Maria Fołta 1), Henryk Bartoń 1), Paweł Paśko 1), Paweł Zagrodzki 1,2),
Mirosław Krośniak 1), Zofi a Zachwieja 1)
STRES OKSYDACYJNY I ZABURZENIA METABOLICZNE U SZCZURÓW W MODELU WYSOKOFRUKTOZOWYM*.
CZ. II. WPŁYW SOKU Z ARONII NA WYBRANE PARAMETRY BIOCHEMICZNE OSOCZA
1) Zakład Bromatologii Collegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego w Krakowie
p.o. kierownika: dr P. Zagrodzki
2) Zakład Fizykochemii Jądrowej Instytutu Fizyki Jądrowej PAN im. H. Niewodniczańskiego
w Krakowie
Kierownik: dr hab. J. Mietelski
Celem badań było określenie wpływu soku z aronii (Aronia melanocarpa), jako czynnika żywieniowego o wysokim potencjale antyoksydacyjnym, na za-burzenia metaboliczne i stres oksydacyjny wywołany dużą zawartością fruktozy w diecie. Badania przeprowadzono in vivo na szczurach. Fruktoza podwyższała stężenie triglicerydów we krwi szczurów i powodowała zmiany innych wskaź-ników biochemicznych. Sok z aronii w napoju przeciwdziałał niektórym z tych zaburzeń.
Hasła kluczowe: stres oksydacyjny, fruktoza, zaburzenia metabolizmu lipidów, aronia.
Key words: oxidative stress, fructose, lipid metabolism disturbance, chokeberry. Niniejsza praca jest kolejną częścią cyklu dotyczącego badania wpływu różnych produktów na indukowany stres oksydacyjny i zaburzenia metaboliczne u szczurów. Zagadnienia metodyczne (1) i status antyoksydacyjny szczurów (tkanki) (2) przed-stawiono uprzednio. Obecnie prezentujemy wstępne wyniki wpływu soku z aronii i fruktozy oraz ich kombinacji na podstawowe wskaźniki biochemiczne, elektrolity oraz całkowitą aktywność antyoksydacyjną osocza szczurów.
Aktywność antyoksydacyjna owoców aronii i zawartość antocyjanów w nich jest znacznie wyższa niż w przypadku wielu innych owoców (3). Wiąże się to z dużą zawartością polifenoli, z dominującą frakcją proantocyjanów i antocyjanów oraz kwasu chloro- i neochlorogenowego (4). Wykazano, że kwas 4-hydroksycynamono-wy, obecny w soku z aronii, a także antocyjany, hamują utlenianie lipoprotein LDL
in vitro (5) i in vivo (6). U sportowców otrzymujących sok z aronii, powysiłkowe
wskaźniki stresu oksydacyjnego we krwi były korzystniejsze niż w grupie kontrolnej
* Projekt był fi nansowany w latach 2003–2007 w ramach grantu Komitetu Badań Naukowych (PBZ-KBN-094/P06/2003/08) oraz badań statutowych jednostki w roku 2008 i 2009.
(7). Badania na zwierzętach wykazały, że spożywanie silnie zabarwionych owoców zapobiegało indukowanemu nadtlenoazotynem uszkodzeniu nabłonka i chemicznie indukowanym nowotworom (8). Sok z aronii przeciwdziałał również indukowane-mu wytwarzaniu rakotwórczych N-nitrozoamin oraz wpływał na obniżenie stężenia mocznika w osoczu szczurów (9).
MATERIAŁ I METODY
M o d e l z w i e r z ę c y. 3-miesięczne samce rasy Wistar o masie 250 g hodowa-no przez 5 tygodni wg modelu z fruktozą w karmie, przedstawionego uprzednio (1). Pojedynczy zestaw badawczy obejmował dwie grupy po 6 szczurów, z których jedna otrzymywała semisyntetyczną karmę standardową, a druga karmę, w której 31% skrobi zamieniono na fruktozę. Badanie obejmowało 3 zestawy (po 12 szczu-rów), w których szczurom podawano napój zawierający 50% (grupy zwierząt: AR1, AR1F) lub 25% (grupy zwierząt: AR2, AR2F) soku z aronii w wodzie lub wodę w eksperymencie kontrolnym (grupy zwierząt: N5, N5F) oraz karmę zawierającą fruktozę (symbol „F”) lub bez fruktozy. Karma i napój były podawane bez ograni-czeń. Przygotowanie karm i ich charakterystykę przedstawiono w pracy (1).
