Medycyna Weterynaryjna - Summary Medycyna Wet. 64 (6), 741-744, 2008

Medycyna Wet. 2008, 64 (6) 741

Artyku³ przegl¹dowy Review

Bruceloza jest groŸn¹ zoonoz¹. Wywo³uj¹ j¹ pa³ecz-ki rodzaju Brucella. Zgodnie z tradycyjn¹ klasyfikacj¹ uwzglêdniaj¹c¹ ró¿nice fenotypowe, w³aœciwoœci an-tygenowe, preferencje do okreœlonego ¿ywiciela i ce-chy epidemiologiczne w obrêbie rodzaju wyró¿nia siê 6 podstawowych gatunków maj¹cych wœród zwierz¹t swoich g³ównych ¿ywicieli: B. abortus (byd³o), B. me-litensis (kozy, owce), B. suis (œwinie), B. canis (psy), B. ovis (owce) i B. neotomae (szczur pustynny). W ob-rêbie trzech pierwszych gatunków wyró¿nia siê ponad-to biotypy: B. abortus – biotypy 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9, B. melitensis – biotypy 1, 2 i 3, B. suis – biotypy 1, 2, 3, 4. Oprócz wielu gatunków zwierz¹t udomowionych, pa-³eczki Brucella mog¹ wystêpowaæ u szeregu przedsta-wicieli l¹dowych zwierz¹t wolno ¿yj¹cych i zwierz¹t laboratoryjnych. W ostatnich latach stwierdzono rów-nie¿ obecnoœæ bruceli u ssaków morskich (9). W zwi¹z-ku z tym zaproponowano utworzenie dwóch kolejnych gatunków: B. pinnipediae (¿ywiciele to wieloryby, delfiny, morœwiny, orki) oraz B. cetaceae (foki, lwy morskie, morsy). S¹ to wci¹¿ nazwy nieoficjalne.

Ze wzglêdu na skalê badañ diagnostyka laboratoryj-na brucelozy opiera siê przede wszystkim laboratoryj-na badaniach serologicznych. Stwierdzenie obecnoœci w organizmie zwierzêcia specyficznych przeciwcia³ anty-Brucella jest poœrednim dowodem jego zaka¿enia lub kontaktu z pa³eczkami Brucella. Jednak pomimo coraz wy¿szej wartoœci diagnostycznej testów serologicznych nale¿y

mieæ na wzglêdzie, ¿e niejednokrotnie nie pozwalaj¹ one na odró¿nienie reakcji swoistych od reakcji krzy-¿owych, powodowanych przez drobnoustroje o pokrew-nej z brucelami budowie antygenowej. Szczególne problemy stwarzaj¹ w tym wzglêdzie Yersinia entero-colitica O:9, Escherichia coli O:157, Francisella tula-rensis, Salmonella urbana. Z tego wzglêdu wci¹¿ jako „z³oty standard”, potwierdzaj¹cy zaka¿enie drobno-ustrojami Brucella, uwa¿ana jest izolacja i identyfika-cja zarazka. Na potrzebê zastosowania tego typu badañ wskazuje zarówno Miêdzynarodowy Urz¹d ds. Epizoo-tii (OIE), jak i Unia Europejska. Badania te nale¿y prze-prowadziæ we wszystkich przypadkach poronieñ oraz dodatnich reakcji serologicznych. Izolacji dokonuje siê na pod³o¿ach selektywnych. W naszym kraju s¹ to agar i bulion z glukoz¹ i dodatkiem surowicy (SDA i SDB) oraz zestawem odpowiednio dobranych antybiotyków. Identyfikacja wyizolowanych drobnoustrojów jest do-konywana w oparciu o wyniki szeregu testów: barwie-nia metod¹ Grama, okreœleniu wymagabarwie-nia do wzrostu CO₂, testów na katalazê, oksydazê, ureazê, siarko-wodór, wra¿liwoœæ na fagi, wzrost na pod³o¿ach z barw-nikami – tionin¹ i fuksyn¹ zasadow¹, aglutynacjê z su-rowicami monowalentnymi anty-A, anty-M i anty-R. Badanie bakteriologiczne w kierunku brucelozy jest d³u-gotrwa³e (zwykle trwa 10-14 dni, chocia¿ niekiedy jest kontynuowane do 6 tygodni), czêsto trudne do jedno-znacznej interpretacji, drogie, charakteryzuje siê nisk¹

Nowoczesne aspekty

diagnostyki molekularnej brucelozy

Zak³ad Mikrobiologii Pañstwowego Instytutu Weterynaryjnego – Pañstwowego Instytutu Badawczego, Al. Partyzantów 57, 24-100 Pu³awy

Szulowski K., Murat J.

