rybonukleazy H ... 67
2. Badania inhibicji namnażania wirusa grypy w obecności oligonukleotydów antysensowych ... 73
2.1. Projektowanie oligonukleotydów antysensowych w oparciu o strukturę drugorzędową vRNA5 .... 73
2.2. Wpływ oligonukleotydów antysensowych na namnażanie wirusa grypy ... 78
2.3. Określenie wydajności transfekcji komórek MDCK oligonukleotydami antysensowymi ... 80
2.4. Optymalizacja infekcji ... 82
2.5. Inhibicja namnażania wirusa sciIAV ... 83
2.6. Inhibicja namnażania wirusa A/California/04/2009 (H1N1) typu dzikiego. ... 85
2.7. Określenie cytotoksyczności oligonukleotydów antysensowych. ... 92
3. Oligonukleotydy antysensowe w badaniach namnażania wirusa grypy typu A- wyniki innych grup badawczych ... 94
4. Model struktury trzeciorzędowej vRNA5 wirusa grypy typu A ... 96
5. Konserwatywność struktury drugorzędowej vRNA5... 102
6. Motyw pseudowęzła w vRNA5 ... 108
4
IV. MATERIAŁY I METODY ... 113
1. Wykaz stosowanego sprzętu laboratoryjnego ... 113
2. Materiały ... 114
2.1. Badania struktury RNA ... 114
2.1.1. Enzymy ... 114
2.1.2. Komercyjne zestawy ... 114
2.1.3. Zestawy do oczyszczania kwasów nukleinowych ... 114
2.1.4. Antybiotyki do hodowli komórek bakterii ... 114
2.1.5. Bufory ... 114
2.1.6. Pożywki ... 115
2.1.7. Elektroforeza ... 116
2.1.8. Markery wielkości kwasów nukleinowych ... 116
2.1.9. Odczynniki do modyfikacji RNA ... 116
2.1.10. Pozostałe odczynniki ... 117
2.1.11. Akcesoria ... 117
2.2. Hodowla linii komórkowej MDCK ... 117
2.2.1. Linie komórkowe ... 117
2.2.2. Odczynniki do hodowli komórkowej ... 117
2.2.3. Plastiki do hodowli komórkowej ... 117
2.2.4. Media hodowlane ... 118
2.3. Namnażanie wirusa grypy typu A ... 118
2.3.1. Stosowane szczepy wirusa grypy typu A ... 118
2.3.2. Media stosowane podczas infekcji ... 118
2.3.3. Odczynniki do izolacji RNA ... 119
2.3.4. Przeciwciała ... 119
2.3.5. Pozostałe odczynniki ... 119
2.3.6. Akcesoria ... 119
3. Metody ... 119
3.1. Badania struktury RNA ... 119
3.1.1. Transformacja komórek oraz izolacja plazmidów ... 119
3.1.2. Synteza oligonukleotydów ... 120
3.1.3. Odblokowywanie oligonukleotydów ... 120
3.1.4. Znakowanie starterów barwnikami fluorescencyjnymi ... 121
3.1.5. Chromatografia cienkowarstwowa (TLC) ... 121
3.1.6. Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym (PAGE) ... 121
3.1.7. Strącanie ... 121
3.1.8. Spektrometria mas ... 122
3.1.9. PCR – otrzymanie matrycy do transkrypcji in vitro vRNA5 ... 122
3.1.10. Elektroforeza w żelu agarozowym ... 122
3.1.11. Transkrypcja in vitro ... 123
3.1.12. Znakowanie vRNA5 [α32P] ATP ... 123
3.1.13. Oczyszczanie RNA po transkrypcji ... 123
3.1.14. Sekwencjonowanie oraz analiza kapilarna ... 123
3.1.15. Fałdowanie cząsteczki vRNA5 ... 123
3.1.16. Reakcja mapowania chemicznego ... 124
3.1.17. Reakcja odwrotnej transkrypcji ... 124
3.1.18. Przygotowanie płytek do drukowania mikromacierzy izoenergetycznych ... 125
3.1.19. Drukowanie mikromacierzy izoenergetycznych ... 126
3.1.20. Redukcja mikromacierzy izoenergetycznych ... 126
3.1.21. Hybrydyzacja vRNA5 do sond mikromacierzy izoenergetycznych ... 126
3.1.22. Analiza wyników uzyskanych z mikromacierzy izoenergetycznych ... 127
3.1.23. Hydroliza RNA rybonukleazą H ... 127
3.1.24. Kontrole wzorcowe wielkości rozdzielanych w elektroforezie kapilarnej produktów ... 127
3.1.25. Generowanie struktur drugorzędowych ... 128
3.1.26. Określenie prawdopodobieństwa występowania par zasad oraz rejonów jednoniciowych w modelu struktury drugorzędowej vRNA5 ... 128
5
3.1.27. Przewidywanie obecności pseudowęzłów w vRNA5 ... 128
3.2. Hodowla linii komórkowej MDCK ... 129
3.2.1. Hodowla linii komórkowej MDCK i MDCK-HA ... 129
3.2.2. Transfekcja komórek MDCK WT oraz MDCK-HA... 129
3.3. Namnażanie wirusa grypy typu A ... 130
3.3.1. Infekcja wirusowa ... 130
3.3.2. Znakowanie z użyciem przeciwciał ... 131
3.3.3. Izolacja RNA ... 131
3.3.4. qPCR ... 131
3.4. Badanie cytotoksyczności antysensowych oligonukleotydów w linii komórkowej MDCK ... 132
4. Wykaz sekwencji ... 132
4.1. Sekwencja segmentu 5 vRNA wirusa grypy szczepu A/Vietnam/1203/2004 (H5N1) ... 132
4.2. Sekwencja segmentu 5 vRNA wirusa grypy szczepu A/California/04/2009 (H1N1) ... 133
4.3. Sekwencja plazmidu– PHH21 (bez insertu) ... 133
4.4. Pozostałe sekwencje ... 134
6
CEL PRACY
Wirus grypy typu A jest poważnym zagrożeniem dla zdrowia i życia ludzi. Co roku dotyka nas epidemia grypy sezonowej. Rocznie choruje na grypę około miliarda osób, w tym u 3-5 milionów ludzi obserwuje się ciężki przebieg choroby, natomiast 250-500 tysięcy umiera z powodu infekcji lub powikłań pogrypowych. Istnieje też ciągłe zagrożenie pandemią grypy, która ma miejsce, gdy zwierzęcy wirus grypy (szczególnie ptasi) nabiera zdolność do transmisji pomiędzy ludźmi, powodując szybkie rozprzestrzenienie się choroby i gwałtowny jej przebieg. Zmienność genomowa wirusa grypy wynika z naturalnych błędów polimerazy wirusowej, które prowadzą do powstawania mutacji, a także ze zdolności wirusa do reasortacji genomu. Obecnie wciąż istnieją wirusy grypy o potencjale pandemicznym, na przykład, ptasi wirus grypy typu A (H5N1) czy (H7N9). Powoduje to konieczność zintensyfikowania prac badawczych nad wirusem, nowymi metodami zapobiegania grypy, jak i poszukiwaniem nowych związków i podejść o potencjalne terapeutycznymi.
Genom wirusa grypy składa się z ośmiu segmentów jednoniciowego RNA o ujemnej polarności (vRNA). Cykl życiowy wirusa jest na każdym jego etapie zależny od RNA. Ostatnie badania, także w Zakładzie Genomiki Strukturalnej RNA, wskazują, że wiedza o pofałdowaniu wirusowego RNA jest konieczna, aby lepiej zrozumieć biologię wirusa. Naturalna zmienność sekwencyjna RNA musi bowiem korelować z zachowaniem istotnych funkcyjnie motywów strukturalnych w wirusowym RNA. Zależność struktury i funkcji RNA wirusa grypy może z kolei być wykorzystana w projektowaniu skutecznych inhibitorów jego namnażania.
Głównym celem niniejszej pracy doktorskiej było określenie struktury drugorzędowej segmentu 5 vRNA wirusa grypy (vRNA5). Wiedza taka była podstawą w projektowaniu antysensowych oligonukleotydów mających inhibować namnażanie wirusa. Obiektem badań był segment 5 vRNA szczepu A/VietNam/1203/2004 (H5N1).
Szczegółowe cele badań były następujące:
1. Przeprowadzenie mapowań chemicznych metodą SHAPE oraz z zastosowaniem DMS, CMCT i ketoksalu dla określenia struktury drugorzędowej vRNA5.
2. Wykorzystanie metody mapowania mikromacierzowego, z użyciem mikromacierzy izoenergetycznych RNA, do weryfikacji struktury drugorzędowej i określenia dostępnych dla wiązania oligonukleotydów miejsc w vRNA5.
7 3. Określenie struktury drugorzędowej vRNA5 na podstawie danych eksperymenta-lnych z zastosowaniem programu RNAstructure.
4. Wyznaczenie rejonów w vRNA5, które pod względem dostępności w strukturze lub umiejscowienia w danym motywie strukturalnym stanowią dobry cel dla oligonukleotydów antysensowych.