Sok z aronii: 100% sok z aronii tłoczony na zimno (Eko-Ar; www.eko-aronia.pl). Analizy: przygotowanie próbek krwi do badań przedstawiono w pracy (1). Anali-zy biochemiczne osocza szczurów wykonano w laboratorium diagnostyki medycz-nej (analizator Konelab 30). Zawartość Cu, Zn i Mg w karmach oznaczono metodą płomieniową absorpcyjnej spektrometrii atomowej (PERKIN ELMER 5100ZL). Aktywność antyoksydacyjną soku z aronii i osocza szczurów oznaczono spektrofo-tometrycznie metodami przedstawionymi w pracy (1): FRAP (593 nm, 37°C, 4–60 minut); ABTS (734 nm, 30°C, 6 minut); DPPH wg. Yen et. al. (10) z modyfi kacją (11) (514 nm, 30°C, 30 minut).
Zawartość polifenoli. Oznaczenie polifenoli w karmach wykonano odczynnikiem
Folin-Ciocalteu’a (12).
S t a t y s t y k a. Rozkłady wartości parametrów i istotności różnic przebadano za pomocą statystyk parametrycznych pakietu Statistica for Windows 5.1.
WYNIKI I ICH OMÓWIENIE
Aktywność antyoksydacyjną badanego soku z aronii scharakteryzowano meto-dą FRAP (66,6±0,4 mmol Fe+2/L), ABTS (45,6±0,6 mmol/L) i DPPH (42,0±0,2 mmol/L).
W tabeli I zestawiono średnie wartości oznaczonych wskaźników biochemicz-nych osocza szczurów.
Średnie zużycie karmy (13,6–14,7 g/dzień), napoju (17,4–20,4 g/dzień) i przyrost masy szczurów (26,3–27,4%) były porównywalne w grupach „aroniowych”, nieza-leżnie od obecności fruktozy w diecie. W grupach kontrolnych zużycie karmy było nieco wyższe (15,9–16,9 g/dzień). Po 5 tygodniach zużycie karmy istotnie obniżyło się w różnym stopniu w zależności od stężenia soku z aronii w napoju, ale
nieza-leżnie od obecności fruktozy, średnio w grupach aroniowych o stężeniu: wyższym – 15%, niższym – 29% i w grupach kontrolnych – 8%. Analogicznie zużycie napoju zmniejszyło się dla tych grup, odpowiednio 12% , 20% i 14%.
Ta b e l a I. Parametry biochemiczne osocza szczurów* Ta b l e I. Biochemical parameters of rat plasma
Jednostki Ar1 Ar1F Ar2 Ar2F N5 N5F FRAP μmol/L 250±15 241±12 287±35 254±44 239±24 260±30 TCH mmol/L 1,55±0,15 1,58±0,11 1,46±0,08 1,57±0,17 2,19±0,17 2,00±0,11 HDL mmol/L 0,83±0,09 0,85±0,05 0,76±0,05 0,82±0,05 1,11±0,13 0,94±0,04 TG mmol/L 1,97±0,51 2,27±0,27 2,33±0,61 2,83±0,58 1,68±0,40 3,12±0,79 GL mmol/L 10,0±0,5 10,5±0,6 9,8±0,8 9,6±0,4 9,2±0,6 9,4±0,8 UA μmol/L 204±40 281±93 272±61 314±74 145±26 189±33 CR μmol/L 31,6±14,2 29,2±10,7 25,2±8,1 23,2±11,4 32,2±3,4 29,5±3,8 U mmol/L 7,8±1,3 7,5±0,7 6,1±0,4 7,0±1,2 10,8±0,6 10,8±1,4 ALB g/L 32,2±1,3 30,7±0,5 29,7±1,5 31,2±0,8 35,3±2,4 34,2±1,2 PROT g/L 61,2±2,5 61,1±3,0 59,5±3,0 61,0±0,7 62,3±1,2 62,6±2,3 AP U/L 193±19 155±13 188±24 172±7 240±26 191±13 Na mmol/L 142±3 143±5 142±1 142±1 140±1 140±2 K mmol/L 3,12±0,15 3,22±0,20 3,20±0,17 3,03±0,18 3,48±0,10 3,53±0,21 Mg mmol/L 0,76±0,05 0,77±0,11 0,78±0,07 0,82±0,04 0,77±0,14 0,77±0,06 Ca mmol/L 2,35±0,09 2,45±0,09 2,29±0,16 2,34±0,09 2,50±0,04 2,47±0,07
* Grupy bezfruktozowe i fruktozowe odpowiednio: Ar1, Ar1F – napój: sok z aronii 50%; Ar2, Ar2F – napój: sok z aro-nii 25%; N5, N5F– napój: woda z kranu – grupy kontrolne. Wartość średnia ± odchylenie standardowe; Parametry: FRAP – potencjał redukujący w równoważnikach Fe(+2)/L po 4 min. inkubacji; TCH – cholesterol, HDL – cholesterol o wysokiej gęstości, TG –triglicerydy, GL – glukoza, UA – kwas moczowy, CR – kreatynina, U – mocznik, ALB – albu-miny, PROT– białka, Na – sód, K – potas, Mg – magnez , Ca – wapń, AP – aktywność fosfatazy alkalicznej.
