PRACA ORYGINALNA
FLUORESCENCYJNA HYBRYDYZACJA
IN SITU W DETEKCJI
INFEKCYJNYCH POWIKŁAŃ PRZEWLEKŁEJ STYMULACJI
SERCA – BADANIA PILOTAŻOWE
FLUORESCENT IN SITU HYBRIDIZATION IN THE DETECTION OF
INFECTIOUSCOMPLICATIONS OF PERMANENT HEARTPACING – PILOT STUDY
✎
AGNIESZKA SROKA-OLEKSIAK1, 2, MATEUSZ ULMAN3, BARBARA MAŁECKA3, 4, MAŁGORZATA BULANDA51 Zakład Mykologii Medycznej Katedry Mikrobiologii Uniwersytetu Jagiellońskiego Collegium Medicum
2 Zakład Molekularnej Mikrobiologii Medycznej Katedry Mikrobiologii Uniwersytetu Jagiellońskiego Collegium Medicum 3 Kliniczny Oddział Elektrokardiologii Krakowskiego Szpitala Specjalistycznego im. Jana Pawła II
4 Instytut Kardiologii Uniwersytetu Jagiellońskiego Collegium Medicum
5 Zakład Epidemiologii Zakażeń Katedry Mikrobiologii Uniwersytetu Jagiellońskiego Collegium Medicum
STRESZCZENIE:
Wstęp. Przewlekła stymulacja serca jest związana z ryzykiem wystąpienia w późniejszym okresie powikłań, w tym najgroźniejszego, czyli odelektrodowego zapalenia wsierdzia (ang. lead dependent infective endocarditis – LDIE). Wów-czas kluczowe jest zastosowanie odpowiedniej terapii, której istotnym etapem jest usunięcie wszystkich elementów układu stymulującego, a także jak naj-wcześniejsza identyfikacja czynnika etiologicznego, co umożliwia zastosowanie celowanej antybiotykoterapii. Obecnie stosowane metody diagnostyczne oparte na hodowli krwi charakteryzuje niska czułość i długi czas oczekiwania na wynik badania. Poszukiwane są alternatywne rozwiązania, które można by stosować w warunkach diagnostyki szpitalnej. Cel. Celem badań było określenie czułości i przydatności fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) oraz porównanie jej z metodami hodowlanymi. Materiały i metody. Badanym materiałem były próbki krwi i/lub wymazy pobrane od pacjentów z LDIE; po odpowiednim przygotowa-niu poddano je hybrydyzacji z sondami fluorescencyjnymi, charakterystycznymi dla bakterii z rodzaju Staphyloccoccus i rodziny Enterobacteriaceae. Wyniki. Re-zultaty badań oceniano za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Zastosowa-nie FISH umożliwiło identyfikację patogenów w 90% przypadków, a przy użyciu metod hodowlanych zaledwie w 30%. Wnioski. Czułość fluorescencyjnej hybry-dyzacji in situ znacznie przewyższa metody oparte na hodowli krwi. W celu kom-pleksowej identyfikacji patogenów w przyszłych badaniach należy uwzględnić sondę fluorescencyjną, specyficzną dla grzybów z rodzaju Candida.
SŁOWA KLUCZOWE: FISH, stymulacja serca, infekcyjne zapalenie wsierdzia, me-toda klasycznego posiewu
ABSTRACT:
Introduction. Permanent heart pacing is associated with the risk of later com-plications, including the most serious complication, i.e. the risk of Lead Depen-dent Infective Endocarditis (LDIE). Then, it is essential to introduce an appropriate therapy with an important stage being removal of all components of the pacing
m
Małgorzata Bulanda Zakład Epidemiologii Zakażeń
Uniwersytet Jagielloński Collegium Medicum ul. Czysta 18, 31–121 Kraków
Tel.: 12 634 25 67, Fax: 12 423 39 24 mbbuland@cyf-kr.edu.pl
Wpłynęło: 29.03.2019 Zaakceptowano: 30.04.2019 Opublikowano on-line: 17.05.2019
Cytowanie: Sroka-Oleksiak A, Ulman M, Małecka B, Bulanda M. Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ w detekcji infekcyjnych powikłań przewlekłej stymulacji serca – ba-dania pilotażowe.