5. Przeprowadzanie testów komórkowych z wykorzystaniem oligonukleotydów antysensowych na wybranym szczepie wirusa grypy H1N1 w linii komórkowej MDCK i określenie ich potencjalnych właściwości inhibitorowych w namnażaniu wirusa.
6. Przeprowadzenie analizy bioinformatycznej nakierowanej na poszukiwanie
konserwatywnych motywów strukturalnych w vRNA5 oraz określenie stopnia uniwersalności struktury drugorzędowej vRNA5 dla wirusa grypy typu A.
8
STRESZCZENIE
Wirus grypy typu A jest odpowiedzialny za śmierć prawie pół miliona osób rocznie. Niebezpieczeństwo, jakie niesie powoduje, że jest on obiektem badań wielu uczonych na całym świecie.
Przeprowadzone w ramach pracy doktorskiej badania miały na celu określenie struktury drugorzędowej piątego segmentu wirusa grypy typu A (vRNA5). Obiektem badań był vRNA5 szczepu A/Vietnam/1203/2004 (H5N1) o długości 1565 nt. Zaprezentowany w pracy doktorskiej model struktury drugorzędowej vRNA5 uwzględnia wyniki mapowania chemicznego. Eksperymenty mapowania chemicznego zostały wykonane z użyciem DMS, CMCT, ketoksalu oraz NMIA. Do przewidywania struktury drugorzędowej wirusowego RNA wykorzystano program RNAstructure. Do programu zostały wprowadzone wyznaczniki stanowiące wyniki z eksperymentów mapowania chemicznego. Struktura drugorzędowa vRNA5 wirusa grypy typu A została zaprezentowana po raz pierwszy. Struktura drugorzędowa vRNA5 posiada trzy domeny: domenę I (rejony 1-69 nt oraz 1285-1565 nt), domenę II (70-797 nt) oraz domenę III (798-1284 nt). W obrębie domeny III znajduje się wysoce ustrukturyzowany rejon 1065-1281nt wraz z stabilną spinką 1074-1115 nt. Określono także prawdopodobieństwo występowania par zasad i rejonów jednoniciowych w zaproponowanej strukturze drugorzędowej vRNA5.
W toku badań wykonano również eksperymenty z zastosowaniem mikromacierzy izoenergetycznych, które miały na celu zidentyfikować w vRNA5 rejony dostępne dla wiązania oligonukleotydów. Eksperymenty hybrydyzacyjne były prowadzone w 37C w dwóch różnych buforach (sodowy i potasowy). Przeprowadzone badania hydrolizy vRNA5 w obecności rybonukleazy H pozwoliły na potwierdzenie dostępności miejsc dla wiązania sond mikromacierzy izoenergetycznych. Do potwierdzonych dostępnych miejsc wiązania sond mikromacierzy izoenergetycznych należą pozycje 469, 646, 683, 883, 1073, 1251 oraz 1330. Otrzymane wyniki pozwoliły również potwierdzić wiązanie antysensowych oligonukleotydów do vRNA5 wirusa grypy typu A
Dokonano analizę konserwatywności zaproponowanej struktury drugorzędowej vRNA5 wirusa grypy typu A analizując sekwencje 18500 szczepów. Zachowawczość par zasad modelu zaprezentowanej w pracy doktorskiej struktury drugorzędowej vRNA5 wynosi 87,1%. Struktura drugorzędowa vRNA5 jest wysoce zachowawcza, co wskazuje, że niektóre motywy strukturalne mogą występować także u innych szczepów wirusa grypy typu A.
9 W oparciu o strukturę drugorzędową vRNA5 wirusa grypy typu A zostało zaprojektowanych 16 antysensowych oligonukleotydów. Rejony docelowe oligonukleotydów antysensowych uwzględniały także wyniki otrzymane z mikromacierzy izoenergetycznych Oligonukleotydy antysensowe posiadały modyfikacje typu LNA oraz 2'-O-MeRNA. Wśród oligonukleotydów znajdowały się także gapmery, których zadaniem było aktywowanie komórkowej rybonukleazy H.
Oligonukleotydy antysensowe zostały przetestowane pod kątem inhibicji namnażania wirusa grypy typu A. Badania zostały wykonano na modyfikowanej linii komórkowej MDCK-HA oraz wirusie sciIAV A/California/07/2009 (H1N1), a także na linii komórkowej MDCK oraz wirusie A/California/07/2009 (H1N1). W badaniach monitorowano zarówno poziom wirusowego RNA, jak i ilość wirusa. Przeprowadzone badania pozwoliły wyselekcjonować oligonukleotydy antysensowe najefektywniej hamujące namnażanie wirusa grypy typu A. Najlepszym oligonukleotydem antysensowym był 7.5L powodujący 88% inhibicję namnażania wirusa grypy A/California/07/2009 (H1N1). Oligonukleotyd ten wiąże się w rejonie dużej pętli (rejon 878-888 nt), której dostępność była potwierdzona hybrydyzacją sond mikromacierzy izoenergetycznych. Do oligonukleotydów wykazujących znaczną inhibicję namnażania wirusa grypy A/California/04/2009 (H1N1) należały także 4.5 (inhibicja na poziomie 64%), 11.5L i 11.5 (inhibicja na poziomie około 48%) oraz oligonukleotydy typu gapmer 19GP i 23GP (inhibicja powyżej 36%).
Oligonukleotydy antysensowe zostały zbadane pod kątem potencjalnej cytotoksyczności za pomocą testu MTT. Wykazano, że w stosowanych w eksperymentach stężeniach (0,5 µM) oligonukleotydy nie zmniejszały (lub tylko nieznacznie zmniejszały) przeżywalność komórek.
W oparciu o strukturę drugorzędową vRNA5 wirusa grypy typu A został wygenerowany model struktury trzeciorzędowej w programie RNAComposer. Model potwierdza dostępność rejonów w strukturze vRNA5 dla wiązania skutecznych antysensowych oligonukleotydów. Struktura trzeciorzędowa jest również w dużej części zgodna z profilem wiązania białka NP do vRNA5 w wirionie. Zdeterminowane motywy strukturalne mogą pełnić istotną rolę w cyklu namnażania wirusa w takich procesach, jak: pakowanie RNA do wirionów potomnych, replikacja, oddziaływania z białkami wirusowymi lub komórkowymi czy transport komórkowy.
10
ABSTRACT
Every year influenza A virus causes 500 000 deaths worldwide. Influenza is important research subject for scientists around the world because of its threat to humanity.
The main goal of conducted research presented in this PhD dissertation was determination of secondary structure of influenza A virus segment 5 vRNA (vRNA5). The object of the research was vRNA5 of strain A/Vietnam/1203/2004 (H5N1), which length is 1565nt. Presented secondary structure of vRNA5 was predicted with constraints from chemical mapping. Chemical mapping experiments were conducted with DMS, CMCT, kethoxal and NMIA. RNAstructure was used for secondary structure prediction using experimental data. Influenza A virus vRNA5 secondary structure was presented here for the first time. Secondary structure of vRNA5 has three domains: domain I (regions 1-69 nt and 1285-1565 nt), domain II (70-797 nt) and domain III (798-1284 nt). In the domain III there is highly structured region 1065-1281 nt with a stable hairpin 1074-1115 nt. Also, probability of forming base pairs in presented vRNA5 secondary structure was predicted.
Isoenergetic microarrays were used for determination of accessibility for oligonucleotides binding. Hybridization experiments were performed in two different buffers (containing either sodium or potassium) in 37C. RNase H hydrolysis allowed to confirm isoenergetic microarray probes binding sites. The confirmed binding sites are 469, 646, 683, 883, 1073, 1251 and 1330. Obtained results also allow to confirm binding sites of antisense oligonucleotides to influenza virus vRNA5.
Bioinformatic analysis of proposed influenza A virus vRNA5 secondary structure was also performed toward how structural conserved are predicted base pairs, and how universal is the structure across type A. 18500 strains of type A were used for this analysis. The base pair conservation for the proposed model is 87,1% in average. This confirms that vRNA5 structure is highly conserved and various motifs presented in this structure may also occur in the other strains of influenza A virus.
On the basis of influenza A virus vRNA5 secondary structure, 16 antisense oligonucleotides were designed. Results from isoenergetic microarrays experiments were also used for decision of designed oligonucleotide target regions. Antisense oligonucleotides contained LNA and 2'-O-MeRNA modifications. There were also gapmers within antisense oligonucleotides, that were used to activate cellular RNase H.
Antisense oligonucleotides were tested for inhibition of influenza virus A replication. Modified MDCK-HA cell line with sciIAV A/California/07/2009 (H1N1) virus and MDCK
11 cell line with A/California/07/2009 (H1N1) virus were used for experiments. In research both, level of virus RNA and virus titer were monitored. On the basis of these experiments antisense oligonucleotides that the most inhibit influenza A virus replication were selected. The best inhibitory oligonucleotide 7.5L caused 88% inhibition of strain A/California/07/2009 (H1N1) replication. This oligonucleotide binding site is located within large loop (878-888nt), which availability was confirmed by the isoenergetic microarray probes hybridization. High inhibition of A/California/04/2009 (H1N1) replication was also measured for oligonucleotide 4.5 (inhibition of 64%), 11.5L, 11.5 (around 48%) and gapmers 19GP and 23GP (more than 36%).
