Ontwerp voor een penicilline G fabriek

I

,,,'"

.

'

V

ONTVffiRP VOOR EEN PENICILLINE G-FABRIEK.

= = = = = =

=

= =

=

= = =

=

=

=

= = =

=

A. Lange jan ,

J.

W

.

Frisostraat

29,

ROTTERDAM.

,

V

infectieziekten en wordt voor dit doel in grote hoeveelheden geproduceerd. Hoewel de ontdekking van de penicilline reeds dateert van 1932, door Fleming, werd het onderzoek naar de mogelijkheid van productie op grote schaal pas in 1940 ingesteld, onder invloed van de tweede wereldoorlog.

Dit onderzoek, dat alleen dank zij bijna onbeperkte subsidie van de

regering van de Verenigde Staten mogelijk was, leidde tot de productie op

grote schaal. Het is zeer waarschijnlijk dat zonder een tweede

wereld-oorlog de penicillineproductie zelfs heden nog niet op gang gekomen zou

zijn (1).

Mogelijkheden voor penicilline-productie.

Hoewel penicilline geheel langs synthetische weg geproduceerd kan worden (39), wordt de volledige productie verkregen volgens het

fermen-tatieproces.

Het succes van een industriële fermentatie op grote schaal hangt af van een aantal factoren, zoals (17):

Ie. het vermogen van micro-organismen om hoge opbrengsten van het ge-wenste product te maken in een kort tijdsverloop uit goedkope en

gemakkelijk beschikbare grondstoffen;

2e. een eenvoudige isolatie van het verlangde product;

3e. een voldoende vraag naar het product, dat bovendien niet gemakkelijk

langs synthetische weg te maken is.

Voor een penicilline-productie op grote schaal wordt aan deze drie voorwaarden voldaan.

Vele micro-organismen, vooral schimmehvan de soort Penicillium, zijn bij een goede selectie in staat penicilline in korte tijd in goede

hoeveelheden te produceren uit eenvoudige, gemakkelijk te verkrijgen

grondstoffen zoals lactose en maisweekwater ("cornsteep liquorll

) . Bovendiel

is penicilline, ondanks zijn grote neiging tot ontleding, betrekkelijk

eenvoudig te isoleren. Deze grote neiging tot ontleding, naast een

inge-wikkelde bouw van het molecuul (gecondenseerde hetero vijf- en vierring) maken een synthetische bereiding niet eenvoudig.

Eisen voor en mogelijkheden tot een goede penicilline-productie. Penicilline wordt door vele schimmels geproduceerd, maar voor de

bereiding wordt alleen gebruikj gemaakt van Penicillium notatum en

Penicillium chrysogenum. Voor de productie van penicilline is het

-noodzakelijk de schimmel op grote schaal te kweken. Voor een goede groei van de schimmel moet aan verschillende voorwaarden voldaan worden, name-lijk aanwezigheid van voldoende voedingsstoffen en voldoende zuurstof. Bovendien mag er geen ander organisme aanwezig zijn, niet alleen door een verbruik aan voedingsstoffen maar ook omdat vele micro-organismen een enzyme produceren, penicillase, dat het aanwezige penicilline splitst. Het op grote schaal kweken van Penicillium onder steriele en aerobe omstandigheden is op verschillende manieren gerealiseerd (1) (2)

(3) (4) (22).

Oppervlakte-cultuurfermentatie.

Deze uitvoering berust op de neiging van schimmels om als dunne lagen op het oppervlak van vloeibare media te groeien. Immers aan dit oppervlak is aan de bovenzijde voldoende lucht aanwezig, aan de onder-zijde voldoende voedingsstoffen uit het vloeibare medium.

De schimmel wordt gekweekt op dunne vloeistoflagen (li - 2 cm dikte)l waarbij het medium zich in platte flessen of schalen bevindt. Na enige dagen

bebroeden wordt bf de gehele inhoud, mycelium plus cultuurvloeistof, of alleen de cultuurvloeistof verwijderd en verwerkt op penicilline.