Zakażenia XXI wieku 2019;2(2):71–75.
10.31350/zakazenia/2019/2/Z2019016 Copyright by MAVIPURO Polska Sp. z o.o., Warszawa, 2019. Wszystkie prawa zastrzeżone. Żadna część niniejszej publikacji nie może być powielana i rozpowszechniana w jakiejkolwiek formie i w jakikolwiek sposób bez zgody wydawcy.
72
system, and also to identify as early as possible the etiological factor allowing for the use of targeted antibiotic therapy. Current diagnostic methods based on blood culture are characterized by low sensitivity and a long waiting time for test re-sults. Alternative solutions are sought that could be implemented in hospital diagnostic conditions. Aim. The aim of the study was to determine the sensitivity and usefulness of fluorescence in situ hybridization (FISH) and to compare it with culture methods. Material and Methods. The analyzed material consisted of blood samples and/or swabs taken from patients with LDIE, which, after appropriate preparation were hybridized with fluorescent probes, specific to bacteria of the genus
Staph-ylococcus and the family of Enterobacteriaceae. Results. The results were evaluated by fluorescence microscopy. The use of FISH allowed the identification of pathogens in 90% of cases, while using culture methods only in 30%. Conclusions. The sensitivity of fluorescent in situ hybridization is much higher than methods based on the blood culture. For comprehensive identification of pathogens, a fluorescent probe specific to Candida fungi should be studied in further research.
KEY WORDS: FISH, heart pacing, infective endocarditis, culture methods
wygospodarowania przynajmniej trzech osobnych pomiesz-czeń, aby zapobiec ewentualnej kontaminacji. Alternatyw-nym rozwiązaniem może być fluorescencyjna hybrydyzacja
in situ (ang. fluorescent in situ hybridization – FISH).
Ar-gumentami przemawiającymi za zastosowaniem tej metody jako testu skriningowego jest krótki czas od przygotowania próbki do interpretacji wyników, możliwość identyfikacji bakterii bez konieczności wcześniejszej hodowli oraz izola-cji, która jest równie czasochłonną procedurą.
CEL PRACY
Celem pracy była ocena czułości i skuteczności metody fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) w wykrywaniu czynników etiologicznych infekcji będącej powikłaniem przewlekłej stymulacji serca, a także porównanie otrzyma-nych rezultatów z metodą klasycznego posiewu.
MATERIAŁY I METODY
Materiałem poddanym badaniu były wymazy z loży rozrusznika lub elektrody i/lub krew obwodowa, pobrane od pacjentów, których hospitalizowano na oddziale elektro-kardiologii Szpitala Specjalistycznego im. św. Jana Pawła II w Krakowie z powodu infekcyjnych powikłań przewlekłej stymulacji serca.
Podstawą kwalifikacji pacjentów było – oprócz klinicz-nego podejrzenia lub rozpoznania infekcji (miejscowe ce-chy zakażenia loży stymulatora, charakterystyczne zmiany w przezklatkowym lub przezprzełykowym badaniu echo-kardiograficznym) – uzyskanie świadomej, pisemnej zgody na udział w badaniach. Brak podpisanej zgody lub wycofa-nie jej na dowolnym etapie badań stanowiło podstawę wy-kluczenia próbek wyłącznie z badań molekularnych.