MTT assay was performed to test potential cytotoxicity of antisense oligonucleotides. It was showed that for the concentrations used in experiments the tested oligonucleotides showed no (or low) cytotoxicity.
Tertiary structure model was generated using RNAComposer software on the basis of influenza A virus vRNA5 secondary structure. This model confirmed accessibility of effective antisense oligonucleotides binding regions within the structure of vRNA5. Tertiary structure is mostly in agreement with NP-vRNA5 binging profile in virion. Determined structural motifs might have important role in the virus replication cycle in such processes as RNA packaging to progeny virions, replication, interaction with viral or cellular proteins and vRNA transport in cell.
12
WYKAZ STOSOWANYCH SKRÓTÓW
APS - nadsiarczan amonuASO - (ang. antisense oligonucleotide) oligonukleotyd antysensowy
ATP - adenzyno-5’-trifosforan
AUG - kodon start
BB - (ang. bromophenol blue) błękit bromofenolowy
CCS - (ang. cell culture supernatant) pobrane medium z hodowli komórkowej
CMCT - N-Cyclohexyl-N′-(2-morpholinoethyl)carbodiimide metho-p-
toluenesulfonate
CHAPS - hydrat 3-[(3-cholamidopropylo)dimetyloamoniolo]-1-propanosulfonianu
COPI - (ang. coat protein complex I) kompleks białek okrywających I
cpm - (ang. counts per minute) ilość zliczeń na minutę
cRNA - (ang. complementary RNA) komplementarny RNA
DMS - (ang. dimethyl sulfate) siarczan dimetylu
dNTP - trifosforan deoksynukleozydu
DTT - ditiotreitol
EDTA - kwas etylenodiaminotetraoctowy
FFU - (ang. fluorescent focus unit) jednostka wyrażająca miano wirusa w
metodzie immunofluorescencji
g - przyspieszenie grawitacyjne
GFP - (ang. green fluorescent protein) białko zielonej fluorescencji
HA - hemaglutynina
HEPES - kwas 2-[4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynylo]etanosulfonowy
HPAI - (ang. highly pathogenic avian influenza) wysoce zjadliwy wirus grypy
ptasiej
IFA - (ang. indirect immunofluorescence assay) metoda immunofluorescencji
pośredniej
IFN - interferon
IAV - (ang. influenza A virus) wirus grypy typu A
IBV - (ang. influenza B virus) wirus grypy typu B
ICV - (ang. influenza C virus) wirus grypy typu C
IDV - (ang. influenza D virus) wirus grypy typu D
IPTG - izopropylo-beta-d-1-tiogalaktopiranozyd
ISAV - (ang. infectious salmon anemia virus) wirus zakaźnej anemii łososi
LB - (z ang. lysogeny broth) bulion lizogenny
LNA - (ang. locked nucleic acid) modyfikowane kwasy nukleinowe o
usztywnionej konformacji
LPAI - (ang low pathogenicity avian influenza) wirus grypy ptasiej o niskiej
zjadliwości
mRNA - (ang. messenger RNA) informacyjny RNA
N - dowolny nukleotyd
NA - neuraminidaza
13
NES - (ang. nuclear export signal) sygnał eksportu jądrowego
NLS - (ang. nuclear localization signal) sygnał lokalizacji jądrowej
NMIA - (ang. N-methylisatoic anhydride) bezwodnik kwasu metyloizatoinowego
NP - nukleoproteina
nt - nukleotydy
MDCK - (ang. Madin-Darby Canine Kidney Epithelial Cells) komórki nabłonka
nerki psa
MDCK-HA - linia komórkowa MDCK wykazująca konstytutywną ekspresję
hemaglutyniny
MTT - bromek 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium
NAST -Nucleic Acid Simulation Tool, program
PAA - poliakrylamid
PAGE - (ang. poliacrylamide gel electrophoresis) elektroforeza w żelu
poliakrylamidowym
PBS - (ang. phosphate buffered saline) bufor fosforanowo-potasowy
PCR - (ang. polymerase chain reaction) łańcuchowa reakcja polimerazy
PDB - Protein Data Bank baza danych
PMO - (ang. phosphorodiamidate morpholino oligomer) oligonukleotyd
zawierający ugrupowania fosforoamido-morfolinowe
PS - (ang. phosphorothioate) wiązania tiofosforanowe
qPCR - (ang. quantitative PCR) reakcja łańcuchowej polimerazy w czasie
rzeczywistym
vRNA - (ang. virial RNA) wirusowy RNA
RNP - (ang. ribonucleoprotein complex) kompleks rybonukleoproteinowy
rpm - (ang. revolutions per minute) obroty na minutę
RT - (ang. reverse transcription) reakcja odwrotnej transkrypcji
sciIAV - (ang. single cycle infection Influenza A Virus) jednocykliczny wirus
grypy typu A
SHAPE
- (ang. selective 2’ hydroxyl acylation analyzed by primer extension) selektywna acylacja grupy 2’-hydroksylowej analizowana w reakcji wydłużania starterów
SDS - dodecylosiarczan sodu
TBE - bufor, Tris/kwas borowy/EDTA
TEMED - N,N,N’,N’-tetrametyloetyloetylenodiamina
TLC - (ang thin- layer chromatography) chromatografia cienkowarstwowa
Tris - tris(hydroksymetylo)aminometan
TPCK - (ang. N-tosyl phenylalanyl chloromethyl ketone)
UTR - (ang. untranslated region) rejon niepodlegający translacji
UV - promieniowanie ultrafioletowe
WT - (ang. wild type) typ dziki
14
II. WSTĘP TEORETYCZNY
1. Wprowadzenie
Wirusy, których materiał genetyczny stanowi RNA są nazywane wirusami RNA. Posiadanie RNA, jako materiału genetycznego wiąże się z większą częstością mutacji. Związane jest to z cechą polimeraz RNA wirusowych, które nie posiadają aktywności korekcyjnej.
Wirusy RNA mogą posiadać materiał genetyczny w postaci jednoniciowej (ang. single
stranded RNA viruses, ssRNA viruses), jak i dwuniciowej (ang. double stranded RNA viruses, dsRNA viruses). Wirusy posiadające genom w postaci jednoniciowego RNA dzielą się na
wirusy RNA(+) oraz wirusy RNA(-). Wirusy RNA(+), to takie wirusy, których RNA może bezpośrednio służyć do biosyntezy białek. Do wirusów RNA(+) można zaliczyć np. pikornawirusy, które stanowią dużą grupę wirusów, potrafiących atakować wiele narządów. Do pikornawirusów należą między innymi rinowirusy, wywołujące powszechnie występujące przeziębienie.
W przypadku wirusów RNA(-), materiał genetyczny wirusa musi najpierw zostać przepisany na komplementarny do niego mRNA, który następnie służy, jako matryca w procesie translacji.
Dodatkowo, genomowe RNA wirusów może być segmentowane, tzn. cały genom podzielony jest na mniejsze segmenty RNA, z których każdy koduje jedno lub więcej białek wirusowych. Pośród wirusów o genomie segmentowanym RNA(-) możemy wyróżnić rodzinę
Orthomyxoviridae. Do rodziny Orthomyxoviridae zaliczamy wirusy grypy (Influenza virus),
a także wirusy z rodzaju Thogotovirus, Quaranjavirus oraz Isavirus. Istnieją cztery typy wirusa grypy: A, B, C oraz D. Obiektem badań opisanych w niniejszej rozprawie doktorskiej jest wirus grypy typu A. Podtypy wirusa typu A różnią się białkami powierzchniowymi wirionu, hemaglutyniną (HA) i neuraminidazą (NA), stąd w nazwach podtypu litera H oraz N.
2. Wirus grypy typu A
Pojawienie się nowych szczepów wirusa grypy typu A, skutkuje corocznym występowaniem epidemii, która w przypadku niekontrolowanego rozprzestrzeniania się, może przekształcić się w pandemię. Najbardziej znaną pandemią, wywołaną wirusem grypy typu A H1N1, była tzw. grypa hiszpanka, która w 1918 roku spowodowała śmierć około 50-100 milionów ludzi [1]. Innymi przykładem jest pandemia w roku 1957, spowodowana przez wirus o podtypie H2N2 oraz w roku 1968, wywołana przez wirus o podtypie H3N2.
15 Ostatnia opisana pandemia była w 2009 i spowodowała śmierć około 18000 ludzi. Wywołał ją wirus o podtypie H1N1 [2].
Wirus grypy może infekować zarówno ludzi, jak i ptaki, świnie oraz małe ssaki takie jak: myszy, fretki oraz nietoperze. Za wysoką zmienność i zarazem infekcyjność wirusa grypy odpowiadają mechanizmy skoku antygenowego (ang. antigenic shift) oraz przesunięcia antygenowego (ang. antigenic drift) [3].