De moeilijkheden van deze methode bij het produceren op industriele schaal zijn enorm. Niet alleen vereist deze uitvoering een zeer groot aantal vaten, veel arbeid en een relatief grote investering in gebouwen en materiaal, maar ook moeilijk te realiseren steriele voorwaarden.

Zodra de onderwater-cultuurfermentatie (llsubmergedll ) beschikbaar kwam is deze werkwijze verlaten.

Onderwater-cultuurfermentatie ("submerged").

De ontwikkeling van de onderwater-cultuurfermentatie is mogelijk geworden door de ontdekking van stammen ~ Penicillium, die in staat zijn in een vloeistof te groeien mits voldoende zuurstof en voedings-stoffen aanwezig zijn. De schimmel wordt gekweekt in een voedingsmedium dat door een roerwerk in een voortdurende beweging gehouden wordt, waar-bij steriele lucht door de vloeistof geblazen wordt. Deze methode heeft voordelen vergeleken met de oppervlakte cultuurfermentatie:

a. een betere controle van uitwendige omstandigheden; b. vermindering van benodigde arbeid en ruimte;

c. een verhoogde productiviteit; d. een vereenvoudigde zuivering.

-Bij het ontwerpen van deze penicillinefabriek zal het proces uitge-voerd worden volgens de onderwater-cultuurfermentatie daar deze vele belangrijke voordelen heeft boven de oppervlakte-cultuurfermentatie.

Bij de groei van Penicillium in eenlmedium blijkt een goede groei

van het mycelium gepaard te gaan met een hoge penicilline-productie

(6).

Een goede groei van het mycelium kan, naast de aanwezigheid van een vol-doende hoeveelheid zuurstof, verkregen worden door een juiste

samenstel-ling van het medium

(6) (1) (8) (9) (10).

Gewoonlijk wordt een medium

gebruikt bestaande uit "cornsteep solids"

1-5%,

lactose

1-3%,

calcium

carbonaat 0-1%, een plantaardige of dierlijke olie 0-1% en anorganische zouten, alles opgelost in water.

"Cornsteep solids" zijn de vaste bestanddelen van het zgn. maisweek-water (cornsteep liquor). Maisweekmaisweek-water wordt verkregen bij de bereiding van maizena uit mais en bevat in variabele verhoudingen verschillende belangrijke voedingsstoffen voor de schimmel zoals aminozure\ sacchariden, eenvoudige carbonzuren vnl. melkzuur, anorganische zouten en essentiële groeistoffen.

Lactose wordt aan het medium toegevoegd als koolstofbron. Hoewel behalve lactose andere sacchariden zijn te gebruiken, wordt lactose het meest gebruikt daar dit een grote penicilline-productie stimuleert.

Calciumcarbonaat dient om èe bij de fermentatie gevormd zuur te

neutraliseren en hierdoor mede te werken tot een juiste pH voor een goede

penicilline-productie (pH

=

1-1t).

Gewoonlijk wordt daarnaast tijdens de

fermentatie de pH automatisch op de juiste waarde gehouden.

De toevoeging van plantaardige of dierlijke oli~n dient om de

schuimvorming bij de fermentatie - door de sterke luchttoevoer neiging

tot schuimvorming - tegen te gaan~ Bovendien stimuleert het de

penicil-line-productie

(8).

Een hoge penicilline-productie kan behalve door het scheppen van

U;w

goede productie-voorwaarden ook verkregen worden door Penicillium-stam te gebruiken die veel penicilline maakt. Door selectie worden stammen

ver-kregen met gunstige eigenschappen

(34).

Naast selectie van natuurlijke

stammen worden nieuwe stammen verkregen door behandeling van de schimmel-sporen met physische en chemische mutanten-verwekkende middelen zoals ultraviolet licht, Röntgenstralen, neutronenbombardementen, warmte en

mosterdgas, colchinine (1)

(2) (20) (21) (34).

