Henryk Bartoń1, Kornelia Indyka1, Maria Fołta1, Joanna Chłopicka1,
Elżbieta Karczewska2, Iwona Skiba-Kurek2, Alicja Budak2
WPŁYW MANGANU(II) NA PRZEBIEG FERMENTACJI MLEKOWEJ MĄKI ŻYTNIEJ
1 Pracownia Biopierwiastków, Zakład Bromatologii,
Collegium Medicum, Uniwersytet Jagielloński w Krakowie Kierownik: dr hab. P. Zagrodzki
2 Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej
Collegium Medicum, Uniwersytet Jagielloński w Krakowie Kierownik: prof. dr hab. A. Budak
Celem pracy było zbadanie wpływu dodatku jonów manganu(II) na przebieg fermentacji mlekowej z użyciem naturalnych bakterii wyhodowanych z mąki żytniej. Bakterie zostały zidentyfi kowane jako Lactobacillus buchneri. Fermen-tację prowadzono przez 2 tygodnie w temp. 30°C, monitorując objętości wytwa-rzanych gazów, kwasowość całkowitą, pH oraz aktywność antyoksydacyjną. Dodatek manganu spowodował wzrost wytwarzania gazów i pH, natomiast obniżył znacznie kwasowość całkowitą, a na aktywność antyoksydacyjną wpły-wał umiarkowanie dodatnio. Wyniki te wskazują na modyfi kację metabolizmu i dynamiki przez bakterie w obecności manganu.
Hasła kluczowe: probiotyki, Lactobacillus buchneri, fermentacja mlekowa, żywność funkcjonalna, mangan.
Key words: probiotics, Lactobacillus buchneri, lactic acid fermentation, functional food, manganese.
Rola prawidłowej mikrofl ory jelit w utrzymaniu zdrowia człowieka została osta-tecznie udokumentowana w badaniach poznania ludzkiego mikrobiomu (1). Skład mikrobiomu przewodu pokarmowego ulega modyfi kacji w przebiegu wielu scho-rzeń, szczególnie w chorobach o nieustalonej etiologii (np. nieswoiste zapalenia jelit, zaburzenia autystyczne) (2). Podlega on też zmianom zależnym od rodzaju diety i pochodzenia żywności. Głównym siedliskiem mikrofl ory przewodu pokarmowego u człowieka jest jelito kręte i okrężnica (3,4).
Bakterie rodzaju Lactobacillus (L.) nie zawierają katalazy umożliwiającej neutra-lizację H2O2, dlatego są w znacznym stopniu odporne na ten utleniacz. Niektóre typy
L. magazynują duże ilości manganu, który odgrywa rolę pseudokatalazy. Bakterie rodzaju L. są zdolne do wychwytu również innych metali ciężkich, dlatego podej-mowane są badania w celu ich wykorzystania do detoksykacji wody oraz żywności z metali toksycznych, w tym także w warunkach in vivo (5).
Mangan odgrywa istotną rolę w funkcjonowaniu organizmu człowieka jako skład-nik enzymów biorących udział, między innymi, w syntezie proteoglikanów (tkanka
łączna, chrząstka) i w ochronie antyoksydacyjnej w postaci mitochondrialnej dys-mutazy ponadtlenkowej (MnSOD). Mangan jest powszechnie obecny w żywności, dlatego nie jest obserwowany populacyjny niedobór tego mikropierwiastka (6). Pro-wadzone są jednak badania, obejmujące tak zapotrzebowanie, jak i niedobory u ludzi w różnych schorzeniach. Granice bezpieczeństwa jego spożycia, a w szczególności nadmiar manganu, jest przedmiotem uwagi ze względu na jego neurotoksyczność, zwłaszcza w związku z ryzykiem nadmiernego obciążenia tym pierwiastkiem nowo-rodków i dzieci (7). Stężenie Mn jest ustawowo ograniczane w wodzie dostarczanej ludności i wodach handlowych przeznaczonych do spożycia (50 mikrogramów/L) (8). Wzrost zainteresowania suplementami diety nasuwa pytania dotyczące suple-mentacji mikropierwiastkami, w tym manganem, stosowanym jako dodatek do in-nych suplementów diety (np. glukozamina + mangan).