New aspects of molecular diagnostics of brucellosis

Summary

The diagnostics of brucellosis is primarily based on serological investigations. Since a serologically positive response can occur from antigenically cross-reactive bacteria, the isolation and identification of the pathogen from a potentially infected host remains the “gold standard” as a tool for the confirmation of infection. However, this process also has drawbacks. The tests are time consuming, complex and must be performed by highly skilled personnel. The zoonotic nature of most Brucella species is a potential hazard for laboratory personnel who must manipulate the infectious agent during testing. Finally, some of the characteristics are subjective and the results are not always definitive. Recently, progress in these aspects of diagnostics has been advanced through PCR-based technologies. PCR-based assays are simple to design and carry out, rapid, inexpensive to perform and are characterized by high diagnostic values: sensitivity and specificity. The following is a review of the major assays constituting excellent progress in the diagnostics of brucellosis.

Medycyna Wet. 2008, 64 (6) 742

czu³oœci¹ – szczególnie w przypadkach fazy chronicz-nej zaka¿enia, oraz wymaga szczególnych warunków bezpieczeñstwa i ostro¿noœci przy pracy z tak wysoce zakaŸnym materia³em. Wa¿nym argumentem, przema-wiaj¹cym za opracowaniem coraz szybszych i nieza-wodnych metod diagnostycznych jest bardzo silnie ar-tyku³owane niebezpieczeñstwo u¿ycia bruceli w bio-terroryzmie.

Z tych wzglêdów w ostatnich latach coraz szersze zastosowanie w diagnostyce brucelozy znajduj¹ meto-dy biologii molekularnej, w tym szczególnie PCR. Mog¹ one byæ u¿yte na trzech poziomach badañ diagnostycz-nych. Pierwszy zapewnia potwierdzenie, ¿e badany materia³ genetyczny nale¿y do drobnoustrojów Brucel-la, a wiêc ma specyficznoœæ rodzajow¹. Drugi pozwala na okreœlenie przynale¿noœci gatunkowej i ewentual-nie biotypu bruceli. Wreszcie trzeci poziom pozwala na jeszcze bardziej precyzyjne okreœlenie cech wyizo-lowanego szczepu, a wiêc jego typowanie. Dziêki temu mo¿na okreœliæ jego pokrewieñstwo z dotychczas wy-izolowanymi szczepami, pochodzenie i Ÿród³o zaka-¿enia.

Metody specyficzne rodzajowo

Pierwsze badania wykonywane metod¹ PCR skupia-³y siê na identyfikacji rodzajowo specyficznych frag-mentów materia³u genetycznego. Spowodowane to by³o ma³¹ iloœci¹ danych dotycz¹cych sekwencji genomu drobnoustrojów Brucella. Pionierami tych badañ byli Fekete i wsp. (8). Badacze ci amplifikowali fragment genu odpowiadaj¹cego za syntezê bia³ka zewnêtrznej b³ony cytoplazmatycznej – 43 kDa, dziêki czemu uzys-kali produkt o wielkoœci 635 par zasad (pz), obecny u wszystkich znanych gatunków Brucella, co potwier-dzili na szeregu szczepach bruceli. Jednoczeœnie, po-przez u¿ycie zestawu innych szczepów bakteryjnych, (w tym Y. enterocolitica, E. coli, S. typhimurium) wo-bec których reakcja PCR okaza³a siê ujemna, potwier-dzili specyficznoœæ metody.