Zo produceerde de stam Penicillium notatum 832 in het begin van de onderwater-cultuurfermentatie slechts 90 eenheden per mI, tegenwpordig

-v

haalt de stam Penicillium chrysogenum Wisconsin Q 116 2000 eenheden per

mI.

De aanvankelijk gebruikte penicilline-stammen produceerden ook een

aantal gele pigmenten die moeilijkheden gaven bij de extractie en

zuivering van de penicilline. De selectie heeft nieuwe stammen opgeleverd

die geen gele pigmenten meer produceren, zodat de tussentijdse trappen

bij de extractie voor het ve~vijderen van deze pigmenten onnodig ~ge­

worden (1) (21).

Een penicilline-stam, gekweekt op een normaal medium - "cornsteep

solids", lactose, CaCO) en olie - produceert verschillende soorten

penicillinemoleculen. Deze penicillinemoleculen - penicilline X,

penicilline G, penicilline F, penicilline K - hebben alleen de kern van

het molecuul gemeenschappelijk, de gecondenseerde vier- en vijfring,

maar verschillen in de samenstelling van een zijketen aan dit ringsysteem.

Afhankelijk van de aanwezige groepen heeft het penicillinemolecuul een

zekere activiteit. Van de bekende penicillines heeft penicilline G de

beste pharmacologische eigenschappen en de grootste stabiliteit.

Boven-dien is het goedkoper te produceren. Door toevoegen van bepaalde stoffen

aan het cultuurmedium wordt de productie van penicilline G (benzy~­

penicilline) gestimuleerd (tot 91% penicilline G van totale hoeveelheid

penicilline~~8~0~~9~oJ~0~erbruik

van deze zgn. "precursors" is het

nood-zakelijk de totale hoeveelheid "precursor," in kleine hoeveelheden regelmatig toe te voegen, maar zelfs dan wordt nog 11-94% van de

toege-vpegde hoeveelheid voor andere doeleind~verbruikt dan voor de

penicilline G productie (2). Hoewel vele stoffen als precursor gebruikt kunnen worden, wordt meestal een zout van phenylazijnzuur gebruikt (26)

(31).

Na een voldoende groei van de schimmel, waarbij penicilline gevormd is, moet de penicilline afgescheiden en gezuiverd worden.

Isolatie en zuivering.

Na verwijderen van het mycelium kan op verschillende manieren de penicilline geisoleerd worden:

a.

!~ol:~~~~EE~!~~~~~~~~ (1) (2)

(3)

Bij deze methode wordt aan de heldere cultuurvloeistof geactiveerde

kool

(2-5

gew.%) toegevoegd. Door goed roeren wordt een innig contact

tussen de kool en de vloeistof verkregen, waardoor de kool de

penicil-line uit de vloeistof adsorbeert (tot ca

90%).

Na scheiden van de

\

''-../'

vloeistof en de kool, wordt de penicilline geëlueerd met waterige aceton (20% water). Hierbij wordt ca

70%

van de penicilline ~ ge~lueerd. De aceton werd geconcentr~erd door herhaalde extracties met met water niet

!-J

mengbare vloeistoffen,jdoor verdamping onder vacuum. De verdere yerwerking

van dit concentraat is geheel hetzelfde als bij de hieronder te beschrij~ vloeistofextractie-methode.

De koo1adsorptie-methode is geheel verlaten, daar hierbij lage op-brengsten (ca

40%)

verkregen werden. Het ontwerp voor deze penicilline-fabriek zal daarom geschieden volgens de v1oeistofextractie-methode.

Hierbij wordt gebruik gemaakt van het feit dat het penicilline-molecuul een carbonzuurgroep bevat. Door de cultuurvloeistof op

pH 2.0-2.5 te brengen kan de penicilline uit de cu1tuurc1oeistof ge~xtra­ heerd worden met organische oplosmiddelen, b.v. bij amy1acetaat, methyl-isobutylketon, buty1acetaat.