Rutynowym, diagnostycznym badaniem, w którym wykorzystano krew, były klasyczne metody posiewu (au-tomatyczny system do posiewów krwi BacT/ALERT)
WSTĘP
Przewlekła stymulacja jest powszechnie stosowaną me-todą leczenia arytmii serca, przebiegających ze zwolnieniem rytmu, takich jak: zespół chorego węzła zatokowego i za-awansowane bloki przedsionkowo-komorowe. Wprawdzie wszczepienie układów stymulujących skutecznie zapobiega nagłej śmierci sercowej i ma dobroczynny wpływ na jakość życia pacjenta, wiąże się jednak z możliwością wystąpie-nia w późnym okresie pooperacyjnym takich komplikacji wynikających z obecności elektrod endokawitarnych, jak przerwanie elektrody, pęknięcie przewodów metalowych lub uszkodzenie izolacji [1]. W konsekwencji rozszczelnie-nia elektrody endokawitarnej może się rozwinąć specyficz-ne i zależspecyficz-ne od elektrody infekcyjspecyficz-ne zapalenie wsierdzia, nazwane również odelektrodowym zapaleniem wsierdzia (ang. lead-dependent infectiveendocarditis – LDIE) [2]. Wszystkie infekcyjne powikłania przewlekłej stymulacji stanowią wskazanie do natychmiastowego usunięcia całego układu stymulującego i zastosowania odpowiedniej terapii antybiotykowej. Podjęcie tych kroków utrudnia niekiedy niespecyficzny i skąpoobjawowy obraz LDIE oraz trudność z zastosowaniem kryteriów rozpoznawania LDIE w prakty-ce klinicznej [3].
W leczeniu zakażeń układów stymulujących kluczowym etapem jest szybkie wykrycie oraz identyfikacja mikroor-ganizmów odpowiedzialnych za rozwój infekcji. Nierozpo-znane i/lub nieleczone zakażenia stanowią poważne zagro-żenie dla zdrowia i życia pacjenta. W diagnostyce, niestety, nadal „złotym standardem” są hodowle krwi na specjal-nych podłożach wzrostowych, charakteryzujące się niską czułością i koniecznością długiego oczekiwania na wyniki, nawet do pięciu dni [4]. Z tego powodu poszukuje się al-ternatywnych metod wykrywania drobnoustrojów. Wśród nich przodują techniki molekularne, głównie PCR. Choć czułość metody PCR jest znacznie wyższa niż klasycznych metod hodowlanych, nie jest jednak możliwe wprowa-dzenie jej do rutynowej diagnostyki we wszystkich szpi-talach, ponieważ wymaga specjalnego wyposażenia oraz
73
wykonywanego na bieżąco w Pracowni Mikrobiologii wyżej wymienionego szpitala. Po stwierdzeniu dodatniej hodowli krwi wykonywano antybiogram, który stanowił podstawę ustalenia terapii celowanej. Pozostałą krew z wszystkich pró-bek w objętości ok. 200 μl wykorzystano do przeprowadze-nia fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) w Katedrze Mikrobiologii Uniwersytetu Jagiellońskiego Collegium Me-dicum; to badanie wykonywano zbiorczo po zebraniu od-powiedniej kolekcji próbek. Procedura obejmowała wstęp-ne przygotowanie próbek (wirowanie, przepłukanie peletu, naniesienie materiału na specjalne szkiełka do hybrydyza-cji), następny etap to utrwalanie preparatów, denaturacja, po czym hybrydyzacja przy użyciu charakterystycznych dla danej grupy bakterii sond znakowanych fluorescencyjnie. Dla każdej próbki wykonano po dwa preparaty: w pierw-szym była możliwa identyfikacja bakterii z rodzaju
Sta-phylococcus (sonda STA, 5'-TCCTCCATATCTTGCGC-3',
znakowana CY3 – kolor czerwony) oraz pozostałych pato-genów Gram dodatnich lub Gram ujemnych (sonda EUB, 5’- GCTGCCTCCCGTAGGA GT-3, znakowana FITC – ko-lor żółty), a w drugim preparacie identyfikowano pałeczki z rodziny Enterobacteriaceae (sonda ENT, 5'-CTCTTTG-GTCTTGCGACG-3', znakowana CY3 – kolor czerwony) oraz jak wyżej pozostałe patogeny (sonda EUB). Szczegó-łowy opis poszczególnych etapów procedury został przed-stawiony w publikacji Gosiewskiego i współautorów [5]. Po hybrydyzacji preparaty traktowano barwnikiem DAPI (kolor niebieski) i oglądano pod mikroskopem fluore-scencyjnym Olympus BX96 przy użyciu oprogramowania CellSense (Olympus). Była wykonywana kontrola jakości badania ze szczepem wzorcowym.