Skok antygenowy polega na wytworzeniu nowego podtypu, posiadającego na swojej powierzchni antygeny pochodzące od różnych szczepów. Skok antygenowy jest związany z podzieleniem genomu wirusa na segmenty. Kiedy jeden organizm zostanie zakażony dwoma różnymi podtypami wirusa, może dojść do reasortacji segmentów. W wyniku wymiany segmentów miedzy wirusami, może powstać wirus o nowych cechach antygenowych. Organizm, w którym może dojść do takiego zjawiska, nazywany jest naczyniem mieszającym. Naczyniem mieszającym może być, na przykład, świnia, która może być zainfekowana zarówno wirusem ludzkim, jak i grypą ptasią. Skok antygenowy jest bardzo niebezpiecznym zjawiskiem, które może odpowiadać za wywołanie pandemii. Wirus H1N1, który spowodował pandemię w latach 2009-2010, powstał w wyniku reasortacji segmentów pomiędzy trzema różnymi podtypami wirusa tzw. grypy świńskiej, ludzkiej oraz ptasiej [4].
Przesuniecie antygenowe polega na kumulowaniu się pojedynczych mutacji w genach kodujących białka powierzchniowe wirusa, neuraminidazy (NA) i hemaglutyniny (HA), w wyniku czego zmieniają się właściwości antygenów powierzchniowych. Nagromadzenie mutacji może prowadzić do sytuacji, w której przeciwciała gospodarza nie będą rozpoznawać antygenów powierzchniowych wirusa, mimo, że gospodarz miał wcześniej styczność z wirusem w wyniku infekcji. Przesunięcie antygenowe powoduje, że co roku konieczne jest opracowywanie nowych szczepionek.
Prócz infekcyjnych cząstek wirusowych podczas pączkowania powstają cząstki wirusowe o niekompletnym zestawie segmentów w wirionie. Procent niekompletnych cząstek wirusowych produkowanych w cyklu namnażania zależy miedzy innymi od szczepu wirusa. Przykładowo, dla szczepu A/PuertoRico/8/1934 (A/PR8) wykazano, że prawie połowa cząstek wirusowych nie była zdolna do produkcji przynajmniej jednego wirusowego białka, co prawdopodobnie wynikało z zaburzeń pakowania segmentów do wirionów. Tylko kompletny - posiadający osiem segmentów wirion jest zdolny do samodzielnego przeprowadzenia całego cyklu replikacyjnego i wytworzenia wirionów potomnych [5].
16 W badaniach opisanych w niniejszej pracy doktorskiej wykorzystywano dwa szczepy wirusa grypy, A/Vietnam/1023/2004 (H5N1) oraz A/California/04/2009 (H1N1). W nazwie szczepu zawarte są podstawowe informacje na temat wirusa. W pierwszej kolejności podawany jest typ wirusa (A), a następnie nazwa gatunkowa organizmu, z którego został wyizolowany. W przypadku izolatów pochodzących z organizmu człowieka, ten etap jest pomijany. W dalszej kolejności podaje się miejsce izolacji (Vietnam, California), numer izolacji (1023), rok izolacji (2004, 2009) oraz podtyp (H5N1, H1N1) [6].
Duże zainteresowanie i obawy budzi wirus ptasiej grypy. Infekcje ptasią grypą wśród ludzi zdarzają się stosunkowo rzadko. Jednak ich pojawienie stanowi spory problem, ponieważ istnieje duże ryzyko, że w wyniku reasortacji segmentów wirusa grypy ptasiej i ludzkiej stanie się możliwe przenoszenie choroby pomiędzy ludźmi. Badania wirusa ptasiej grypy mają szczególne znaczenie, gdyż spowodowana przez niego infekcja mogłaby się gwałtownie rozprzestrzeniać wśród populacji ludzkiej. Objawy zakażenia wirusem ptasiej grypy mogą mieć szerokie spektrum od łagodnych do ciężkich, włącznie ze śmiercią pacjenta. Ze względu na przebieg choroby u zakażonego drobiu, wyróżniono dwa typy wirusa ptasiej grypy: HPAI (highly pathogenic avian influenza), wysoce zjadliwy wirus ptasiej grypy oraz LPAI (low pathogenic avian influenza), wirus ptasiej grypy o niskiej zjadliwości. Najczęściej wirusy HPAI są bardzo patogenne także w przypadku zakażenia ludzi. Oprócz człowieka, wirus ptasiej grypy może infekować także psy, koty, świnie, foki, lamparty czy tygrysy [7]. Do wirusów HPAI należą miedzy innymi H5N1, H5N6, H5N2, H5N3, oraz H5N8, z czego dwa pierwsze wymienione podtypy mogą być odpowiedzialne za infekcje u ludzi. Pierwszy przypadek zakażenia człowieka ptasią grypą zarejestrowano w 1997 roku w Hong Kongu. Obecność wirusa H5N1 stwierdzono wówczas u 18 osób, w wyniku czego 6 zmarło [8, 9].
Zakażenia wirusem ptasiej grypy, zarówno ludzi jak i drobiu, dotychczas występowały w ponad 60 krajach na całym świecie. Dla wirusa HPAI H5N1 do tej pory zarejestrowano przeszło 850 przypadków zakażeń od 2003 roku. Z tego powyżej 50% przypadków zakończyło się śmiercią [9, 10]. Średni wiek pacjentów chorujących na grypę wywołaną wirusem H5N1, w okresie od 1 maja 1997 do 30 kwietnia 2015, wyniósł 19 lat. W każdym kolejnym roku odnotowuje się więcej nowych zachorowań spowodowanych wirusem H5N1 [10].
17 Wrion wirusa grypy typu A jest sferyczny i ma około 100 nm średnicy (Rysunek 1). Sporadycznie występują także formy filamentarne, których długość może wynosić nawet 1 µm. Formy filamentarne były obserwowane głównie w klinicznych izolatach, natomiast formy sferyczne u szczepów namnażanych w warunkach laboratoryjnych. Na ostateczny kształt cząstek wirusowych mają wpływ białka wirusowe neuraminidazy (NA), hemaglutyniny (HA), białka M1, M2 oraz nukleoproteina (NP) [11].
Rysunek 1. Model wirionu wirusa grypy typu A.
Na powierzchni wirionu występuje dwuwarstwa lipidowa, w której umieszczone są białka hemaglutynina i neuraminidaza, przy czym, tych pierwszych jest cztery razy więcej. Zidentyfikowano 18 typów białka hemaglutyniny oraz 11 rodzajów neuraminidazy. Obecność w osłonce wirusa danego rodzaju białek HA i NA determinuje podtyp wirusa grypy typu A. Łączna możliwa liczba kombinacji podtypów wynosi 198 [12]. W osłonce zakotwiczone jest również białko M2, obecne w ilości około 20 cząsteczek na wirion. Stanowi ono kanał jonowy. W osłonce wirusowej występują również białka komórek gospodarza, w których nastąpiła replikacja wirusa, takie jak, na przykład, białka cytoszkieletu, aneksyny czy enzymy glikolityczne. Rola tych białek w cyklu replikacyjnym wirusa nie została jeszcze poznana [13].
Pod powierzchnią osłonki lipidowej znajduje się warstwa białek macierzy (białko M1). Osłania ona rdzeń wirusa, czyli 8 segmentów wirusowego RNA (vRNA)
18 związanych z białkiem NP i polimerazą wirusową tworząc osiem kompleksów rybonukleoproteinowych (ang. ribonucleoprotein complex, RNP).
Genom wirusa grypy składa się z ośmiu segmentów vRNA. Segmenty wirusowe zostały nazwane numerami nadanymi zgodnie z wielkością segmentu od najdłuższego do najkrótszego vRNA. Kwasy nukleinowe we wnętrzu kapsydu występują w postaci kompleksów rybonukleoproteinowych (vRNP). Oprócz białka NP w kompleksie rybonukleoproteinowym występują także białka polimerazy: białko PB1, PB2, PA [6, 14, 15]. Wirusowe kompleksy rybonukleoproteinowe różnią się rozmiarami cząsteczek. Najkrótszy kompleks ma około 30 nm, najdłuższy około 120 nm. Średnica wszystkich vRNP jest taka sama i wynosi 12 nm [5].
vRNP są rozmieszczone w wirionie, według schematu „7+1”, co oznacza, że wokół centralnie położonego segmentu, umieszczonych jest siedem pozostałych vRNP. Charakterystyczne rozmieszczenie vRNP w wirionie oraz ich wspólny transport w zainfekowanej komórce, świadczy, że pomiędzy poszczególnymi vRNA może dochodzić do oddziaływań [5, 14].
Na podstawie wyników uzyskanych z transmisyjnej mikroskopii elektronowej potwierdzono, że w jednym wirionie najczęściej umieszczonych jest osiem segmentów. Wiriony niekompletne, posiadające mniej niż osiem segmentów, występują w mniejszości. Precyzyjne umieszczenie vRNP w segmentach sugeruje, że mechanizm pakowania nie jest przypadkowy, a cząsteczka vRNP musi nieść informację, która pozawala na odróżnienie od siebie poszczególnych vRNP. Taką informacją mogłaby być, na przykład, struktura vRNA tworzącego vRNP [16, 17].
