Anna Prescha, Aleksander Siger1), Katarzyna Lorenc-Kukuła2),
Jadwiga Biernat, Małgorzata Nogala-Kałucka1), Jan Szopa2)
BADANIA NAD SKŁADEM I PODATNOŚCIĄ NA UTLENIANIE OLEJU Z NASION LNU
MODYFIKOWANEGO GENETYCZNIE
Katedra i Zakład Bromatologii i Dietetyki Akademii Medycznej im. Piastów Śl. we Wrocławiu
Kierownik: prof. dr hab. J. Biernat
1) Katedra Biochemii i Analizy Żywności Uniwersytetu Przyrodniczego im. A. Cieszkowskiego w Poznaniu
Kierownik: prof. dr hab. J.R. Warchalewski
2) Zakład Biochemii Genetycznej Uniwersytetu Wrocławskiego Kierownik: prof. dr hab. J. Szopa
Z nasion lnu Linola oraz jego linii transgenicznych o zwiększonej zawar-tości związków fenolowych wytłoczono olej metodą na zimno. Oleje poddano analizie składu kwasów tłuszczowych oraz związków przeciwutleniających, a także oceniono ich podatność na utlenianie. Wykazano zwiększoną zawar-tość związków fenolowych, a także zmniejszenie szybkości tworzenia dienów sprzężonych oraz aldehydów w olejach transgenicznych w porównaniu do ole-ju z nasion niemodyfi kowanych.
Hasła kluczowe: len transgeniczny, olej lniany, kwasy tłuszczowe, związki przeciw-utleniające, podatność na utlenianie.
Key words: transgenic fl ax, linseed oil, fatty acids, antioxidants, susceptibility to oxidation.
Olej niskolinolenowy z odmiany lnu Linola jest bardziej oporny na utlenianie w porównaniu z tradycyjnym wysokolinolenowym olejem lnianym, dlatego nadaje się do dłuższego przechowywania i może stanowić w żywieniu zamiennik oleju słonecznikowego. Obecność w oleju związków o właściwościach przeciwutleniają-cych może dodatkowo podwyższać jego oporność na utlenianie.
Za pomocą wektora zawierającego 3 geny kodujące enzymy syntezy antocyja-nów: syntazę chalkonu, izomerazę chalkonu oraz reduktazę dihydrofl awanolu prze-prowadzono transformację genetyczną lnu Linola i uzyskano rośliny transgenicz-ne o zwiększotransgenicz-nej kumulacji związków fenolowych w liściach i nasionach. Analiza roślin transgenicznych wykazała zwiększoną (nawet o 50%) zawartość związków fenolowych ogółem zarówno w tkankach zielonych, jak i nasionach dwóch wyselek-cjonowanych linii transgenicznych W92/40 i W92/72 (1). Analiza chromatografi czna fl awonoidów wykazała wzrost ilości fl awanonów, fl awonoli i fl awonów, szczególnie apigeniny, kemferolu i kwercetyny w nasionach w porównaniu do kontroli.
Stwier-dzono ponadto zwiększoną kumulację lignanu diglukozydu sekoizolarycyrezinolu. Badanie aktywności antyoksydacyjnej metanolowych ekstraktów z odtłuszczonych nasion wykazało od 1,5 do 6. wyższy potencjał antyoksydacyjny w przypadku na-sion transgenicznych w porównaniu do niemodyfi kowanej kontroli (2). Związki przeciwutleniające gromadzone w nasionach w różnym stopniu przechodzą do oleju w zależności od ich powinowactwa do wody i od metody pozyskiwania oleju. Ich zawartość zmienia się ponadto w trakcie procesów oczyszczania oleju, a najwięk-sza jest w oleju tłoczonym na zimno i poddanym jedynie fi ltracji (3, 4). Zarówno związki hydrofobowe, jak i hydrofi lowe wykazują działanie stabilizujące olej. Ich skuteczność w ochronie przed powstawianiem produktów utleniania zależy między innymi od ich stężenia, struktury i wzajemnych proporcji (synergizm), ale też od składu kwasów tłuszczowych oleju i obecności w nim substancji promujących utle-nianie. Związki przeciwutleniające ulegają ponadto procesom degradacji w czasie przechowywania oleju, a czynnikami przyspieszającymi te procesy może być pod-wyższona temperatura i promieniowanie elektromagnetyczne (5, 6).