Kolejnych badañ podjêli siê Herman i De Ridder (11). Tym razem zajêli siê genem 16S rRNA le¿¹cym w ob-rêbie rybosomu bakteryjnego. Poprzez jego amplifi-kacjê uzyskali produkt PCR o wielkoœci 800 pz. Test zastosowany do identyfikacji szczepów bakteryjnych pozwala³ na uzyskanie pozytywnych wyników w przy-padku wszystkich gatunków Brucella, natomiast spe-cyficznoœæ metody zawodzi³a w przypadku drobnoustro-ju Ochrobactrum anthropi, gdzie w czêœci powtórzeñ uzyskiwano s³aby pr¹¿ek œwiadcz¹cy o obecnoœci pro-duktu o wielkoœci identycznej do tej, jaki obserwowa-no dla szczepów Brucella.

W podobnym kierunku badania rozwinêli Romero i wsp. (25). Dokonali oni analizy porównawczej wyni-ków uzyskanych z zastosowaniem 9 ró¿nych kombina-cji par starterów. Badania przeprowadzili, podobnie jak poprzedni autorzy, wykorzystuj¹c do tego celu szczepy bakteryjne. Najlepsz¹ metod¹ – najbardziej specyficz-n¹ i pozwalaj¹c¹ na uzyskanie najsilniejszej reakcji okaza³ siê PCR z u¿yciem starterów F4-R2,

pozwalaj¹-cych na uzyskanie produktu o wielkoœci 905 pz. Po-twierdzono specyficznoœæ tej metody, z jednym wyj¹t-kiem O. anthropi biotyp D – szczepu izolowanego z krwi ludzkiej. Inne biotypy i gatunki tego rodzaju drobnoustrojów nie powodowa³y ju¿ tego problemu. Metodê tê zastosowano równie¿ do badania prób mle-ka pochodz¹cego od krów zamle-ka¿onych i wolnych od brucelozy (27). Czu³oœæ PCR w stosunku do badania bakteriologicznego kszta³towa³a siê na poziomie 87,5%. Fa³szywie ujemne wyniki w PCR t³umaczono obecnoœ-ci¹ inhibitorów reakcji polimeryzacji w mleku. Czu-³oœæ PCR okaza³a siê równie¿ ni¿sza w porównaniu do ELISA z mlekiem. W kolejnych badaniach dokonano modyfikacji parametrów na etapie ekstrakcji brucelo-zowego DNA z mleka, co pozwoli³o na podniesienie czu³oœci metody (26).

Nastêpne badania prowadzone przez Rijpensa i wsp. dotyczy³y regionu 16S-23S, wysoce zmiennego wœród bakterii (24). Stosuj¹c startery BRU-P5 i BRU-P8, uzys-kano produkt o wielkoœci 726 pz. Metodê zastosowano do badania surowego mleka. Autorzy wskazali na pro-blemy zwi¹zane z uzyskaniem odpowiedniej czu³oœci testu, a to ze wzglêdu na trudnoœci w ekstrakcji DNA z mleka i obecnoœæ inhibitorów reakcji. Czu³oœæ tê, ich zdaniem, znacznie poprawi³oby zastosowanie nested PCR z u¿yciem dodatkowej pary starterów. Badania, w których wykorzystano szczepy ró¿nych gatunków drobnoustrojów potwierdzi³y, ¿e równie¿ w tym przy-padku na specyficznoœæ reakcji wp³ywa³y dodatnie wyniki uzyskiwane z niektórymi szczepami O. anthro-pi, ale niewielkie modyfikacje parametrów PCR pozwo-li³y na wyeliminowanie reakcji krzy¿owych z tym za-razkiem. Badania dotycz¹ce tego samego fragmentu rybosomalnego RNA prowadzili równie¿ Fox i wsp. (10). Zastosowane przez nich startery KF5 i KF6 pozwoli³y na uzyskanie specyficznego dla wszystkich gatunków bruceli produktu generuj¹cego w elektro-forezie 5 pr¹¿ków o ró¿nych masach.