WYNIKI
Badano dziesięć próbek pobranych od ośmiu pacjentów z infekcyjnymi powikłaniami stymulacji serca; stosując flu-orescencyjną hybrydyzację in situ, w dziewięciu próbkach zidentyfikowano czynnik etiologiczny, natomiast przy uży-ciu metody hodowlanej zaledwie w trzech próbkach (tab. 1). Wszystkie drobnoustroje zaobserwowane pod mikrosko-pem fluorescencyjnym należały do rodzaju Staphylococcus, a w jednej próbce (2/1) dodatkowo występowały Gram ujemne pałeczki z rodziny Enterobacteriaceae. Zgodność wyników otrzymanych metodą klasycznego posiewu i FISH odnotowano w odniesieniu do dwóch materiałów. W prób-ce oznaczonej jako 1/2 (pobranej z loży rozrusznika) uzy-skano sprzeczne rezultaty: przy użyciu metod hodowlanych stwierdzono obecność Candida parapsilosis, natomiast za pomocą metody fluorescencyjnej hybrydyzacji obecność jedynie bakterii Staphylococcus. Ze względu na brak sond fluorescencyjnych służących do wyznakowania grzybów w materiale klinicznym nie była możliwa identyfikacja tych
mikroorganizmów przy użyciu metody FISH. Przykładowe zdjęcia uzyskane z mikroskopu fluorescencyjnego przedsta-wiona na rycinie 1.
OMÓWIENIE
Rozpoznawanie i kwalifikacja infekcyjnych powikłań stymulacji wciąż jest trudnym problemem. Przykładem dylematów związanych z nazewnictwem infekcji układów stymulujących jest najnowszy dokument Europejskiego Towarzystwa Kardiologicznego, zaproponowano w nim bowiem podział na trzy rodzaje infekcji miejscowych i pięć ogólnych [6].
Pozytywny wynik hodowli krwi stanowi ważne kryte-rium rozpoznawcze i podstawę wyboru antybiotykoterapii w infekcyjnych powikłaniach przewlekłej stymulacji serca. Niestety, jak wspomniano we wstępie, metoda ta charak-teryzuje się niską czułością, umożliwia bowiem określenie patogenu jedynie w 15–20% przypadków [4]. Przyczyną tego może być wyjściowo niewielka liczba drobnoustrojów
W
Ryc. 1. Przykładowe/wybrane zdjęcia badanych próbek, z obserwacji w mikroskopie fluorescencyjnym. Czerwony kolor fluorescencji odnosi się do bakterii z rodzaju Staphylococcus i pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae, niebieska fluorescencja to pozostałości elementów morfotycznych krwi.74
we krwi [7]. Ponadto szanse na wyhodowanie czynnika etiologicznego znacznie maleją, jeśli wcześniej zastosowa-no antybiotykoterapię. Infekcyjne powikłania przewlekłej stymulacji serca przybierają różne postacie, a rozpozna-wanie LDIE jest trudne z powodu mylących objawów oraz zmiennego i nieprzewidywalnego przebiegu choroby [2, 3, 8]. LDIE dotyczy wsierdzia jam prawego serca, w związku z tym w obrazie klinicznym dominują objawy infekcji ukła-du oddechowego: kaszel, ból w klatce piersiowej, nawraca-jące zapalenie płuc o nietypowym nasileniu, prowokunawraca-jące do wczesnego zastosowania antybiotykoterapii, bez wykry-cia czynnika etiologicznego.