Wartości głównych parametrów biochemicznych związanych z wpływem fruk-tozy na organizm szczurów, tzn. wskaźniki gospodarki lipidowej, stężenie glukozy (GL) i kwasu moczowego (UA) oraz statusu antyoksydacyjnego (FRAP) analizo-wano metodą dwuczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) z czynnikami: 1) głów-nym (zaburzającym: fruktoza lub skrobia), 2) badagłów-nym – sok z aronii (dwa stężenia i woda).
Stwierdzono, że fruktoza (czynnik 1), sok z aronii (czynnik 2) jak i oddziały-wanie łączne istotnie modyfi kują grupę parametrów charakteryzujących zaburzenia wywoływane przez fruktozę. Fruktoza istotnie wpływała na stężenie triglicerydów (TG) i kwasu moczowego (UA), natomiast aronia istotnie wpływała na TG, całko-wite stężenie cholesterolu (TCH) i HDL, UA oraz GL. Czynniki te łącznie zniosły wzajemnie, obserwowany oddzielnie, wpływ na badane parametry.
Poziom TG był istotnie podwyższony w kontrolnej grupie fruktozowej (N5F), ale w grupach „aroniowych” efekt ten zmniejszył się i utracił znamienność, głów-nie wskutek obniżenia stężenia TG w grupach fruktozowych. W grupie kontrolnej
stężenie TCH oraz HDL było niższe w obecności fruktozy niż bez niej, natomiast w grupie „aroniowej” o niższym stężeniu aronii w napoju efekt fruktozy był od-wrotny. Pod wpływem podawania soku z aronii obserwowano niższe wartości tych wskaźników (p<0,001) i zniesienie wpływu fruktozy na te parametry.
Wpływ fruktozy na stężenie glukozy w osoczu był nieznaczny, natomiast sok aro-niowy wpływał na podwyższenie jej stężenia. Wpływ oddziaływania łącznego tych czynników na stężenie GL okazał się jednak nieistotny.
Stężenie UA w osoczu było podwyższone, ale efekt ten analizowany samodzielnie nie uzyskał istotności statystycznej. W analizie wariancji grupy parametrów zwią-zanych z zaburzeniami metabolicznymi zarówno fruktoza, jak i sok z aronii istotnie modyfi kowały ten parametr, ale efekty te znosiły się w oddziaływaniu łącznym.
Aktywność antyoksydacyjna osocza, oznaczona metodą FRAP, wykazywała sil-ną zależność od czasu inkubacji. Wpływ czynników eksperymentu na ten parametr został badany w analizie dwuczynnikowej, natomiast żaden z czynników z osobna i łącznie nie uzyskał statystycznej istotności.
Wpływ fruktozy na organizmy zwierzęce badany był przez różne ośrodki poprzez jej podaż w formie napoju (roztwory zawierające do 15% fruktozy) lub jako skład-nik karmy (do ok. 70% wag. fruktozy w karmie) (13). W prezentowanych obecnie badaniach fruktoza stanowiła 31% wagowych karmy, co odpowiadało 31% warto-ści energetycznej karmy. Zastosowany rozcieńczony sok z aronii w stężeniach 25% i 50% stanowił czynnik o umiarkowanej mocy pod względem aktywności antyok-sydacyjnej.