Obiektem zainteresowania Leal-Klevezas i wsp., pozwalaj¹cym na zastosowanie PCR do diagnostyki brucelozy sta³ siê z kolei gen koduj¹cy syntezê bia³ka zewnêtrznej b³ony cytoplazmatycznej bruceli – tzw. omp-2 (12). Dziêki zastosowaniu starterów JPF i JPR autorzy ci amplifikowali produkt wielkoœci 193 pz, spe-cyficzny dla wielu szczepów ró¿nych gatunków i bio-typów Brucella, ale nie pozwalaj¹cy na wykrycie B. suis biotyp 2 i 3, B. canis i B. ovis. Metoda okaza³a siê za to skuteczna do wykrywania naturalnych zaka¿eñ B. me-litensis u kóz przy u¿yciu próbek krwi i mleka. Jej czu-³oœæ zdecydowanie przewy¿sza³a czuczu-³oœæ badañ hodow-lanych, a nawet, w przypadku badania krwi, czu³oœæ badania serologicznego przy u¿yciu rose bengal test.

Najczêstsze zastosowanie, wœród metod specyficz-nych rodzajowo, znalaz³a technika pozwalaj¹ca na am-plifikacjê fragmentu chromosomalnego DNA o masie 223 pz koduj¹cego syntezê immunogennego bia³ka b³o-ny cytoplazmatycznej komórek bruceli (BCSP 31), w której wykorzystano startery B4-B5 (BCSP31–PCR). Jej autorami byli Baily i wsp., którzy, uzyskuj¹c

pro-Medycyna Wet. 2008, 64 (6) 743

dukt specyficzny tylko dla drobnoustrojów Brucella, stwierdzili jednoczeœnie brak ró¿nic w czu³oœci testu w zale¿noœci od gatunku u¿ytych bruceli (2). Matar i wsp. u¿yli tej metody do badania krwi od ludzi bêd¹-cych w ostrej fazie choroby potwierdzaj¹c jej wartoœci diagnostyczne, w tym czu³oœæ, któr¹ ich zdaniem mo¿-na zwiêkszyæ przez zastosowanie reakcji reamplifika-cji (15). Stosuj¹c PCR w tym samym celu Queipo--Ortuno i wsp., badaj¹c próbki krwi od osób zaka¿o-nych pa³eczkami Brucella ocenili czu³oœæ metody na 100%, natomiast jej specyficznoœæ na 98,3% (21).

Badania prowadzone przez Moratê i wsp., dotycz¹ce równie¿ brucelozy u ludzi potwierdzi³y, ¿e jest to me-toda bardzo czu³a, przewy¿szaj¹ca czu³oœci¹ badania hodowlane i swoista (17). Jedynym wyj¹tkiem okaza³y siê drobnoustroje O. anthropi, które generowa³y wyni-ki fa³szywie dodatnie, co stwierdzono w badaniu czy-stych kultur bakteryjnych. Autorzy ci zastosowali rów-nie¿ PCR sprzê¿ony z testem ELISA (PCR – ELISA) zastêpuj¹cym etap elektroforezy zwi¹zany z u¿yciem bromku etydyny, co jeszcze bardziej zwiêksza³o czu-³oœæ testu (18). Zerva i wsp. uwa¿aj¹ z kolei, ¿e najlep-szym materia³em do diagnostyki brucelozy u ludzi z u¿y-ciem BCSP31-PCR jest surowica (30). Jest ona pozba-wiona inhibitorów reakcji, które znajduj¹ siê w krwi i przez to metoda z u¿yciem surowicy jest bardziej czu-³a, a przy tym tak samo wysoce specyficzna. Podobnie Navarro i wsp. uwa¿aj¹, ¿e w przypadku u¿ycia pe³nej krwi w badaniu PCR z zastosowaniem starterów B4 i B5 nale¿y siê liczyæ z obni¿eniem czu³oœci testu (19). Przyczynia siê do tego du¿a koncentracja w krwi geno-mowego DNA cz³owieka (lub zwierzêcia), którego ba-damy. Richtzenhain i wsp. z kolei zastosowali metodê w formie multiplex PCR (24). Dokonali tego poprzez dodatkowe zastosowanie pary starterów Lep1 i Lep2 pozwalaj¹cych na amplifikacjê fragmentu genu charak-terystycznego dla drobnoustrojów Leptospira spp. W badaniu materia³u pobranego z poronionych p³odów uzyskali w przypadku brucelozy wy¿sz¹ czu³oœæ PCR w porównaniu do badañ bakteriologicznych.