Jako kontynuację badań nad wpływem mikropierwiastków na proces fermentacji mlekowej produktów roślinnych przedstawiamy obecnie pracę, której celem była wstępna ocena wpływu dodatku manganu w różnych stężeniach na przebieg fer-mentacji mlekowej mąki żytniej prowadzonej z użyciem naturalnej kultury bakterii rodzaju Lactobacillus (9–11).
MATERIAŁ I METODY
Materiał: Do badań zastosowano mąkę żytnią z pełnego przemiału z regionu podkarpackiego (2011 r.) i bakterie wyhodowane z tej mąki. Próbkę zawierającą wyhodowane bakterie poddano propagacji na drodze cyklicznej fermentacji in-okulowanej mąki do uzyskania stanu stacjonarnego.
Odczynniki: Glicynian manganu(II) otrzymano w wyniku reakcji stechiome-trycznych ilości siarczanu manganu(II) i zobojętnionej NaOH glicyny (11).
Monitorowanie fermentacji: Reaktory biologiczne do hodowli beztlenowej użyto do fermentacji i ciągłego pomiaru objętości wytwarzanych gazów oraz pobierania próbek (10). Objętość wytworzonych gazów mierzono w cylindrach miarowych, pojemność kwasową oznaczono metodą miareczkowania alkacymetrycznego 0,1 M NaOH wobec błękitu bromotymolowego, pomiaru pH dokonano za pomocą pehametru laboratoryjnego (CyberScan pH 510, Eutech Instruments), aktywność antyoksydacyjną oznaczono spektrofometrycznie w mikropłytkach (Synergy 2/ Biotek, USA) w temp. 25°C metodą ABTS po 30-minutowej inkubacji w wodnym buforze pH 7,4 i DPPH po 60 min. inkubacji w metanolowym roztworze buforu octanowego. Wyniki z obu metod analitycznych wyznaczono metodą ekstrapolacji do stężenia zero i wyrażono w postaci równoważników troloksu (12).
Fermentacja: Mieszaniny 30 g drobnej frakcji mąki żytniej, 40 ml zakwasu starterowego i 0,2 L wody, umieszczono w cieplarce (30°C) na 24 h. Do reakto-rów dodano kolejno wzrastające ilości glicynianu manganu(II) odpowiadające 0, 10, 20 oraz 40 mg manganu na 100 g mąki oraz uzupełniono glicynianem sodu do uzyskania jednakowego stężenia glicyny i uzupełniono wodą do objętości 0,3 L, podłączono do przewodów i wypełniono argonem. Proces fermentacji prowadzono w temperaturze 30°C przez dwa tygodnie. Próbki pobrane w trakcie fermentacji (10 mL) odwirowano i zamrożono do czasu analizy.
Identyfi kacja bakterii: Badania wykonano za pomocą testu API (ang. Analitycal Profi le Index) określającego profi l metabolizmu cukrów (13).
Opracowanie wyników: W celu standaryzacji uzyskane wyniki wyrażono w przeliczeniu na 100 g mąki użytej do fermentacji.
WYNIKI I ICH OMÓWIENIE
Wartości parametrów monitoringu próby kontrolnej (bez dodatku manganu) w czasie dwutygodniowej fermentacji zawiera tabela I. Wzmożoną produkcję ga-zów obserwowano w ciągu początkowych dwu dni fermentacji. W próbie kontrolnej produkcja gazów po 2 tygodniach podwoiła się i wyniosła 200 mL/100g mąki.