Celem pracy była analiza składu kwasów tłuszczowych i ocena zawartości związ-ków fenolowych, tokoferoli, plastochromanolu-8 oraz β-karotenu w tłoczonych na zimno olejach lnianych z nasion transgenicznych W92/40 i W92/72 odznaczających się zwiększoną kumulacją związków fenolowych, a także w oleju z nasion niemo-dyfi kowanych. W wytłoczonych olejach poddanych utlenianiu w podwyższonej temperaturze oznaczono zawartości nadtlenków, sprzężonych dienów i aldehydów formujących w różnym czasie ogrzewania w temp. 140°C.
MATERIAŁ I METODY
Z nasion pochodzących z uprawy polowej lnu niemodyfi kowanego oraz 2 linii transgenicznych W92/40 i W92/72 wytłoczono olej metodą na zimno z użyciem prasy hydraulicznej.
Skład kwasów tłuszczowych oznaczono metodą chromatografi i gazowej (aparat Agilent Technology 6890N z detektorem FID) z zastosowaniem kwasu pentadekano-wego jako wzorca wewnętrznego. Rozdziału estrów metylowych kwasów tłuszczo-wych dokonano na kolumnie kapilarnej Rtx 2330 (105 m × 0,25 mm × 0,2 μm) (7).
Tokoferole, plastochromanol-8 oraz β-karoten w próbkach oleju rozcieńczonych
n-heksanem w stosunku 1:10 oznaczano metodą wysokosprawnej chromatografi i
cieczowej (aparat Waters Milford 600 z detektorem fl uorymetrycznym, wzbudzenie przy λ = 290 nm, emisja λ = 330 nm) (8). Rozdziału dokonano na kolumnie LiChro-sorb Si 60 (200 × 4,6 mm, 5 μm) z mieszaniną n-heksanu i 1,4-dioksanu (97:3 v/v) jako faza ruchoma. Przy analizie β-karotenu zastosowano spektrofotometr UV-VIS (λ = 450 nm).
W ekstraktach metanolowych olejów oznaczono zawartość związków fenolowych metodą kolorymetryczną z zastosowaniem odczynnika Folina-Ciocalteu (6).
Ocenę podatności na utlenianie oleju poddanego działaniu temp. 140°C w róż-nych odcinkach czasu przeprowadzono oznaczając:
– zawartość dienów sprzężonych metodą spektrofotometryczną (λ = 234 nm), jako wzorzec zastosowano kwas linolowy 9c,11t i 10t,12c (9),
– zawartość substancji reagujących z kwasem tiobarbiturowym (TBARS), jako wzorzec zastosowano aldehyd dimalonowy (10),
– liczbę nadtlenkową wg PN-ISO 3960, – liczbę anizydynową wg PN-EN ISO 6885.
Oznaczenia produktów utleniania wykonywano w co najmniej trzech powtórze-niach, tak aby względne odchylenie standardowe wynosiło <5%.
WYNIKI I ICH OMÓWIENIE
Wyniki oznaczeń zawartości kwasów tłuszczowych w olejach z nasion Linoli i jej linii transgenicznych przedstawione tab. I wskazują na brak istotnych różnic w składzie kwasów tłuszczowych pomiędzy badanymi olejami. Zawartość kwasu α-linolowego była w nich bardzo wysoka: 64–66 g/100 g oleju. W oleju W92/72 stwierdzono o 2,8% więcej tego kwasu niż w oleju Linola, lecz różnica ta nie była istotna statystycznie. Kwas α-linolenowy występował w badanych olejach w ilości od 1,56 do 1,67 mg/100 g oleju. Niewielka zawartość tego kwasu (do 2,5% udzia-łu w sumie kwasów tudzia-łuszczowych) jest cechą charakterystyczną wszystkich nisko-linolenowych odmian lnu Solin (11).
Ta b e l a I. Zawartość kwasów tłuszczowych w olejach lnianych w mg/100 g Ta b l e I. Fatty acid content in the flax oils.