Ró¿nicowanie gatunkowe

Czêsto potwierdzenie, ¿e wyizolowane drobnoustroje nale¿¹ do rodzaju Brucella jest niewystarczaj¹ce. Taka sytuacja mo¿e zaistnieæ w czasie realizacji programu zwalczania brucelozy lub prowadzenia dochodzenia epidemiologicznego. St¹d podjêto próby zastosowania wariantów PCR pozwalaj¹cych na ró¿nicowanie gatun-ków Brucella lub ich biotypów. W tej grupie testów najczêstsze zastosowanie znajduje tzw. AMOS-PCR pozwalaj¹cy na identyfikacjê i odró¿nienie B. abortus – biotypy 1, 2 i 4, B. melitensis, B. ovis i B. suis – bio-typ 1. Metoda ta zastosowana po raz pierwszy przez Bricker i Halling pozwala na rozró¿nienie wymienio-nych biotypów bruceli dziêki wykorzystaniu faktu poli-morfizmu fragmentu genu okreœlanego jako IS711 (5). Wystêpuje on w zwielokrotnionej formie w ró¿nej iloœ-ci u poszczególnych przedstawiiloœ-cieli bruceli, co skut-kuje ró¿n¹ wielkoœci¹ produktu uzyskanego w PCR. Dla

B. abortus (biotypy 1, 2 i 4) uzyskuje siê produkt wiel-koœci 498 pz, B. melitensis (wszystkie biotypy) – 731 pz, B. ovis – 976 pz, a dla B. suis (biotyp 1) produkt wiel-koœci 285 pz. Metoda jest, zdaniem autorów, specyficzna i czu³a, ale nie pozwala na identyfikacjê wszystkich przedstawicieli Brucella. Poprzez zastosowanie dodat-kowych odpowiednich starterów mo¿e byæ równie¿ wykorzystana w krajach, gdzie praktykowane jest szcze-pienie do rozró¿nienia szczepów szczepionkowych B. abortus S19 i RB51 od szczepów terenowych. Test ten zastosowano równie¿ do wykrywania B. melitensis w nasieniu buhajów i tryków, a tak¿e w tkankach poro-nionych p³odów owiec (1, 13). Metoda okaza³a siê bar-dziej czu³a ni¿ badanie hodowlane. Natomiast Man-terola i wsp. wykorzystali j¹ równie¿ do badania nasie-nia, ale w kierunku zaka¿eñ powodowanych przez B. ovis. W tym przypadku czu³oœæ metody ocenili jako ni¿sz¹ zarówno w stosunku do badania bakteriologicz-nego, jak i serologicznego (14).

Inn¹ metod¹ zastosowan¹ do ró¿nicowania gatunko-wego jest PCR-RFLP (polimorfizm d³ugoœci fragmen-tów restrykcyjnych). Opiera siê ona na analizie d³ugoœci fragmentów restrykcyjnych, jakie powstaj¹ po trawie-niu produktów reakcji PCR enzymami restrykcyjnymi. Baz¹ do tych badañ u Brucella by³y sekwencje genów koduj¹cych bia³ka b³ony zewnêtrznej omp2A i omp2B. Zastosowanie w³aœciwego zestawu enzymów restryk-cyjnych pozwala³o na identyfikacjê wiêkszoœci gatun-ków Brucella a tak¿e niektórych biotypów (7). Metoda ta, modyfikowana przez innych badaczy sta³a siê, oprócz AMOS-PCR, jedn¹ z wa¿niejszych, jeœli chodzi o testy molekularne, metod ró¿nicowania gatunków Brucella.