T a b e l a I. Wartości parametrów kontrolnej fermentacji mąki żytniej w trakcie 2-tygodniowego monitorowania procesu
T a b l e I. Parameter values of control fermentation of rye meal during two-week’s process monitoring
Dzień fermentacji Gazy mL/100g pH Kwasowość ogólna mmol/100g DPPH (25°C, 30’) μM Trx/100g ABTS (25°C, 60’) μM Trx/100g 0 0 3,48 45 38 89 1 83 3,41 94 44 111 2 107 3,49 68 29 102 3 140 3,50 65 32 114 5 140 3,56 78 36 121 7 173 3,59 88 50 129 13 200 3,63 105 49 179
* dane w przeliczeniu na 100 g mąki; Trx – równoważnik troloksu
Wskaźnik pH dla próby kontrolnej praktycznie ustalił się już w początkowym dniu fermentacji, a wartość końcowa po 2 tygodniach była wyższa tylko o 0,15. Oznacza to niewielką alkalizację mieszaniny, prawdopodobnie w wyniku rozkładu (np. dekarboksylacji) kwasów o wyższej mocy powstających w pierwszym etapie fermentacji lub wzrost stężenia zasadowych metabolitów buforujących.
Kwasowość ogólna i aktywność antyoksydacyjna (DPPH) osiągnęła wartość zbliżoną do końcowej już po pierwszym dniu fermentacji. Jednak aktywność anty-oksydacyjna oznaczona metodą ABTS w drugim tygodniu znacząco wzrosła w tej próbie.
W próbach z dodatkiem manganu dodawane ilości Mn: 10, 20, 40 mg/100g mąki wielokrotnie przewyższały naturalną zawartość Mn w nasionach żyta 2,58 mg/100g (14). Wpływ dodatku manganu na badane parametry zestawiono w tabeli II.
W próbkach z dodatkiem manganu stwierdzono podwyższenie objętości wydzie-lonych gazów o 22–47%. Parametr pH wzrastał proporcjonalnie do stężenia manga-nu (R2 = 1,00), natomiast kwasowość ogólna obniżała się wraz ze wzrostem stężenia
manganu. Aktywność antyoksydacyjna DPPH wzrastała ze wzrostem stężenia man-ganu i znacząco wzrosła przy najwyższym stężeniu Mn.
T a b e l a II. Monitorowane parametry i ich zmiana po 2-tygodniowej fermentacji mąki żytniej z dodatkiem różnych ilości glicynianu manganu(II)
T a b l e II. Monitored parameters and their changes after two-week fermentation of rye meal with addition of different amounts of manganese(II) glycinate
Parametr Jednostki
Dodatek Mn mg/100g* 0 0 10 20 40
Wartość Względny wpływ dodatku Mn R2
Gazy mL/100g 200 0% 43% 47% 22% 0,06
pH – 3,63 0% 6% 11% 22% 1,00
Kwasowość ogólna mmol/100g 105 0% –7% –13% –50% 0,94
DPPH μM/100g 49 0% 10% 13% 83% 0,88
ABTS μM/100g 179 0% –5% 4% 26% 0,82
* w przeliczeniu na 100 g mąki; R2 – współczynnik determinacji dla korelacji pomiędzy stężeniami dodanego
manganu a względnymi zmianami parametrów wobec próby bez dodatku Mn
W celu dalszej analizy danych wyznaczono wskaźniki determinacji dla korelacji pomiędzy różnymi badanymi parametrami dla próby kontrolnej (A) i z najwyższym dodatkiem Mn (B) (tabela III).