Kwasy tłuszczowe Linola W92/40 W92/72
C 14 0,114 ± 0,027 0,113 ± 0,061 0,146 ± 0,118 C 15:1 0,015 ± 0,002 0,014 ± 0,001 0,016 ± 0,001 C 16 7,021 ± 0,755 6,629 ± 0,540 6,141 ± 0,239 C 16:1 0,215 ± 0,017 0,223 ± 0,070 0,196 ± 0,124 C 17 0,113 ± 0,009 0,120 ± 0,005 0,126 ± 0,013 C 17:1 0,055 ± 0,001 0,056 ± 0,003 0,053 ± 0,005 C 18 4,341 ± 0,108 4,331 ± 0,093 4,487 ± 0,363 C 18:1c 16,625 ± 0,513 16,489 ± 0,436 16,569 ± 1,224 C 18:2c 64,261 ± 1,422 64,858 ± 1,133 66,110 ± 0,634 C 20 0,191 ± 0,003 0,129 ± 0,004 0,140 ± 0,012 C 18:3c (n-3) 1,616 ± 0,016 1,565 ± 0,016 1,672 ± 0,033 C 20:1 0,113 ± 0,011 0,110 ± 0,007 0,105 ± 0,011 C 20:2 0,154 ± 0,066 0,197 ± 0,004 0,194 ± 0,045 C 22 0,158 ± 0,006 0,166 ± 0,021 0,158 ± 0,006
Zawartość związków fenolowych, tokoferoli, plastochromanolu-8 i β-karotenu w badanych olejach przedstawiono w tab. II. Olej z nasion Linoli zawierał 1,19 mg/100 g związków fenolowych ogółem. Wartość ta była wg różnych autorów zbliżona lub nieco wyższa w porównaniu do wyników oznaczeń tych związków w tłoczonych na zimno olejach słonecznikowym, rzepakowym i sojowym (3, 4, 12). Ilości związków fenolowych w olejach z nasion transgenicznych W92/40 i W92/72
były odpowiednio o 6,3 oraz 11,8% wyższe w porównaniu do niemodyfi kowanej kontroli. Olej Linola zawierał w 100 g 83,37 mg tokoferoli ogółem, przy czym po-nad 96% tej ilości stanowił γ-tokoferol. Oleje transgeniczne różniły się od niemody-fi kowanej kontroli w niewielkim stopniu pod względem zawartości tokoferoli. Jedy-nie olej W92/72 odznaczał się o ok. 2,5% niższą całkowitą zawartością tych związ-ków, a także γ-tokoferolu. Znaczny udział γ-tokoferolu w sumie tokoferoli (powyżej 95%) stwierdza się w olejach lnianych z odmian zarówno wysoko-, jak i niskolino-lenowych (13, 14). Całkowita zawartość tokoferoli w badanym oleju z Linoli i jej transgenicznych linii okazała się jednak od 0,3 do nawet 5. wyższa w porównaniu do odmian wysokolinolenowych (13, 15). Spośród hydrofobowych związków o silnych właściwościach przeciwutleniających wykazano stosunkowo duże ilości plastochro-manolu-8 we wszystkich badanych olejach z nasion lnu (11,48–13,18 mg/100 g). Wysoka zawartość tego związku wydaje się być cechą charakterystyczną olejów lnianych nisko- i wysokolinolenowych (16). Stwierdzono, że olej z linii W92/40 zawierał o 13% więcej plastochromanolu-8 w porównaniu do kontroli. β-karoten występował w badanych olejach w niewielkich ilościach (0,14–0,16 mg/100 g).
Badania oporności olejów lnianych na utlenianie nie wykazały zahamowania pro-cesu tworzenia się nadtlenków w olejach transgenicznych w porównaniu do kontroli w czasie do 50 min. ogrzewania w temp. 140°C (ryc. 1). Wartości liczby nadtlenkowej po 35 min. ogrzewania olejów nie przekroczyły 10. Szybkość tworzenia się nadtlen-ków w poszczególnych badanych olejach była jednak nieco inna w dłuższym czasie działania wysokiej temperatury. Ogrzewanie przez 65 i 80 min. spowodowało większą kumulację nadtlenków w olejach transgenicznych w porównaniu do kontroli.
Ogrzewanie olejów w czasie do 60 min. powodowało jedynie niewielki wzrost liczby dienów sprzężonych w olejach z nasion transgenicznych (ryc. 2). Olej Linola zawierał ok. 2-krotnie więcej tych związków w porównaniu do olejów transgenicz-nych po 40 min. działania wysokiej temperatury. Znaczne różnice w szybkości tworzenia się dienów sprzężonych w badanych olejach stwierdzono w czasie 70 i więcej min. ogrzewania. Ogrzewanie nawet do 100 min. nie spowodowało spadku zawartości związków o wiązaniach sprzężonych w oleju W92/40 w przeci-wieństwie do pozostałych olejów.