Typowanie szczepów Brucella

Metody te coraz czêœciej wykorzystywane s¹ w epide-miologii molekularnej zaka¿eñ pa³eczkami Brucella. Pozwalaj¹ na ró¿nicowanie szczepów bakteryjnych, œle-dzenie Ÿróde³ zaka¿enia oraz ich rozprzestrzenianie siê. Jedn¹ z technik jest identyfikacja minisatelitarnego polimorfizmu DNA w oparciu o istniej¹ce w genomie wielokopijne, powtarzalne sekwencje, charakteryzuj¹-ce siê okreœlon¹ d³ugoœci¹ (w przybli¿eniu 35-125 pz). Przy³¹czaniu siê do takich, bardzo podobnych ale nie identycznych sekwencji, sprzyja u¿ycie nie do koñca komplementarnych, tzw. zdegenerowanych starterów. Metodê tê w wersjach ERIC-PCR (enterobacterial re-petitive intergenic consensus) i REP-PCR (repetitiv extragenic palindromic) zastosowali Mercier i wsp. (16) i Tcherneva i wsp. (28) uzyskuj¹c wzory indywidual-nych „odcisków palców” (fingerprints) dla poszczegól-nych, typowych szczepów Brucella. W zale¿noœci od liczby powtarzalnych fragmentów, ich wzajemnego po³o¿enia i odleg³oœci miêdzy sob¹ uzyskuje siê cha-rakterystyczny produkt. Bricker i wsp. (3) w oparciu o technikê fingerprinting dokonali charakterystyki po-równawczej szczepów Brucella izolowanych od ssa-ków morskich oraz 6 tradycyjnych gatunssa-ków Brucella wskazuj¹c na znaczne ró¿nice w liczbie kopii badane-go fragmentu IS711 DNA.

Medycyna Wet. 2008, 64 (6) 744

Interesuj¹c¹ i przydatn¹ metod¹ do typowania szcze-pów bruceli jest badanie mikrosatelitarnego polimorfi-zmu DNA. Technika okreœlaj¹ca zró¿nicowanie liczby powtórzeñ tandemowych (zwykle 12-30 powtórzeñ na locus), sk³adaj¹cych siê z sekwencji 1-10 nukleotydów, okreœlana jako VNTR (variable number tandem repeat), po raz pierwszy, choæ pod inn¹ nazw¹, zastosowana zosta³a przez Bricker i wsp. (4). Autorzy ci gruntownie przebadali 8 loci genomu bruceli zawieraj¹cych powtó-rzenia tandemowe. Z kolei Whatmore i wsp. w³¹czyli do badañ kolejnych 13 loci (29). Analiza 121 izolatów Brucella pozwoli³a uzyskaæ 119 ró¿nych wzorów ge-notypów, chocia¿ analiza drzewa filogenetycznego zbudowanego w oparciu o dane z VNTR, poza nielicz-nymi wyj¹tkami, potwierdzi³a przynale¿noœæ poszcze-gólnych szczepów zgodn¹ z tradycyjn¹ klasyfikacj¹. Metoda jest uwa¿ana za prost¹, szybk¹, pozwala na zautomatyzowanie i wykorzystanie analizy kompute-rowej do identyfikacji poszczególnych alleli bruceli. Zdaniem autorów stwarza du¿e perspektywy do zasto-sowania w dochodzeniu epidemiologicznym i okreœla-niu pokrewieñstwa pomiêdzy izolowanymi szczepami Brucella.

B³yskawiczna identyfikacja bruceli przy u¿yciu PCR w czasie rzeczywistym (real-time PCR)

Prekursorem u¿ycia real-time PCR do rozpoznawa-nia Brucella byli Redkar i wsp. (22). Wykorzystuj¹c, podobnie jak w teœcie AMOS-PCR, polimorfizm frag-mentu genu IS711, badacze ci zastosowali metodê real--time, sk³adaj¹c¹ siê z trzech osobnych reakcji PCR. Pozwoli³o to na identyfikacjê i ró¿nicowanie B. meli-tensis i B. abortus oraz B. suis biotyp 1. Monitorowa-nie stê¿enia produktu zapewnia³y sondy hybrydyzuj¹-ce z nim i generuj¹hybrydyzuj¹-ce fluoreshybrydyzuj¹-cencjê proporcjonaln¹ do iloœci produktu. Kolejni badacze – Newby i wsp. zasto-sowali real-time PCR do identyfikacji B. abortus (20). Czynione s¹ próby wykorzystania tej metody w diag-nostyce brucelozy u ludzi z zastosowaniem ró¿nego ro-dzaju materia³u – krwi, p³ynu mózgowo-rdzeniowego, próbek tkanek narz¹dów wewnêtrznych, a nawet suro-wicy.