Głównym efektem diety wysokofruktozowej u badanych zwierząt były zmiany w profi lu lipidowym, a w szczególności silny wzrost stężenia TG (tab. I). W obecno-ści soku z aronii w diecie zwierząt nastąpiło obniżenie stężenia TG. Doprowadziło to do całkowitego zniesienia efektu fruktozy przy stężeniu soku z aronii równym 50% i w analizie łącznej. Fruktoza wpływała również na TCH i HDL, jednakże kierunek tych efektów był różny dla grupy kontrolnej i grup z aronią. Niezależnie od kierunku tego wpływu istotne różnice pomiędzy grupą fruktozową i bezfrukto-zową w grupie kontrolnej zostały również całkowicie zniesione w grupie z aronią 50% w napoju. Aronia wywołuje zatem korzystne dla organizmu szczurów zmiany przeciwdziałające zaburzeniom wywołanym przez fruktozę w parametrach profi lu lipidowego. Wyjątkiem jest pewne obniżenie stężenia HDL. Przy niewielkim jed-nak obniżeniu stężenia HDL, większy spadek stężenia TG i TCH może oznaczać obniżenie stężenia frakcji LDL. Ten fakt znajduje odzwierciedlenie w wielu innych badaniach (5). Może to ponadto wyjaśniać przyczynę faktu, że analizowane przez laboratorium diagnostyczne stężenie LDL w badanym osoczu było niskie i nie prze-kraczało granicy oznaczalności metody dostosowanej do osocza człowieka (dane niezamieszczone).
Fruktoza wpływała także nieznacznie na podwyższenie stężenia glukozy w oso-czu szoso-czurów w grupie kontrolnej, jak również w eksperymencie z 50% zawartością soku z aronii. Efekt ten nie uzyskał istotności w żadnej z grup. Jednocześnie w ob-rębie trzech par grup z zawartością 0%, 25% i 50% soku z aronii w napoju, stężenie glukozy w osoczu szczurów istotnie wzrosło, tak w grupach fruktozowych (F), jak i bezfruktozowych. Powyższy wzrost nie znajduje uzasadnienia w podaży cukrów z sokiem z aronii, natomiast może wynikać z działania antyoksydantów z aronii.
Na przykład, w badaniach na ludziach stwierdzono podwyższenie stężenia fruktozy w spermie pod wpływem ekstraktu antocyjanów z aronii (6).
Charakterystycznym efektem działania fruktozy na organizm zwierzęcy jest rów-nież wzrost stężenia kwasu moczowego we krwi (14), co potwierdziło się rówrów-nież w niniejszych badaniach. Jednakże, w obecności aronii wpływ fruktozy był nieistot-ny w oddziaływaniu łącznieistot-nym. Wskazuje to na złożone interakcje badanieistot-nych czynni-ków, co będzie analizowane oddzielnie.
Należy również zauważyć, że fruktoza istotnie obniżała aktywność fosfatazy al-kalicznej, enzymu o złożonym działaniu, niezależnie od podaży soku z aronii. Pozo-stałe wskaźniki biochemiczne (kreatynina, mocznik, białka i albuminy), jak również stężenie magnezu i analizowane elektrolity nie wykazywały zmian.
Analiza aktywności antyoksydacyjnej FRAP wykazała nieistotne statystycznie zmiany tego wskaźnika w grupach fruktozowych z aronią. Znaczny udział kwa-su moczowego w mierzonej aktywności i wzrost jego stężenia w tych grupach kwa- su-geruje, że inne składniki badanego osocza aktywne antyoksydacyjnie, mogły ulec zmniejszeniu pod wpływem fruktozy.
WNIOSKI
Sok z aronii w napoju znosił niektóre niekorzystne efekty fruktozy, między in-nymi przeciwdziałał indukowanej przez fruktozę hipertriglicerydemii i wpływał na obniżenie stężenia cholesterolu.
M. F o ł t a, H. B a r t o ń, P. P a ś k o, P. Z a g r o d z k i, M. K r o ś n i a k HIGH FRUCTOSE MODEL OF OXIDATIVE STRESS AND METABOLIC DISTURBANCES
IN RATS.
PART II. INFLUENCE OF CHOKEBERRY JUICE ON SOME BIOCHEMICAL PARAMETERS OF PLASMA
S u m m a r y
The aim of the study was to establish an infl uence of chokeberry juice (Aronia melanocarpa), as a die-tary factor of high antioxidant potential, on metabolic disturbance and oxidative stress induced by high fructose diet. The study was performed in vivo in rats. Fructose increased triglycerides concentration in blood of rats and induced changes in other biochemical parameters. The chokeberry juice protected ani-mals against some of disturbances induced by dietary fructose.