Rysunek 2. Budowa kompleksu rybonukleoproteinowego. Po lewej stronie schematyczne przedstawienie
budowy vRNP. Niebieskim kolorem zaznaczono vRNA, szarym rdzeń utworzony z białka NP. Pewne fragmenty vRNA w wirionie są niezwiązane z NP. Białka PA, PB1, PB2 stanowią podjednostki wirusowej polimerazy RNA zależnej od RNA. Po prawej zdjęcie vRNP wykonane techniką mikroskopii krioelektronowej. Zauważyć można, że cząsteczkę vRNP cechuje pewna elastyczność [18, 19].
19 Cząsteczka vRNP ma strukturę przypominającą spinkę do włosów, w której trzon stanowi prawoskrętna anty-równoległa podwójna helisa zakończona pętlą [19-21]. RNA jest nawinięte na rdzeń utworzony z białka NP, w nierównomierny sposób (Rysunek 2). vRNP nie jest sztywną strukturą, ale ma możliwość zginania się i dopasowywania do kolistego kształtu wirionu. Jest to możliwe dzięki tworzeniu przez białko NP charakterystycznych pierścieni, które powstają z 7, 6, lub 5 cząsteczek nukleoproteiny. Za sprawą przerw, które występują między pierścieniami, dochodzi do relaksacji struktury vRNP. Takie nierównomierne rozmieszczenie NP w vRNP może przyczynić się do tego, że są obserwowane różne wartości skoku helisy vRNP [19-21].
Profil wiązania NP jest częściowo podobny u szczepów tego samego podtypu, co świadczy o tym, że może mieć charakter uniwersalny. Niezwiązane z białkiem vRNA może brać udział w oddziaływaniach między segmentami czy też w obrębie segmentu, tworząc funkcjonalne motywy strukturalne. Zarówno rejony vRNA niezwiązane z nukleoproteiną RNA, jak i te wiążące białko mogą pełnić istotną biologiczną funkcję. Niektóre segmenty, na przykład vRNA3 wiążą znacznie mniej białka NP niż inne segmenty (np. vRNA1) co może świadczyć o tym, że w vRNA istnieją różnej długości rejony pozbawione NP [18].
W niektórych segmentach (np. w vRNA5) na 3’oraz 5’ końcach oraz w rejonie UTR może być również wiązane białko NP. Segmenty mogą różnić się miedzy sobą funkcją, jaką pełnią podczas pakowania wirionów. Segmenty, które posiadają nieopłaszczony nukleoproteiną 3’ i 5’ UTR, mogą wzajemne oddziaływać i/lub tworzyć motywy strukturalne regulujące proces pakowania. W celu zweryfikowania znaczenia różnic w dostępności 3’ i 5’ końców segmentów dla białka NP potrzebne są dalsze badania [14, 18, 20, 21].
Oddziaływania RNA-RNA, białko-białko oraz RNA-białko regulują procesy zachodzące podczas infekcji. W tych oddziaływaniach kluczową rolę pełni struktura komponentów vRNP. Poznanie struktury vRNA, oraz dokładnej organizacji w vRNP jest istotne by zrozumieć lepiej funkcję vRNP w cyklu namnażania wirusa grypy.
Cykl replikacyjny wirusa grypy jest złożonym procesem, w którym biorą udział zarówno białka wirusowe, jak i białka gospodarza - stanowi on sieć wzajemnych interakcji. W czasie infekcji dochodzi do aktywowania 128 genów ludzkich, które są powiązane z takimi procesami jak: inicjacja translacji, endocytoza i transport jądrowy [22]. Dla prawidłowego
20 przebiegu cyklu namnażania ma znaczenie także struktura RNA, co zostało przybliżone w podrozdziale „Znaczenie badań struktury RNA wirusa grypy”.
W cyklu replikacyjnym wirusa powstaje więcej niż 13 białek wirusowych (Tabela 1). Osiem z nich to białka strukturalne, tworzące wirion. Oprócz tego występują jeszcze białka regulatorowe, które są obecne tylko podczas trwania cyklu namnażania wirusa i nie są białkami występującymi w kapsydzie [23].
Tabela 1. Białka kodowane przez poszczególne segmenty vRNA wirusa grypy typu A [23-30]. Segment Nazwa białka Uwagi
1 PB2
Tworzy kompleks rybonukleoproteinowy. Jest podjednostką polimerazy wirusowej. Odpowiada za hamowanie odpowiedzi immunologicznej gospodarza poprzez wpływ na IFN typu I.
2
PB1 Tworzy kompleks rybonukleoproteinowy. Jest podjednostką polimerazy wirusowej, odpowiada za syntezę RNA.
PB1-F2 Regulacja odpowiedzi immunologicznej gospodarza, powstaje na drodze zmiany ramki odczytu w mRNA segmentu 2.
PB1-N40 Oddziałuje z kompleksem polimerazy, peptyd istotny w procesie replikacji. Powstaje na drodze zmiany ramki odczytu w mRNA PB1.
3
PA
Tworzy kompleks rybonukleoproteinowy. PA wchodzi w skład polimerazy wirusowej. Odpowiedzialne za hydrolizę mRNA gospodarza.
PA-X Hamowanie syntezy białek gospodarza, inhibicja IFN β.
PA-N155 Wspomaga replikację, dokładna rola nie jest znana. Skrócone z N-końca białko PA.
PA-N182 Funkcja nieznana. Skrócone z N-końca białko PA.
4 HA Glikoproteina. Białko powierzchniowe cząstki wirusa. Odpowiada za adhezję i wnikanie wirusa.
5 NP
Tworzy kompleks rybonukleoproteinowy (RNP), łączy vRNP z białkiem M1. Bierze udział w procesie replikacji, posiada sygnał lokalizacji jądrowej (NLS) oraz sygnał eksportu jądrowego (NES).
6 NA
Glikoproteina. Białko powierzchniowe cząstki wirusa. Katalizuje reakcje rozpadu wiązania α-glikozydowego w cząsteczce kwasu sialowego. Odpowiedzialne za uwalnianie wirusów potomnych z komórki gospodarza.
7
M1
Białko macierzy, tworzy wewnętrzną białkową otoczkę wirusa. Regulator transkrypcji. Odpowiada za eksport jądrowy oraz pakowanie vRNP do wirionów.
M2
Białko transbłonowe, tworzy kanał jonowy. Odpowiada za utrzymanie odpowiedniego pH wewnątrz wirionu oraz pęcherzyków
transportujących. Powstaje na drodze alternatywnego splicingu mRNA M1.
M42 Białko pełniące funkcję kanału jonowego.
8
NS1
Wzmaga replikację wirusa. Powoduje inhibicję syntezy IFN typu I, bierze udział w splicingu wirusowego RNA. Odpowiada za hamowanie poliadenylacji oraz eksportu jądrowego mRNA gospodarza.
NEP (NS2)
Odpowiada za eksport vRNP. Posiada sygnał eksportu jądrowego (NES), posiada sygnał lokalizacji jądrowej (NLS). Powstaje na drodze alternatywnego splicingu z mRNA segmentu 8
21 Unoszące się w powietrzu cząstki wirusa grypy mogą dostać się do górnych dróg oddechowych. Wirusy mogą być obecne w powietrzu np. w wyniku kaszlu zainfekowanych osób, czy też trzepotania skrzydeł zakażonego drobiu. Do zakażenia może dojść także w wyniku kontaktu bezpośredniego, który obejmuje dotykanie zakażonych powierzchni, a następnie przenoszenie zanieczyszczeń w okolice twarzy. W przewodzie oddechowym człowieka panuje temperatura optymalna dla namnażania się wirusa grypy, wynosząca 33˚C. W wyniku postępującej infekcji może dojść do rozprzestrzenienia się zakażenia w dolnych drogach oddechowych. Temperatura powietrza obecnego w oskrzelach i płucach wynosi 37˚C i jest również korzystną temperaturą dla wielu szczepów wirusa grypy. Zanim dojdzie do zakażenia, wirus musi pokonać grubą (nawet do 50 µm) warstwę śluzu, pokrywającą tkanki układu oddechowego. Śluz jest bogaty w oligosacharydy - między innymi zawiera kwas sjalowy. Białko NA uwalnia wiriony ze śluzu, dzięki swojej aktywności hydrolitycznej. Wiriony mogą przedostać się przez warstwę śluzu a następnie wiązać się do receptorów nabłonka oddechowego [31].
Białko HA bierze udział w procesie adhezji, rozpoznając wiązania α-2,3 glikozydowe (wirus grypy ptasiej) lub α-2,6 glikozydowe (wirus grypy ludzkiej) występujące w kwasie sjalowym. Kwas sjalowy jest obecny na powierzchni komórek. Wirus świńskiej grypy może rozpoznawać zarówno wiązania glikozydowe typu α-2,6, jak i α-2,3 [23, 32].