Metoda ta stwarza du¿e perspektywy. Umo¿liwia monitorowanie reakcji w czasie, w którym ta reakcja przebiega. Pozwala na bardzo szybkie uzyskanie wyni-ków (25-30 min.). Mo¿e byæ wykorzystana zarówno do wykrywania bruceli, jak i ich identyfikacji.

Piœmiennictwo

1.Amin A. S., Hambdy M. E. R., Ibrahim A. K.: Detection of Brucella melitensis in semen using the polymerase chain reaction assay. Vet. Microbiol. 2001, 83, 37-44.

2.Baily G. G., Krahn J. B., Drasar B. S., Stoker N. G.: Detection of Brucella melitensis and Brucella abortus by DNA amplification. J. Trop. Med. Hyg. 1992, 95, 271-275.

3.Bricker B. J., Ewalt D. R., Halling S. M.: Brucella „HOOF”-Prints: strain typing by multi-locus analysis of variable number tandem repeats (VNTRs). BMC Microbiol. 2003, 3, 15.

4.Bricker B. J., Ewalt D. R., MacMillan A. P., Foster G., Brew S.: Molecular characterization of Brucella strains isolated from marine mammals. J. Clin. Microbiol. 2000, 38, 1258-1262.

5.Bricker B. J., Halling S. M.: Differentiation of Brucella abortus bv. 1, 2, and 4, Brucella melitensis, Brucella ovis, and Brucella suis bv. 1 by PCR. J. Clin. Microbiol. 1994, 32, 2660-2666.

6.Cloeckaert A., Grayon M., Grepinet O., Boumedine K. S.: Classification of Brucella strains isolated from marine mammals by infrequent restriction sit-PCR and development of specific PCR identification tests. Microbes Infect. 2003, 5, 593-602.

7.Cloeckaert A., Verger J. M., Grayon M., Grepinet O.: Restriction site polymor-phism of the genes encoding the major 25 kDa and 26 kDa outer-membrane proteins of Brucella. Microbiology. 1995, 141, 2111-2121.

8.Fekete A., Bantle J. A., Halling S. M., Sanborn M. R.: Preliminary development of a diagnostic test for Brucella using polymerase chain reaction. J. Appl. Bacteriol. 1990, 69, 216-227.

9.Foster G., MacMillan A. P., Godfroid J., Howie F., Ross H. M., Cloeckaert A., Reid R. J., Brew S., Patterson I. A. P.: A review of Brucella sp. infection of sea mammals with particular emphasis on isolates from Scotland. Vet. Microbiol. 2002, 91, 563-580.

10.Fox K. F., Fox A., Nagpal M., Steinberg P., Heroux K.: Identification of Brucella by ribosomal-spacer-region PCR and differentiation of Brucella canis from other Brucella spp. pathogenic for humans by carbohydrate profiles. J. Clin. Micro-biol. 1998, 36, 3217-3222.

11.Herman L., De Ridder H.: Identification of Brucella spp. by using the poly-merase chain reaction. App. Environ. Microbiol. 1992, 54, 2099-2101. 12.Leal-Klevezas D. S., Vazquez I. O., Lopez-Merino A.,

Martinez--Soriano J. P.: Single-step PCR for detection of Brucella spp. from blood and milk of infected animals. J. Clin. Microbiol. 1995, 33, 3087-3090.

13.Leyla G., Kadri G., Umran O.: Comparison of polymerase chain reaction and bacteriological culture for the diagnosis of sheep brucellosis using aborted fetus samples. Vet. Microbiol. 2003, 93, 53-61.

14.Manterola L., Tejero-Garces A., Ficapal A., Shopayeva G., Blasco J. M., Marin C. M., Lopez-Goni I.: Evaluation of PCR test for the diagnosis of Brucel-la ovis infection in semen samples from rams. Vet. Microbiol. 2003, 92, 65-72. 15.Matar G. M., Khneisser I. A., Abdelnoor A. M.: Rapid laboratory confirmation of human brucellosis by PCR. Analysis of a target sequence on the 31-kilo-dalton Brucella antigen DNA. J. Clin. Microbiol. 1996, 34, 477-478. 16.Mercier E., Jumas-Bilak E., Allardet-Servent A., O’Callaghan D., Ramuz M.:

Polymorphism in Brucella strains detected by studying distribution of two short repetitive DNA elements. J. Clin. Microbiol. 1996, 34, 1299-1302.