W tej sytuacji jest konieczne zastosowanie alternatyw-nych i przede wszystkim czułych metod umożliwiających szybszą diagnostykę. W niniejszej pracy proponowanym rozwiązaniem jest fluorescencyjna hybrydyzacja in situ. Wyniki badań pilotażowych świadczą o tym, że metoda FISH jest trzykrotnie bardziej czuła niż klasyczne posiewy. W pracach Gosiewskiego i wsp. [6] oraz Źródłowskiego i wsp. [9] analizowano przy użyciu fluorescencyjnej hybry-dyzacji in situ próbki krwi pacjentów z klinicznymi objawa-mi sepsy, rezultaty były zbliżone do prezentowanych w tym badaniu. Niewątpliwie szanse na wykrycie patogenów w ba-danych próbkach krwi zwiększa wstępna preparatyka, po-legająca na lizie erytrocytów i komórek żernych oraz na za-gęszczaniu materiału wraz z bakteriami. Ograniczeniem wynikającym z prezentowanych badań jest zastosowanie sond fluorescencyjnych specyficznych wyłącznie do identy-fikowania bakterii. Na podstawie analizy dostępnych danych literaturowych ustalono, że najczęstszą przyczyną powikłań po zastosowaniu urządzeń stymulujących są Gram dodat-nie ziarenkowce z rodzaju Staphylococcus, główdodat-nie S. aureus i S. epidermidis [3, 10, 11, 12, 13]. Bakterie te charaktery-zuje łatwa adhezja do podłoża, co stwarza dogodne warun-ki do podziału i tworzenia gęstej warstwy biofilmu na po-wierzchni elektrod. Struktura biofilmu chroni drobnoustroje przed mechanizmami układu odpornościowego, a także utrudnia ich eradykację antybiotykami i chemioterapeuty-kami. Gram ujemne pałeczki z rodziny Enterobacteriaceae
(E. faecalis, E. coli, K. pneumoniae) należą do bakterii, które
rzadko są stwierdzane w przebiegu tego typu infekcji [10, 11, 12]. Opierając się na tych informacjach, w niniejszych badaniach wykorzystano sondy fluorescencyjne umożliwia-jące identyfikację wyżej wymienionych grup. W przypadku obecności innych gatunków równie rzadko spotykanych do-datkowo wprowadzono sondę, która umożliwia wizualiza-cję każdej bakterii za pomocą emisji żółtej fluorescencji. Nie zastosowano natomiast sondy, która wykazywałaby obec-ność grzybów z rodzaju Candida, co stanowi w tym przy-padku ograniczenie badania, w przyszłości zaś konieczność uwzględnienia tego rodzaju grzybów. Mimo to uzyskane wyniki są tak interesujące, że skłaniają do dalszych badań, przede wszystkim na znacznie większej puli próbek oraz po rozszerzeniu ich o identyfikację gatunkową zarówno dla bakterii, jak i grzybów. Takie podejście mogłoby stanowić podstawę do późniejszego wprowadzenia metody fluore-scencyjnej hybrydyzacji in situ jako testu skriningowego w diagnostyce mikrobiologicznej krwi pacjentów nie tylko z powikłaniami po przewlekłej stymulacji serca, ale również w każdym przypadku, który stanowi wskazanie do wykona-nia posiewu krwi [14, 15].
WNIOSKI
1. Zastosowana metoda fluorescencyjnej hybrydyzacji
in situ charakteryzuje się znacznie wyższą
czuło-ścią niż metody klasycznego posiewu na podłożach wzrostowych.
2. Wprowadzenie metody FISH do rutynowej dia-gnostyki medycznej mogłoby zwiększyć szansę identyfikacji patogenów, a także skrócić czas ocze-kiwania na wynik badania i wprowadzenia terapii ukierunkowanej.
3. W celu kompleksowego wykrywania drobno-ustrojów w materiałach klinicznych konieczne jest uwzględnienie w przyszłych badaniach sond fluore-scencyjnych, przeznaczonych do identyfikacji grzy-bów z rodzaju Candida.
Lp. Próbki Rodzaj materiału Klasyczny posiew
(diagnostyka szpitala) FISH (UJCM) 1
2 1/11/2 krewwymaz z loży –C. parapsilosis
Staphylococcus Staphylococcus 3 4 2/1 2/2 wymaz z loży
wymaz z elektrody –– Staphylococcus, EnterobacteriaceaeStaphylococcus
5 3/1 wymaz z loży S. epidermidis Staphylococcus
6 4/1 krew – Staphylococcus
7 5/1 krew – Staphylococcus
8 6/1 krew – Staphylococcus
9 7/1 wymaz z loży S. epidermidis Staphylococcus
10 8/1 wymaz z elektrody – –
W
Tab. 1. Porównanie wyników identy-fikacji patogenów metodami: FISH i kla-sycznego posiewu.75 KONFLIKT INTERESÓW: nie zgłoszono.