Wiązanie HA inicjuje proces endocytozy. Następnie, w wyniku aktywowania białka M2 przez obecność niskiego pH w endosomie, dochodzi do fuzji osłonki wirusa z błoną pęcherzyka endocytarnego. Osłabieniu ulegają oddziaływania miedzy białkami i w efekcie vRNP zostają odłączone od białka M1. W wyniku fuzji pęcherzyka z osłonką, vRNP zostają uwolnione do cytoplazmy i zostają przetransportowane do jądra komórkowego, gdzie rozpoczyna się replikacja materiału genetycznego (Rysunek 3) [23]. Białka wchodzące w skład kompleksu rybonukleoproteinowego, takie jak: PB1, PB2, PA tworzą razem wirusową polimerazę RNA zależną od RNA [23]. Wirusowy RNA stanowi matrycą do syntezy mRNA (ang. messenger RNA) oraz cRNA (ang. complementary RNA). Cząsteczka cRNA natomiast jest matrycą, na której jest syntezowany potomny vRNA. Replikacja wirusowego RNA nie wymaga obecności startera, ale w procesie tym niezbędna jest obecność białka NP. Powstające w wyniku replikacji vRNA mogą służyć, jako matryca dla kolejnych mRNA lub mogą być transportowane do cytoplazmy w celu tworzenia nowych cząstek wirusowych. Do syntezy białek wirusowych w procesie translacji służy nie w pełni komplementarne do vRNA - mRNA. Cząsteczki mRNA dzięki traktom 5-7 reszt urydynowych w vRNA posiadają tzw. ogon poli(A). Natomiast czapeczkę guanozynową
22 (kap) wirusowe mRNA uzyskuje w procesie tzw. cap-snatching z pre-mRNA gospodarza. N-końcowa domena białka PA ma aktywność endonukleazy, co umożliwia hydrolizę mRNA gospodarza. Białko PB2 natomiast przechwytuje kap z 5’ końca pre-mRNA, w wyniku czego powstają 10-15 nukleotydowe startery potrzebne do rozpoczęcia syntezy wirusowego mRNA. Pre-mRNA, wykorzystane do przechwytywania kapu, wybierane są losowo. Za syntezę wirusowego mRNA odpowiada podjednostka polimerazy PB1. Cząsteczki Wirusowe mRNA posiada podobnie, jak mRNA gospodarza, ogon poli(A) na 3’ końcu oraz kap na końcu 5’. Powoduje to, że wirusowy mRNA oraz pre-mRNA gospodarza nie są rozróżniane przez komórkę [6, 24, 33].
Rysunek 3. Ogólny schemat cyklu namnażania wirusa grypy typu A [34].
Następnie mRNA jest transportowany z jądra do cytoplazmy i rozpoczyna się synteza białek. Wszystkie białka powstające z wirusowego RNA zostały przedstawione w tabeli 1. Każdy segment koduje przynajmniej jedno białko. Z mRNA segmentów pierwszego, czwartego, piątego i szóstego powstaje po jednym białku wirusowym. Pozostałe segmenty kodują więcej białek.
Początkowo uważano, że vRNA2 koduje tylko białko PB1. Jednak okazuje się, że możliwa jest synteza białka z alternatywnych miejsc inicjacji translacji w wyniku, czego powstają białka PB1-F2 oraz PB1-N40 26. Bezpośrednio z mRNA segmentu trzeciego
23 powstaje białko PA. W wyniku przesunięcia ramki odczytu możliwa jest synteza białka PA-X. W mRNA segmentu trzeciego są obecne także dodatkowe kodony AUG, z których odbywa się synteza białek PA-N155 i PA-N182 31. Dodatkowe białka z segmentów siódmego oraz ósmego powstają na drodze alternatywnego splicingu. W procesie alternatywnego składania wirusowego mRNA udział biorą białka komórki gospodarza. Z segmentu siódmego powstają trzy białka: M1, M2 oraz M42. Natomiast, z segmentu ósmego powstają białka NS1, NS2 oraz NS3 [34].
Postuluje się, że etap splicingu może być kluczowy dla regulacji całej infekcji. U różnych szczepów zaobserwowano różne wydajności splicingu. W przypadku szczepu A/Brevig Mission/1918/1 (H1N1) mało wydajny splicing prowadzi do nagromadzenia białka NS1, co ma wpływ na infekcyjność wirusa. Uważa się, że zaburzenia splicingu mogły być przyczyną wysokiej śmiertelności powodowanej przez grypę hiszpankę [35].
Poszczególne szczepy mogą różnić się profilem syntezy białek. Nie zawsze pełen zestaw białek jest obecny u wszystkich szczepów. Przykładowo, NS3 zaobserwowano u szczepów, które przystosowały się do namnażania u myszy, natomiast nie wykryto jak dotąd tego białka w wirusie namnażającym się u człowieka. Obecność białka była związana z pojawieniem się mutacji i w efekcie nowego miejsca splicingowego [30].
Kolejnym etapem regulacji cyklu namnażania wirusa grypy są procesy modyfikacji białek. W początkowej fazie cyklu, białko M1 jest ubikwitynowane przy lizynie 242. W tej samej pozycji, w fazie późnej, białko M1 podlega sumoilacji, co powoduje, że zwiększa się jego stabilność i dochodzi do jego akumulacji. Większa ilość białka M1 powoduje, że wzmagany jest proces eksportu jądrowego vRNP.
Synteza białek HA, M2 i NA zachodzi w retikulum endoplazmatycznym szorstkim. Hemaglutynina jest syntetyzowana w postaci prekursora H0. W wyniku działania enzymów proteolitycznych, obecnych w komórkach zainfekowanego gospodarza, dochodzi do hydrolizy wiązania peptydowego i powstania dwóch podjednostek hemaglutyniny: HA1 oraz HA2 [23]. Przedwczesnemu dojrzewaniu hemaglutyniny przeciwdziała białko M2, które kontroluje pH w pęcherzyku endosomalnym. Zarówno białko hemaglutyniny oraz neuraminidazy podlegają glikozylacji [11, 23].
Białka HA, M2, NA do apikalnej części błony komórkowej są transportowane za pomocą kompleksu białek opłaszczających - COPI. Mechanizm transportu białek HA, NA, M2 jest inny niż w przypadku transportu kompleksu RNP. Z jądra do cytoplazmy transportowany jest zarówno vRNA, jak i cRNA [28].
24 Białko M1 nie posiada sygnału, który pozwoliłby na kierowanie tego białka do błony komórkowej w części apikalnej komórki, dlatego prawdopodobnie jest transportowane razem z vRNP przez pory jądrowe do cytoplazmy. Proces transportu odbywa się przy udziale eksportyn i wymaga energii z ATP. Eksportyny znajdują sygnał eksportu jądrowego NES obecny w białku NEP, które oddziałuje z białkiem M1. vRNP są transportowane w postaci kompleksów tworzących się z trzech do czterech segmentów. Nie zaobserwowano natomiast transportu pojedynczych segmentów oraz wszystkich ośmiu segmentów jednocześnie [36].
W procesie eksportu jądrowego bierze udział białko NP, które również posiada NES. W eksporcie vRNP mogą uczestniczyć także białka gospodarza jak, na przykład oddziałujące z NP białko NXT1 czy białko szoku Hsc70, które oddziałuje z białkiem M1 [27]. vRNP transportowane są w kierunku wewnętrznej powierzchni błony komórkowej. Proces zachodzi między innymi przy udziale mikrotubuli oraz pęcherzyków endocytarnych. W procesie transportu kompleksu vRNP biorą udział inne białka komórkowe takie, jak STAU1, HRB czy Rab11. vRNP gromadzą się po wewnętrznej stronie błony komórkowej, przy czym znaczenie ma odłączanie się od vRNP białka Rab11. Białko Rab11 bierze także udział w transporcie białka M2 do części apikalnej komórki.
Proces pakowania segmentów do wirionów nie jest dokładnie znany. Wiadomo, że najprawdopodobniej nie jest procesem losowym oraz jest zależny od sygnałów pakowania obecnych w sekwencji vRNA na końcach 5’ oraz 3’. Mutacje w sygnale pakowania jednego segmentu powodują upośledzenie pakowania pozostałych segmentów, gdyż w pakowaniu istotne może być występujące oddziaływanie pomiędzy segmentami. Umiejscowienie sygnału pakowania na końcach 5’ i 3’ może mieć związek z pakowaniem do wirionów tylko segmentów o pełnej długości. Możliwe jest pakowanie mniejszej liczby segmentów niż ośmiu do wirionów, przy czym takie wiriony nie są zdolne do dalszej replikacji. Natomiast nie zaobserwowano większej liczby segmentów niż osiem w wirionie (nawet w dużych formach filamentarnych). W procesie pakowania vRNP duże znaczenie mogą mieć interakcje RNA-RNA. Niektóre rejony w vRNA niezwiązane z białkiem NP mogą tworzyć motywy strukturalne RNA. Takie dostępne rejony RNA mogłyby ze sobą oddziaływać i tworzyć kompleksy, które będą wspólnie pakowane do wirionu. Proces pakowania wirusa grypy jest w dalszym ciągu badany [14, 16, 18].