Na de eerste extractie wordt de penicilline verder gezuiverd, b.v. van penicilline K, door extractie van de organische laag met een buffer van pH

7-7-!

en door extractie van de bufferlaag met amy1acetaat bij pH

2-2-!.

Bij deze extractie-methode is het nodig de cultuurvloeistof aan te zuren tot pH 2.0-2.5. Penicilline is echter bij deze lage pH zeer labiel, zodat de extracties zo snel mogelijk moeten worden uitgevoerd.

Uit het verkregen concentraat kan de penicilline na drogen van de amy1acetaat met natriumsulfaat, kristallijn worden afgescheiden door toevoegen van alkali-acetaten opgelost in absolute alcohol (39). Deze laatste stap verloopt op laboratorium-grootte onder streng steriele om-standigheden.

Om

deze reden is dit laatste gedeelte weggelaten uit het schema.

Ontwerp voor de fabriek. Productie.

Hoewel de penicillineproductie van de Verenigde Staten (de grootste

producent) sinds 1953 ongeveer constant is gebleven, is de

wereldproduc-tie blijven toenemen daar vele landen in hun eigen penicilline behoef te zijn gaan voorzien en hierdoor de penicilline niet meer importeren (20).

Een rendabele fabriek van middelbare grootte, productie ongeveer

20.000 kg. per jaar, produceert echter nog zoveel dat hij ook is

aange-wezen op export.

-\

...,

I

Plaats van de fabriek.

Een penicilline-fabriek, behorend tot het type van de extractie-bedrijven, is betrekkelijk onafhankelijk van de plaats. Het eindproduct kan door zijn relatief geringe hoeveelheid goedkoop getransporteerd

worden. Voor de grondstoffen, voornamelijk lactose en "cornsteep solids", is echter de aanwezigheid van melkverwerkende en maisverwerkende

industrie~n op niet al te grote afstand noodzakelijk. Hoewel deze stoffen in enkele procenten aan het medium worden toegevoegd, is hun totale

hoeveelheid relatief groot (per fermentatie gang 250 kg "cornsteep solids" en 250 kg. lactose).

De voornaamste factoren voor de plaats van de fabriek zijn de aan-wezigheid van voldoende zuiver water (voor cultuurmedium) en de mogelijk-heid om·· het afvalwater te kunnen lozen. Eventueel moet ook het afge-werkte mycelium geloosd kunnen worden, hoewel dit enigszins lonend ver-werkt kan worden op droge stof, waarna het toegevoegd kan worden aan veevoeder.

Keuze en constructie van de apparatuur. Fermentatieketels.

Bij de voorgenomen productie van 20.000 kg penicilline (als Na-penicillaat) per jaar is 350 m3 ketelruimte nodig voor de fermentatie.

(Berekend op een zesdaagse fermentatie-gang). De grootte van de ketels waarin in het algemeen fermentaties worden uitgevoerd variëren van 5000 tot 200.000 gallons (U.S. gallons)

d~.

van 75 - 75.000 m3 • Hoewel de

,~

penicilline-fermentaties tot op zekere hoogte door de aanwezigheid van penicilline zelfbeschermend zijn tegen infectie door andere

micro-organismen, is het wenselijk niet al te grote ketels te gebruiken. Hoewel de productie per volume-eenheid een kleine stijging vertoont, naarmate de ketelinhoud stijgt, zijn de verliezen bij een eventuele infectie, waarbij de ketelinhoud in enkele uren geheel waardeloos kan worden, niet zo groot.

De fermentatieketels in het schema, vier in getal, hebben een volume van rond 90 m

3

d.i. 24.000 gallen, waarbij zij tijdens de fermentatie voor

80%

gevuld zijn met vloeistof. Teneinde een goede beluchting te ver-krijgen, worden de ketels relatief hoog uitgevoerd, verhouding ie

2.5

hoogte-diameter.is

2.5-De fermentatieketels worden gemaakt van koolstofstaal of roestvrij-staal, waarbij in de constructie dode hoeken zoveel mogelijk worden ver-meden. De ketel is voorzien van een luchtinblaas-systeem, een roerder en een koelspiraal.