Projekt uzyskał pozytywną opinię Komicji Bioetycznej UJ (KBET/1072.6120.242. 2018 z 27.09.2018 r.) oraz był finansowa-ny z Dotacji Statutowej Uniwersytetu Jagiellońskiego Collegium Medicum (K/ZDS/007827). Kierownik projektu: prof. dr hab. med. Małgorzata Bulanda.
PIŚMIENNICTWO
1. Małecka B, Lelakowski J, Szczepkowski J i wsp. Niepowodzenia przewlekłej stymulacji serca typu DDD związane z dysfunkcją elek-trody – obserwacja własna. Folia Cardiol 2004;11(3):177–187. 2. Małecka B, Kutarski A. Lead-dependent infective endocarditis: An
old problem, a new name. Cardiol J 2010;17(2):205–210.
3. Małecka B, Ząbek A. Infectious complications of electrotherapy: theory and practice. Pol Arch Med Wewn 2016;126(6):440–442. 10.20452/pamw.3439.
4. Jamal W, Tamaray G, Pazhoor A i wsp. Comparative evalu-ation of BacT/ALERT 3D and BACTEC Systems for the recovery of pathogens causing bloodstream infections. Med Prin Pract. 2006;15(3):223–227. 10.1159/000092186
5. Gosiewski T, Pietrzyk A, Brzychczy-Włoch M i wsp. Zastosowanie metod PCR i FISH w szybkiej diagnostyce bakteryjnych zakażeń krwi. Ann Acad Med Siles 2011;65(5):14–22.
6. Bongiorni MG, Burri H, Deharo JC i wsp. ESC Scientific Document Group. 2018 EHRA expert consensus statement on lead extrac-tion: recommendations on definitions, endpoints, researchtrial design, and data collection requirements for clinical scientific stu-dies and registries: endorsed by APHRS/HRS/LAHRS. Europace 2018;20(7):1217. 10.1093/europace/euy050.
7. Gosiewski T, Szała L, Pietrzyk A i wsp. Comparison of methods for isolation of bacterial and fungal DNA from human blood. Curr Mi-crobiol 2014;68(2):149–55. 10.1007/s00284-013-0451-1
8. Lelakowski J. Rozpoznawanie bakteryjnego zapalenia wsierdzia. Folia Cardiologica Excerpta 2009;4(2):78–82.
9. Źródłowski TW, Jurkiewicz-Badacz D, Sroka-Oleksiak A i wsp. Com-parison of PCR, fluorescent in situ hybridization and blood cultures for detection of bacteremia in children and adolescents during an-tibiotic therapy. Pol J Microbiol. 2018;67(4):479–486. 10.21307/ pjm-2018-056
10. Deharo J-C, Quatre A, Mancini J i wsp. Long-term outcomes follow-ing infection of cardiac implantable electronic devices: a prospective matched cohort study. Heart 2012;98(9):724–731. 10.1136/heart-jnl-2012-301627
11. Greenspon AJ, Prutkin JM, Sohail MR i wsp. Timing of the most re-cent device procedure influences the clinical outcome of lead-as-sociated endocarditis. J Am Coll of Cardiol 2012;59(7):681–687. 10.1016/j.jacc.2011.11.011
12. Margey R, McCann H, Blake G i wsp. Contemporary management of and outcomes from cardiac device related infections. Europace 2010;12(1):64–70. 10.1093/europace/eup362
13. Massoure P-L, Reuter S, Lafitte S i wsp. Pacemaker endocarditis: Clinical features and management of 60 consecutive cases. PACE 2007;30:12–19. 10.1111/j.1540-8159.2007.00574.x
14. Peters RPH, Savelkoul PHM, Simoons-Smit AM i wsp. Faster identifi-cation of pathogens in positive blood cultures by fluorescence in situ hybridization in routine practice. J Clin Microbiol 2006;44(1):119–123. 10.1128/JCM.44.1.119-123.2006
15. Kempf VAJ, Trebesius K, Autenrieth IB. Fluorescent in situ hybridiza-tion allows rapid identificahybridiza-tion of microorganisms in blood cultures. J Clin Microbiol 2000;38(2):830–838.