W wyniku nagromadzenia białek w części apikalnej dochodzi do powstania strefy pączkowania i wypuklenia błony komórkowej. Białko M2 ma znaczenie przy formowaniu kształtu pęcherzyka i odrywaniu go od błony komórkowej [37]. Białko NA odpowiada za usuwanie reszty kwasu sjalowego z oligosacharydów białek osłonki, dzięki czemu możliwe
25 jest uwolnienie wirusów, a cząstki wirusowe nie agregują [31]. Wirusowe mRNA nie są pakowane, gdyż posiadają kap oraz ogon poli(A) i są traktowane jak pre-mRNA komórki. Białko M1 może wiązać się z vRNP, natomiast nie oddziałuje z cRNP. Powoduje to, że transport vRNP oraz cRNP w cytozolu się różni. Oddziaływanie z M1, miedzy innymi, odpowiada za pakowane vRNP do wirionów. Natomiast cRNP nie wiąże M1, wiec nie podlega pakowaniu. Nowe wiriony opuszczają komórkę i cykl namnażania wirusa grypy typu A rozpoczyna się od początku [28].
3. Wirusy grypy pozostałych typów
Wirus grypy typu A jest najlepiej zbadanym wirusem w rodzinie Orthomyxoviridae. Oprócz niego do tej grupy wirusów zaliczamy wirusy grypy typu B, C oraz D.
Wirus grypy typu B (ang. influenza B virus, IBV) został odkryty w 1940 roku. Epidemie powodowane przez IBV występują, co 2-4 lata. Choroba spowodowana infekcją tym wirusem może skutkować wysoką śmiertelnością. Za 29% wszystkich przypadków śmiertelnych, spowodowanych przez wirusy grypy w USA w latach 1997-2009, odpowiadały wirusy grypy typu B [38]. Najbardziej podatne na infekcję wirusem są dzieci i młodzież w wieku 5-19 lat [39]. Objawy są bardzo podobne do zakażenia spowodowanego IAV. W przypadku wirusa grypy typu B częściej dochodzi do powstania powikłań ze strony układu nerwowego i układu mięśniowo- szkieletowego. U dorosłych zmarłych w wyniku IBV częściej wdawały się też infekcje bakteryjne powodujące zapalenie płuc [40, 41].
IBV posiada, podobnie jak IAV, 8 segmentów vRNA, natomiast białka wytwarzane przez wirus grypy B różnią się sekwencją i długością od białek wirusa grypy typu A. Segmenty 1-3 kodują PB1, PB2, PA-białka polimerazy wirusowej. Funkcje białek są podobne u obu wirusów. Segment 4 koduje hemaglutyninę, która uczestniczy w wiązaniu wirusa do receptorów nabłonka oddechowego. HA wiąże się do kwasu sialowego z mniejszą wydajnością niż jest to obserwowane w przypadku wirusa grypy typu A. Mimo, że sekwencja białka HA z IBV różni się od sekwencji aminokwasowej białka pochodzącego z IAV, to struktura i funkcje są podobne [42]. Segment 5 koduje białko NP. Nukleoproteina wirusa grypy typu B znacznie różni się od białka NP wirusa grypy typu A. Białko posiada dwie dodatkowe domeny, dzięki którym białko NP IVB może pełnić dodatkowe, nieznane jeszcze funkcje. Białko NP wirusa grypy typu B hamuje namnażanie wirusa grypy typu A, miedzy innymi, poprzez oddziaływanie z białkiem PB2 [43]. Z segmentu 6 powstają białka NB oraz neuraminidaza. Neuraminidaza odpowiada za uwolnienie wirusów z komórki gospodarza, a także bierze udział w hydrolizie kwasu sialowego i wnikaniu wirusa do komórek. Tym
26 samym pełni funkcję identyczną, jak w przypadku wirusa grypy typu A. Białko NB jest białkiem charakterystycznym dla IVB. Funkcja białka NB nie została poznana, jednak obecność tego białka w komórkach zwiększa wydajność replikacji IBV [44]. Segment 7 koduje białka BM1 i BM2. Rola białka BM1 w cyklu replikacyjnym wirusa grypy typu B nie została jeszcze poznana. Białko BM2 może brać udział w pakowaniu vRNP do potomnych wirionów, ma też wpływ na infekcyjność wirusa. [45]. Segment 8 koduje białko NEP i NS1. Białko NS1 pełni istotne funkcje podczas cyklu namnażania wirusa. Zarówno białko NEP, jak i NS1 mają podobne funkcje jak u wirusa IAV. U wirusa grypy typu A dochodzi do oddziaływania białka NEP z vRNP poprzez białko M1. Natomiast, w przypadku IBV dochodzi do bezpośredniego oddziaływania vRNP i NEP [45].
Gospodarzem dla wirusa grypy typu B jest zazwyczaj tylko człowiek, co skutkuje tym, że w przypadku IBV istnieje mniejsze ryzyko pandemii niż dla IAV. Tymczasem IAV z powodzeniem może namnażać się także w organizmach ptaków czy świń, co znacznie ułatwia rozprzestrzenianie infekcji. Chociaż istnieją przypadki infekcji innych zwierząt, na przykład IBV wyizolowano z organizmu foki. RNA wirusa grypy typu B był obecny też w górnych drogach oddechowych świń, natomiast nie udało się wyizolować cząstek wirusowych. Przeciwciała skierowane przeciwko wirusowi były obecne u świnki morskiej [46].
W przypadku wirusa grypy typu B może także dochodzić do skoku i przesunięcia antygenowego [39, 43]. Inhibitory neuraminidazy są znacznie mniej skuteczne w przypadku wirusa grypy typu B niż w przypadku wirusa grypy typu A. Stosowane w leczeniu IAV rymantadyna i amantadyna nie są skuteczne w przypadku IBV [47].
Wirus grypy C (ang. influenza C virus, ICV), podobnie jak wirus grypy typu B atakuje głównie dzieci oraz młodzież. Wirus jest najczęściej wykrywany w organizmach osób poniżej 5 roku życia. Większość dorosłych ludzi posiada przeciwciała skierowane przeciwko wirusowi grypy typu C, co oznacza, że infekcja powodowana przez tego wirusa nie jest rzadkością. Zazwyczaj powoduje powstanie łagodnych objawów ze strony układu oddechowego oraz gorączkę. Może powodować zapalenie spojówek lub przebiegać bezobjawowo. Atakuje zarówno górne, jak i dolne drogi oddechowe. Wirus grypy typu C najlepiej namnaża się w temperaturze 33˚C, jednak może namnażać się z mniejszą wydajnością także w 37˚C. Materiał genetyczny wirusa grypy typu C stanowi siedem segmentów wirusowego RNA.[48, 49].
27 Niewiele wiadomo na temat białek kodowanych przez ICV. Segmenty 1-3 kodują białka polimerazy. Wirus nie posiada białka neuraminidazy ani hemaglutyniny. Segment 4 koduje białko HEF, które odpowiada za fuzję wirusa z błoną komórkową gospodarza. Segment 5 koduje białko NP. Natomiast, segment 6 koduje białka M1 oraz CM2. To ostatnie bierze udział w pakowaniu segmentów do wirionów potomnych oraz uwalnianiu segmentów z kapsydu w endosomach. Fosforylacja białka CM2 ma wpływ na wydajność namnażania wirusa [49, 50].
Wirus może także atakować świnie oraz psy, jednak jego głównym gospodarzem jest człowiek. Niektóre szczepy wirusa mogą być przenoszone pomiędzy świniami [49, 51]. Wirus podlega procesowi przesunięcia antygenowego. Badania japońskich naukowców potwierdziły, że reasortacja segmentów ICV może prowadzić do powstania nowego szczepu zdolnego do powodowania epidemii [48, 51].
Wirus grypy typu D (ang. influenza D virus, IDV) został odkryty w 2011 roku w USA. Wirus powoduje infekcję bydła, które było wcześniej uważane za odporne na wirusa grypy. Wirus ten początkowo pomylono z ICV, jednak istniejące różnice, między innymi, w sekwencji spowodowały, że konieczne było wyodrębnienie nowego typu. Na temat wirusa grypy typu D wciąż niewiele wiadomo. Występowanie wirusa odnotowano we Francji, Włoszech oraz Chinach [51-53]. Wirus namnaża się w górnych oraz dolnych drogach oddechowych. Najwyższy poziom replikacji wirusa zaobserwowano w temperaturze 37C [49].
Podobnie jak wirus grypy typu C materiał genetyczny wirusa IDV zbudowany jest z siedmiu segmentów RNA. Sekwencje końców 5’ i 3’ tworzące motyw panhandle (opisany niżej, w rozdziale Motywy strukturalne RNA wirusa grypy) są niemal identyczne, jak u ICV oraz IDV. Podobnie jak w przypadku ICV, białka wirusa nie zostały w pełni zbadane. Segmenty 1-3 kodują białka tworzące wirusową polimerazę (białka PB1, PB2, P3). Segment 4 koduje białko HEF, białko esterazy hemaglutyniny, które odpowiada za adhezje wirusa na powierzchni komórek nabłonka oddechowego. Białko HEF ICV oraz IDV posiadają sekwencję aminokwasową identyczną w 55%. Struktura trzeciorzędowa obu białek jest niemal identyczna. Białko HEF, nie wykazuje takiej zmienności jak HA czy NA, stąd uważa się, że zachorowanie na grypę spowodowaną infekcją wirusa grypy typu C lub D, daje długotrwałą odporność [49, 51-53]. Segment 5 koduje nukleoproteinę, a segment 6 koduje białko błonowe M1 oraz transbłonowe białko CM2. Natomiast segment 7 koduje białka NS1 oraz NS2, które są odpowiedzialne za hamowanie odpowiedzi immunologicznej komórki
28 gospodarza oraz eksport potomnych cząsteczek rybonukleoproteinowych z jądra komórkowego [49].