Ta b e l a II. Zawartość związków przeciwutleniających w olejach lnianych w mg/100 g Ta b l e II. Antioxidant content in the flax oils
Linola W92/40 W92/72 Związki fenolowe ogółem* 1,19 ± 0,04 1,27 ± 0,01 1,35 ± 0,01
Tokoferole: α 2,07 ± 0,14 1,51 ± 0,00 1,90 ± 0,02 β 0,04 ± 0,01 0,04 ± 0,01 0,03 ± 0,00 γ 80,34 ± 0,61 80,91 ± 0,72 78,27 ± 0,13 δ 0,92 ± 0,06 1,10 ± 0,06 0,95 ± 0,01 Plastochromanol-8 11,48 ± 0,07 13,18 ± 0,40 11,85 ± 0,21 β-karoten 0,14 ± 0,01 0,16 ± 0,01 0,15 ± 0,01
Ryc. 3. Zmiany zawartości aldehydów oznaczanych metodą TBARS w olejach lnianych w czasie ogrze-wania
Fig. 3. Changes in TBARS concentrations in the heated fl ax oils. Ryc. 1. Zmiany liczby nadtlenkowej olejów lnianych w czasie ogrzewania Fig. 1. Changes in the peroxide value of the heated fl ax oils.
Ryc. 2. Zmiany zawartości dienów sprzężonych w olejach lnianych w czasie ogrzewania Fig. 2. Changes in diene concentrations in the heated fl ax oils.
Oznaczenia zawartości aldehydów w olejach metodą TBARS wykazały, że świe-ży olej Linola gromadził nawet 2,5-krotnie więcej tych związków w stosunku do olejów z nasion transgenicznych (ryc. 3). Obserwowano wyraźne zmniejszanie się ilości aldehydów w czasie do 35 min. ogrzewania w stosunku do olejów nie podda-nych działaniu wysokiej temperatury. Wyniki te wskazują na to, że w krótkim czasie ogrzewania w olejach proces odparowania lotnych aldehydów obecnych w świe-żo wytłoczonych olejach przeważa nad tworzeniem się tych związków w procesie utleniania. Największą zawartością aldehydów odznaczał się olej Linola poddany działaniu wysokiej temperatury przez 50 minut. Ogrzewanie w czasie dłuższym niż 50 min. spowodowało zmniejszenie liczby aldehydów wykrywanych metodą TBARS w tym oleju. Kumulacja aldehydów w olejach z nasion transgenicznych uległa zmniejszeniu po 65 min. ogrzewania.
Świeży olej wytłoczony z nasion zawierał niewielkie ilości aldehydów reagu-jących z p-anizydyną (ryc. 4). Metoda ta wykrywa obecność w tłuszczu aldehy-dów głównie o charakterze nielotnym. Liczba anizydynowa badanych olejów nie poddanych utlenianiu wynosiła 0,84–1,69. Ogrzewanie olejów w temp. 140°C w czasie do 90 min. spowodowało stopniowe zwiększanie się ilości aldehydów
Ryc. 4. Zmiany liczby anizydynowej olejów lnianych w czasie ogrzewania Fig. 4. Changes in the anisidine value in the heated fl ax oils.
w olejach, przy czym kumulacja tych związków w oleju z nasion niemodyfi kowa-nych była w tym przedziale czasu największa. Należy zauważyć, że już 10 min. działania wysokiej temperatury spowodowało wzrost liczby anizydynowej do wartości od 8,01 do 9,29.
WNIOSKI
1. Nie wykazano istotnych różnic w składzie kwasów tłuszczowych oleju z na-sion transgenicznych i niemodyfi kowanych.
2. Stwierdzono nieco mniejszą w stosunku do kontroli zawartość γ-tokoferolu oraz większe ilości plastochromanolu-8 w oleju z nasion transgenicznych W92/40. Oleje z obu badanych linii transgenicznych zawierały więcej związków fenolowych ogółem w porównaniu do niemodyfi kowanej kontroli.
3. W olejach z nasion transgenicznych poddanych ogrzewaniu obserwowano zmniejszanie się kumulacji dienów sprzężonych oraz aldehydów w stosunku do kontroli. Wartości liczby nadtlenkowej zmieniały się w badanych olejach w podob-ny sposób podczas ich ogrzewania.
A. P r e s c h a, A l . S i g e r1, K. L o r e n c-K u k u ł a2, J. B i e r n a t, M. N o g a l a-K a ł u c k a1, J. S z o p a2
STUDY OF COMPOSITION AND SUSCEPTIBILITY TO OXIDATION OF OIL FROM GENETICALY MODIFIED FLAXSEED
S u m m a r y
The oils from Linola fl ax and its transgenic lines W92/40 and W92/72 with enhanced fenolic compound accumulation were cold pressed. The fatty acid composition and the contents of total phenolic compounds, tocopherols, plastochromanol-8 and i β-carotene were determined in the oils. Similar fatty acid profi le in the transgenic fl ax and Linola oils were observed. Higher contents of phenolic compounds in the trans-genic lines were observed in comparison with Linola. W92/40 oil contained lower amount of γ-tocopherol and higher plastochromanol-8 amount. The rate of conjugated diene and aldehyde formation in the heated oils from transgenic seeds was lower than in the Linola oil. The hydroperoxide concentrations in the trans-genic fl ax and Linola oils did not differ considerably during the oxidation.