17.Morata P., Queipo-Ortuno M. I., Reguera J. M., Garcia-Ordonez M. A., Pichardo C., de Dios Colmenero J.: Posttreatment Follow-up of brucellosis by PCR assay. J. Clin. Microbiol. 1999, 37, 4163-4166.

18.Morata P., Queipo-Ortuno M. I., Reguera J. M., Garcia-Ordonez M. A., Carde-nas A., Colmenero J. D.: Development and evaluation of a PCR-enzyme-linked immunosorbent assay for diagnosis of human brucellosis. J. Clin. Microbiol. 2003, 41, 144-148.

19.Navarro E., Casao M. A., Solera J.: Diagnosis of human brucellosis using PCR. Exper. Rev. Mol. Diagn. 2004, 4, 115-123.

20.Newby D. T., Hadfield T. L., Roberto F. F.: Real-time PCR detection of Brucella abortus: a comparative study of SYBR green I, 5 – exonuclease, and hybridi-zation Probe assays. Appl. Environ. Microbiol. 2003, 69, 4753-4759. 21.Queipo-Ortuno M. I., Morata P., Ocon P., Manchado P., de Dios Colmonero J.:

Rapid diagnosis of human brucellosis by peripheral – blood PCR assay. J. Clin. Microbiol. 1997, 35, 2927-2930.

22.Redkar R., Rose S., Bricker B., DelVecchio V.: Real-time detection of Brucella abortus, Brucella melitensis and Brucella suis. Mol. Cell Probes 2001, 15, 43-52.

23.Richtzenhain L. J., Cortez A., Heinemann M. B., Soares R. M., Sakamoto S. M., Vasconcellos S. A., Higa Z. M. M., Scarcelli E., Genovez M. E.: A multiplex PCR for detection of Brucella spp. and Leptospira spp. DNA from aborted bovine fetuses. Vet. Microbiol. 2002, 87, 139-147.

24.Rijpens N. P., Jannes G., van Asbroeck M., Rossau R., Herman L. M. F.: Direct detection of Brucella spp. in raw milk by PCR and reverse hybridization with 16S-23S rRNA spacer probes. Appl. Environ. Microbiol. 1996, 62, 1683-1688. 25.Romero C., Gamazo C., Pardo M., Lopez-Goni I.: Specific detection of

Bru-cella DNA by PCR. J. Clin. Microbiol. 1995, 33, 615-617.

26.Romero C., Lopez-Goni I.: Improved method for purification of bacterial DNA from bovine milk for detection of Brucella spp. by PCR. Appl. Environ. Micro-biol. 1999, 65, 3735-3737.

27.Romero C., Pardo M., Grillo M. J., Diaz R., Blasco J. M., Lopez-Goni I.: Evaluation of PCR and indirect enzyme-linked immunosorbent assay on milk samples for diagnosis of brucellosis in dairy cattle. J. Clin. Microbiol. 1995, 33, 3198-3202.

28.Tcherneva E., Rijpens N., Naydensky C., Herman L.: Differentiation of Brucella species by random amplified polymorphic DNA analysis. J. Appl. Microbiol. 2000, 88, 69-80.

29.Whatmore A. M., Shankster S. J., Perrett L. L., Murphy T. J., Brew S. D., Thirl-wall R .E., Cutler S. J., MacMillan A. P.: Identification and characterization of variable-number tandem-repeat markers for typing of Brucella spp. J. Clin. Microbiol. 2006, 44, 1982-1993.

30.Zerva L., Bourantas K., Mitka S., Kansouzidou A., Legakis N. J.: Serum is the preffered clinical specimen for diagnosis of human brucellosis by PCR. J. Clin. Microbiol. 2001, 39, 1661-1664.

Adres autora: doc. dr hab. Krzysztof Szulowski, Al. Partyzantów 57, 24-100 Pu³awy; e-mail: kszjanow@piwet.pulawy.pl