T a b e l a III. Korelacje oznaczonych parametrów w czasie 2-tygodniowej fermentacji mąki żytniej bez dodatku Mn (A) i z dodatkiem glicynianu manganu(II) (B)
T a b l e III. Correlations of estimated parameters during two-weeks fermentation of rye meal without Mn addition (A) and with addition manganese(II) glycinate (B)
A (0 mg Mn) R2
Parametr Gazy pH Kwasowość ogólna DPPH ABTS
Gazy – 0,92 0,84 0,27 0,72 pH 0,92 – 0,94 0,19 0,61 Kwasowość ogólna 0,84 0,94 – 0,81 0,90 DPPH 0,27 0,19 0,81 – 0,45 ABTS 0,72 0,61 0,90 0,45 – B (40 mg Mn) Gazy – 0,86 0,51 0,32 0,76 pH 0,86 – 0,43 0,09 0,78 Kwasowość ogólna 0,51 0,43 – 0,44 0,21 DPPH 0,32 0,09 0,44 – 0,19 ABTS 0,76 0,78 0,21 0,19 –
Korelacje Pearsona dla parametrów monitoringu fermentacji dla grupy kontrolnej i mieszaniny o najwyższym stężeniu manganu zawiera tabela III. W korelacjach pominięto parametry początkowe monitorowania fermentacji ze względu na brak ustalenia się jeszcze równowagi pomiędzy fazą stałą a wodną, na co wskazywały duże odchylenia od wartości spodziewanych. Wszystkie korelacje były dodatnie.
Ogólnie, korelacje parametrów dla próby kontrolnej były silniejsze od prób z dodatkiem manganu. Najwyższe współczynniki determinacji wykazała korelacja par pH i kwasowość ogólna oraz pH i objętość gazów w próbie kontrolnej, natomiast w próbie z dodatkiem manganu (B) tylko korelacja pH z objętością gazów. Uwzględ-niając fakt, że wykładnik pH jest liczbowo miarą alkaliczności, wydzielanie gazów i wzrost pH można interpretować jako spowodowane równoległym zachodzeniem dekarboksylacji kwasów i w konsekwencji wzrostem alkaliczności. Na proces ten nie wpływa znacząco obecność manganu, co widoczne jest z danych w tabeli II. W próbie kontrolnej pH skorelowane jest silnie z kwasowością, co oznacza produkcję słabszych kwasów w trakcie dalszej fermentacji, niż wytworzonych początkowo. Dodatek manganu znacznie osłabia tę korelację.
Aktywność antyoksydacyjna ABTS (oraz DPPH) była skorelowana z kwasowo-ścią ogólną w próbie kontrolnej, ale korelacje te zostały znacząco osłabione przy dodatku manganu. Mangan jest pierwiastkiem przejściowym zdolnym do uczestni-czenia w reakcjach redox (np. Fentona), zwłaszcza w niższych stężeniach. Wyniki przedstawione w tabeli II dotyczące wpływu Mn na aktywność antyoksydacyjną potwierdzają taką interpretację w odniesieniu do ABTS. Wpływ wysokiego stężenia Mn na wzrost aktywności antyoksydacyjnej wymaga jednak odrębnego wyjaśnienia. Hipotetycznie bakterie mogły zwiększyć aktywność enzymów antyoksydacyjnych z udziałem manganu, co mogło ochraniać antyoksydanty egzogenne obecne w śro-dowisku fermentacyjnym.
Wyniki wskazały, że dodatek jonów manganu powoduje ograniczenie wytwarza-nia kwasów jako metabolitów, wzrost wytwarzawytwarza-nia gazów oraz umiarkowany wzrost aktywności antyoksydacyjnej. Obserwowany wzrost aktywności antyoksydacyjnej był znaczny przy najwyższym stężeniu Mn. Wyniki wskazująna przyspieszenie i modyfi kację metabolizmu bakterii przez dodatek manganu. Wzrost aktywności antyoksydacyjnej wywołany dodatkiem manganu wymaga wyjaśnienia.