Wirus może powodować infekcję u świń oraz u fretki [51-53]. Świnia może być naczyniem mieszającym dla ICV oraz IDV. Wirus może również infekować ludzi, jednak znacznie rzadziej niż pozostałe typy wirusów grypy. Szacuje się, że około 1,3% światowej populacji ludzkiej posiada przeciwciała skierowane przeciwko hemaglutyninie wirusa grypy typu D. Ryzyko zakażenia znacznie rośnie, wśród ludzi pracujących z bydłem. Wciąż nie wiadomo, czy wirus może być przenoszony z człowieka na człowieka [49].
4. Kierunki terapeutyczne w leczeniu grypy
W poniżej zostaną przedstawione wybrane kierunki związane z projektowaniem nowych leków przeciwko wirusowi grypy. Zaprezentowane zostaną także aktualnie stosowane, skuteczne terapie oraz zagadnienia związane z profilaktyką grypy.
Aktualnie leki zatwierdzone przez FDA do stosowania w terapii zakażeń wirusem grypy to: oseltamiwir, peramiwir oraz zanamiwir. W Polsce stosowany jest oseltamiwir w postaci preparatu Tamiflu. W Japonii dostępny jest nowy związek - laninamiwir. Wszystkie leki są inhibitorami neuraminidazy (Rysunek 4) [54, 55].
Oseltamiwir jest podawany doustnie. W wątrobie ulega przekształceniu do karboksylanu oseltamiwiru, który wykazuje właściwości przeciwwirusowe. Lek jest nacelowany na neuraminidazę i działa na szczepy wirusa grypy typu A i B. Oseltamiwir wykazuje mniejsze podobieństwo strukturalne do kwasu sjalowego i jego analogu – DANA niż zanamiwir. Jest to powodem, że zanamiwir jest uważany za skuteczniejszy lek, mniej podatny na wytworzenie oporności przeciwko niemu. Wykazano, że oseltamiwir podawany w postaci aerozolu daje lepsze efekty terapeutyczne, niż podawany w standardowy sposób [56, 57].
29
Rysunek 4. Wzory strukturalne inhibitorów neuraminidazy. (1) DANA - analog stanu przejściowego kwasu
sjalowego wiązanego przez NA, (2) zanamiwir, (3) laninamiwir, (4) oktanian laninamiwiru i (5) oseltamiwir [56].
Zanamiwir wykazuje skuteczne działanie przeciwwirusowe i jest powszechnie stosowany przeciwko wirusowi grypy typu A oraz B. Nie zaobserwowano, aby inhalowany zanamiwir był toksyczny. Niestety lek przy doustnym podawaniu wykazuje słabą przyswajalność, gdyż wykazuje silną polarność. Jedną z możliwości podania leku jest stosowanie inhalacji, co jest kłopotliwe, szczególnie dla osób z astmą, gdyż zanamiwir występuje w preparacie w postaci proszku. Dodatkowo, obserwowane jest częste zapychanie inhalatora. Lek nie powinien być stosowany przez osoby posiadające alergię na białko mleka, które wchodzi w skład preparatu. Trwają badania nad alternatywnym sposobem podawania leku, na przykład drogą dożylną [57-60].
Kolejnym lekiem jest peramiwir (Rysunek 5). Stosowany w ciężkich przypadkach zakażeń świńską grypą, charakteryzował się wysoką skutecznością. Lek podawano, mimo, że badania kliniczne nie zostały zakończone. Peramiwir budził kontrowersje, gdyż ostateczne wyniki IV fazy badań nie wykazały istotnych różnic pomiędzy próbą a kontrolą. Raport z badań, jako przyczynę podał mutacje obecne w szczepach wykorzystywanych w badaniach klinicznych. Ostatecznie peramiwir został jednak zatwierdzony przez FDA w 2014 roku. Lek podawany jest dożylnie [54, 59]. Laninamiwir to inhibitor neuraminidazy, skuteczny w walce z szczepami opornymi na oseltamiwir. Laninamiwir wykazuje podobieństwo strukturalne do zanamiwiru. Stosowany jest w postaci proleku – oktanianu laninamiwiru.
30
Rysunek 5. Strukturalny wzór peramiwiru.
Oktanian laninamiwiru jest stosowany, jako proszek do inhalacji i w przeciwieństwie do zanamiwiru potrzebne jest tylko jednorazowe podanie, ponieważ lanamiwir ma przedłużoną trwałość w płucach [55, 56].
Niestety stosowanie leków przeciwwirusowych często wiąże się z wystąpieniem oporności u szczepów wirusa grypy. Przykładowo, dziś nie zaleca się już stosowania amantadyny i rymantadyny. Amantadyna oraz rymantadyna były lekami nacelowanymi na białko M2 i powodowały zaburzenia działania kanału jonowego, co blokowało procesy usunięcia otoczki i fuzji osłonki z błoną pęcherzyka endocytarnego [61].
W 1994 roku obserwowana oporność u podtypu H3N2 na amantadynę i rimantadynę wynosiła 1%, natomiast w roku 2005 wzrosła już do 91% [62, 63]. Rośnie także procent szczepów opornych na oseltamiwir. Wystąpienie mutacji skutkującej zastąpieniem histydyny przez tyrozynę w pozycji 274 w NA powoduje słabsze wiązanie oseltamiwiru [64]. Właśnie ze względu na pojawiającą się oporność, nowe substancje o działaniu przeciwwirusowym muszą być nieustannie poszukiwane.
Kierunki poszukiwań obejmują, miedzy innymi, inhibitory, które celują w interakcje zachodzące pomiędzy białkami gospodarza i vRNP wirusa. Do takich inhibitorów mogą należeć wielonienasycone kwasy tłuszczowe, naturalnie występujące w komórce. Badania na myszach wykazały, że protektyna D wykazuje inhibicję namnażania wirusa grypy typu A [65].
Jako, że splicing jest kluczowym etapem infekcji wirusowej, duże znaczenia ma poszukiwanie inhibitorów tego procesu. Do zidentyfikowanych niskocząsteczkowych związków, które zaburzają proces splicingu wirusowego mRNA, należy TG003. Związek ten jest inhibitorem białka CLK1, które uczestniczy w splicingu. Namnażanie wirusa grypy typu A w linii komórkowej A549 w obecności TG003 było obniżone o 93%, bez zaobserwowania efektów toksycznych [66].
31 Poza badaniami cyklu namnażania wirusa i poszukiwaniem jego nowych inhibitorów stosowane są także badania przeciwwirusowych właściwości substancji pochodzących z ekstraktów roślin stosowanych zwyczajowo w leczeniu grypy. Badania najczęściej mają na celu identyfikację substancji czynnej, która mogłaby być stosowana, jako suplement wspomagający leczenie grypy. Do roślin, które posiadają właściwości przeciwwirusowe należy między innymi Jatropha multifida, która jest rośliną z rodzaju wilczomleczowatych, występującą na terenie Republiki Związku Mjanmy (dawniej Birma). Wodne oraz chloroformowe ekstrakty z J. multifida inhibowały namnażanie wirusa H1N1. Dodatkowo, wodne ekstrakty zwiększały przeżywalność komórek MDCK zakażonych wirusem grypy typu A [67].
Trwają prace z wykorzystaniem nanocząstek w walce z wirusem grypy. W ciągu ostatnich 10 lat znaczenie nanotechnologii w walce z wirusami znacznie wzrosło. Poza zastosowaniem w leczeniu, nanocząstki wykorzystywane są w detekcji, obrazowaniu wirusa grypy i badaniu efektywności szczepionek [68].
Nanocząstki stosuje się, między innymi, w celu lepszego dostarczenia leku czy zwiększenia przeciwwirusowego działania. Przykładowo, Lin i współpracownicy stworzyli nanocząstki selenu, które pozwalają na efektywne dostarczenie zanamiwiru. Selen dodatkowo stymuluje układ immunologiczny. Nanocząstki selenu charakteryzuje też niska toksyczność. Oprócz selenu stosowano także nanocząstki srebra z zanamiwirem, które wykazuje właściwości przeciwwirusowe. W obu przypadkach przeżywalność zakażonych komórek traktowanych nanocząstkami była większa niż w kontroli [58, 69].
Stosowano także nośniki złota, mimo, że nanocząstki złota nie wykazują właściwości przeciwwirusowych. Sametband i współpracownicy pokryli nanocząstki złota merkaptoetansulfonianem (MES) oraz kwasem merkaptobursztynowym (MSA). Oba typy nanocząstek inhibowały namnażanie wirusa grypy w linii komórkowej MDCK. Za właściwości przeciwwirusowe stosowanych w badaniach nanocząstek były odpowiedzialne sulfoniany, polisulfoniany i polisiarczany wykazujące działanie przeciwwirusowe poprzez wiązanie białka HA i zahamowanie wnikania wirusa grypy do komórki [70, 71]. Nanocząstki mogą być też wykorzystywane w dostarczaniu antysensowych oligonukleotydów [72].