PIŚMIENNICTWO
1. Bartoń H., Fołta M., Krośniak M., Paśko P., Zagrodzki P., Zachwieja Z., Gawlik M., Gawlik M.: Modyfi kacje modelu z wysokofruktozową dietą do badań wpływu żywności na stress oksydacyjny i zabu-rzenia metaboliczne u szczurów. Bromat. Chem. Toksykol. 2008; 41: 501-505.– 2. Zagrodzki P., Joniec
A., Gawlik M., Gawlik M., Krośniak M., Fołta M., Bartoń H., Paśko P., Chłopicka J., Zachwieja Z.: High
fructose model of oxidative stress and metabolic disturbances in rats. Part I. Antioxidant status of rats’ tissues. Bull. Vet. Inst. Pulawy, 2007; 51: 407-413. – 3. Wu X., Gu L., Prior RL., Mckay S.: Characteriza-tion of anthocyanins and proanthocyanidins in some cultivars of ribes, aronia, and sambucus and their antioxidant capacity. J. Agric. Food Chem., 2004; 52: 7846-7856. – 4. Oszmiański J., Wojdylo A.: Aronia
melanocarpa phenolics and their antioxidant activity. Journal European Food Research and Technology, 2005; 221(6): 809-813. – 5. Meyer A.S., Yi O-S., Pearson D.A., Waterhouse A.L., Frankel E.N.: Inhibition of Human Low-Density Lipoprotein Oxidation in Relation to Composition of Phenolic Antioxidants in Grapes (Vitis vinifera). J. Agric. Food Chem., 1997; 45 (5): 1638-1643. – 6. Pawłowicz P., Stachowiak G.,
Bielak A., Wilczyński J.: Administration of natural anthocyanins derived from chokeberry (aronia
mela-nocarpa) extract in the treatment of oligospermia in males with enhanced autoantibodies to oxidized low density lipoproteins (oLAB). The impact on fructose levels. Ginekol. Pol., 2001; 72(12): 983-8. – 7.
Pilaczynska-Szczesniak L., Skarpanska-Steinborn A., Deskur E., Basta P., Horoszkiewicz-Hassan M.: The
infl uence of chokeberry juice supplementation on the reduction of oxidative stress resulting from an in-cremental rowing ergometer exercise. Int. J. Sport Nutr. Exerc. Metab., 2005; 15(1): 48-58. – 8. Casto
B.C., Kresty L.A., Kraly C.L., Pearl D.K., Knobloch T.J., Schut H.A., Stoner G.D., Mallery S.R., Weghorst C.M.: Chemoprevention of oral cancer by black raspberries. Anticancer Res., 2002; 22: 4005-4015. – 9. Atanasova-Goranova V.K., Dimova P.I., Pevicharova G.T.: Effect of food products on endogenous
genera-tion of N-nitrosamines in rats. British Journal of Nutrigenera-tion, 1997; 78: 335-345. – 10. Yen G.C., Chen H.Y.: Antioxidant activity of various tea extracts in relation to their antimutagenicity. J. Agric. Food Chem., 1995; 43: 27-32.
11. Barton H., Fołta M.: New approach to the analysis of antioxidant activity of coloured biological samples: a modifi cation of the method of DPPH radical scavenging. in “Molecular and Physiological Aspects of the Regulatory Processes of the Organism” Proceeding of the XV International Symposium of the Polish Network of Molecular and Cellular Biology UNESCO/PAN: Krakow, 1-2 June, 2006; 38-41. – 12. Singleton V.L., Rossi J.A. Jr.: Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic acid reagents. Am. J. Enol. Vitic., 1965; 16: 144-158. – 13. Benado M., Alcantara C., De la Rosa R., Ambrose M.,
Mosier K., Kern M.: Effects of various levels of dietary fructose on blood lipids of rats. Nutr. Res., 2004;
24: 565–571. – 14. Nakagawa T., Hu H., Zharikov S., Tuttle K.R., Short R.A., Glushakova O., Ouyang X.,
Feig D.I., Block E.R., Herrera-Acosta J., Patel J.M., Johnson R.J.: A causal role for uric acid in
fructose-induced metabolic syndrome. Am. J. Physiol. Renal Physiol., 2005; 290: F625–F631. Adres: 30-688 Kraków, ul. Medyczna 9.