PIŚMIENNICTWO
1. Lorenc-Kukuła K., Amarowicz R., Oszmiański J., Doermann P., Starzycki M., Skała J., Żuk M.,
Kulma A., Szopa J.: Pleiotropic effect of phenolic compounds content increases in transgenic fl ax plant.
J. Agr. Food Chem., 2005; 53: 3685-3692. – 2. Lorenc-Kukuła K., Wróbel-Kwiatkowska M., Starzycki M.,
Szopa J.: Engineering fl ax with increased fl avonoid content and thus Fusarium resistance. Physiol. Mol.
Plant Pathol., 2007; 70: 38-48. – 3. Kania M., Michalak M., Gogolewski M.: Zmiany potencjału antyok-sydacyjnego w oleju rzepakowym tłoczonym na zimno i po jednostkowych procesach rafi nacji. Bromat. Chem. Toksykol., 2005; 1: 19-26. – 4. Kania M., Michalak M., Gogolewski M. Hoffmann A.: Antioxida-tive potential of substances contained in cold pressed soybean oil and after each phase of refi ning process. Acta Sci. Pol., Technol. Aliment., 2004; 3(1): 113-121. – 5. Szukalska E.: Wybrane zagadnienia utleniania tłuszczów. Tł. Jad., 2003; 1-2: 42-61. – 6. Gomez-Alonso S., Fregapane G., Salvador M.D., Gordon M.H.: Changes in phenolic composition and antioxidant activity of virgin olive oil during frying. J. Agric. Food Chem., 2003; 51: 667-672. – 7. Prescha A., Świędrych A., Biernat J., Szopa J.: The increase in lipid con-tent in potato tubers modifi ed by 14-3-3-gene overexpression. J. Agr. Food Chem., 2001; 49: 3638–3643. – 8. PN-EN-12822/2002. Oznaczanie zawartości witaminy E metodą wysokosprawnej chromatografi i cieczowej. Pomiar α-, β-, γ-, δ-tokoferoli. 9. Recknagel R.O., Glende E.A. Jr.: Spectrophotometric detec-tion of lipid conjugated dienes. Meth. Enzymol. 1984; 105: 331-337. – 10. Łukaszewicz M., Szopa J.,
Krasowska A.: Susceptibility of lipids from different fl ax cultivars to peroxidation and its lowering by
added antioxidants. Food Chem., 2004; 88: 225-231.
11. Dribienki J.C.P., Green A.G., McEachern S.F., Kenaschuk E.O., Rashid K.Y.: Linola™ ‘1084’ low linolenic acid fl ax. Can. J. Plant Sci., 1999; 79: 607–609. – 12. Siger A., Nogala-Kałucka M.,
Lampart-Szczapa E., Hoffman A.: Antioxidant activity of phenolic compounds of selected cold-pressed and refi ned
plant oils Oilseed Crops, 2005; 26(2): 549-560. – 13. Choo W.S., Birch J., Dufour J.P.: Physiochemical and quality characteristics of cold-pressed fl axseed oils. J. Food Comp. Anal., 2007; 20: 202-211. – 14.
Lemcke-Norojärvi M., Kamal-Eldin A., Appelqvist L.-A., Dimberg L.H., Öhrvall M., Vessby B.: Corn and
sesame oils increase serum γ-tocopherol concentrations in healthy swedish women. J. Nutr. 2001; 131: 1195-1201. – 15. Tuberoso I.G., Kowalczyk A. Sarritzu E., Cabras P.: Determination of antioxidant com-pounds and antioxidant activity in commercial oilseeds for food use. Food Chem. 2007; 103: 1494-1501. – 16. Olejnik D., Gogolewski M., Nogala-Kałucka M.: Isolation and some properties of plastochromanol-8. Nahrung/Food, 1997; 2: 101-104.
!["Nad autoportretem Józefa Wittlina", Marian Stępień, "Miesięcznik Literacki" nr 3 (1979) : [recenzja]](data:image/gif;base64,R0lGODlhAQABAIAAAP///wAAACH5BAEAAAAALAAAAAABAAEAAAICRAEAOw==)