H. B a r t o ń, K. I n d y k a, M. F o ł t a, J. C h ł o p i c k a, E. K a r c z e w s k a, I. S k i b a - K u r e k, A. B u d a k
INFLUENCE OF MANGANESE(II) ON LAKCID FERMENTATION OF RYE MILL S u m m a r y
The aim of the study was to investigate the effect of the addition of the manganese ions (II) on the fermentation of lactic acid with natural bacteria grown from rye fl our. The bacteria were identifi ed as
Lactobacillus buchneri. The fermentation was carried out for two weeks at. 30°C, while monitoring the
volume of produced gas, a total acidity, pH, and antioxidant activity. The addition of manganese caused the increase in the production of gases and pH, and signifi cantly reduced the total acidity, while the an-tioxidant activity was moderately positively affected. These results indicate a modifi cation of metabolism of the bacteria and its dynamic in the presence of manganese.
PIŚMIENNICTWO
1. Radwan P., Radwan-Kwiatek K., Skrzydło-Radomańska B.: Rola mikrofl ory jelitowej w nieswo-istych zapaleniach jelit. Przegl. Gastroenterol., 2009; 4(1): 1-6. – 2. Benach L.J., Li E., McGovern M.M.: A microbial association with autism. M. Bio., 2012; 3(1): 1-3. – 3. Szewczyk K.: Wpływ dodatku miedzi
i cynku na fermentację mlekową mąki żytniej, w tym na metabolity kwasowe, aktywność antyoksyda-cyjną i solubilizację składników mineralnych. Praca Magisterska, Uniwersytet Jagielloński, Collegium Medicum, Kraków, 2012. – 4. Fortuna M.: Właściwości antyoksydacyjne kwasu chlebowego i wybra-nych produktów fermentowawybra-nych. Praca Magisterska, Uniwersytet Jagielloński, Collegium Medicum, Kraków 2011. – 5. Mrvičić J., Stanzer D., Stolic E., Stehlik-Tomas V.: Interaction of lactic acid bacteria with metal ions: opportunities for improving food safety and quality. World J. Microbiol. Biotechnol., 2012; 28: 2771-2782. – 6. Bolesławska I., Maruszewska M., Przysławski J.: Ocena spożycia wybranych mikropierwiastków występujących w całodziennych racjach pokarmowych kobiet i mężczyzn z regionu Wielkopolski. Now. Lek., 2005; 74(4): 366-368. – 7. Milatovic D., Zaja-Milatovic S., Gupta R. C., Yu Y.,
Aschner M.: Oxidative damage and neurodegeneration in manganese-induced neurotoxicity. Toxicol.
Appl. Pharmacol, 2009; 240: 219-225. – 8. Rozporządzenie Ministra Zdrowia z dnia 13 listopada 2015 r. w sprawie jakości wody przeznaczonej do spożycia przez ludzi, Dz.U. 2015, poz. 1989. – 9. Szewczyk
K., Sitek A.: The effect of addition of copper and zinc on quantitative and qualitative composition of the
organic acids produced during lactic acid fermentation of rye fl our. Przegl. Lek., 2013; 70(Supl. 1): 22. – 10. Bartoń H., Fortuna M., Fołta M., Chłopicka J.: Wpływ procesu fermentacji mlekowej na stężenie cynku i miedzi w zakwasach uzyskanych z przetworów różnych rodzajów zbóż i pseudozbóż. Brom. Chem. Toksykol., 2015; 48(3): 229-235.
11. Podkowa K, Bartoń H, Fołta M., Dobrowolska-Iwanek J.: Wpływ dodatku kompleksu chelatowego miedzi z glicyną na zawartość kwasów organicznych powstających w wyniku procesu fermentacji mąki żytniej. Brom. Chem. Toksykol., 2014; 47(3): 681-686. – 12. Barton H. J.: A “zero sample concentration approach”. Standardization of methods for the estimation of total antioxidant activity by the use of ex-trapolation to zero sample concentration. A novel standard. Part 1. ABTS cation radical scavenging. J. Agric. Food Chem., 2010; 58(16): 8918-8926. – 13. Analytical Profi le Index: API® 50 CH. http://www. biomerieux.pl. – 14. USDA Search for Widows, v.1, database v. SR24(http://www.ars.usda.gov/Services/ docs.htm? docid=8964).