-Door de luchtinblaasinstallatie, die bestaat uit een cirkelvormige pijp, wordt de voor de fermentatie benodigde lucht door het medium ge-blazen.

De roerder dient niet alleen voor het in beweging houden van de

inhoud van de fermentatieketel en de hiermede gepaard gaande hetere

temperatuurregulatie, maar ook om de lucht zo goed mogelijk in het medium

te verdelen. ~ wordt slechts enkele procenten van de aanwezige

zuur-stof opgenomen (25). De penicilline-productie is sterk afhankelijk van de

hoeveelheid ingeblazen lucht en de wàjze waarop geroerd wordt

(6) (7) (9)

(10) •

Bij iedere fermentatieketel, afhankelijk van constructie en

afmetingen, behoort een meest effectieve roersnelheid, een meest effec-tieve luchtsnelheid en een bepaalde luchthoeveelheid. Behalve door het

toeren wordt een gedeelte van de benodigde roerenergie verkregen uit de

ingeblazen lucht

(38).

Voor deze fermentatieketels bedraagt de

lucht-hoeveelheid 0,2 m3/sec. bij circa 90 omwentelingen per minuut (24).

De koelspiraal, die aan de buitenzijde op de ketel is gelast, dient

'\{ om de bij de fermentatie vrijkomende warmte, soms oplopend tot

\ t 3

t\ '\

20 B TU/ga 1 1 on/uur d.i.

67,5

kCcU/hv/m (a) ,af te voeren.

\~' \f~

Bij de fermentatie wordt de meeste warmte echter afgevoerd door de

\ ) ' doorgeblazen lucht. De warmte die bij de fermentatie vrijkomt moe:b

afge-\\.~

_}i

_\'W'\:

':/

\ _{voerd worden daar anders de temperatuur zo hoog kan oplopen dat afsterven}

\~~. ~.

van de schimmel optreedt.

'~ .

\}

r-f' ~'

\ _{Sterilisatieketels.}

Voor het inbrengen van de schimmelreincultuur in het cultuurmedium moeten eerst alle aanwezige micro-organismen gedood worden (steriliseren).

Het cultuurmedium, samenstelling "cornsteep solids"

3,5%,

lactose

3,5%,

calcium carbonaat

1%,

monokaliumphosphaat 0,4%, maisolie 0,25%,

wordt gesteriliseerd in aparte sterilisatieketels.

De sterilisatie van het medium is een race tussen de steriliteit van de ketellading, de begeleidende ontleding van de eiwitten en het ontstaan van giftige bestanddelen. De sterilisatie is een compromis tussen de

verkregen

steriliteit~de

thermische ontleding van de grondstoffen

(19),

(20).

In deze sterilisatieketels, twee in getal van 45 m3 , wordt het medium gesteriliseerd door stoom inblazen, waarbij de temperatuur wordt opgevoerd

tot 1200 C en daarna gedurende 30 minuten hierop gehouden.

Om de sterilisatietijd zo kort mogelijk te houden wordt de

sterilisatieketel verwarmd door stoom inblazen en wordt na steriliseren

-de temperatuur snel omlaag gebracht door koelen. Voor -de eerste zaai tanks is een speciale sterilisatieketel aanwezig, daar de hoofdfermentatieketels te groot zijn voor de eerste zaaitank.

Zaai tanks.

Bij het begin van de fermentatie moet een hoeveelheid van de gewenste schimmel in het medium gebracht worden, het zgn. enten, om hieruit een groei van de schimmel te verkrijgen.

Daar een enting met een kleine hoeveelheid entmateriaal, b.v. 1%,

minder geschikt is, wordt met een grotere hoeveelheid ge~nt, b.v. 10% van

volume. Bij een kleine ent bestaat de kans dat het medium ge!nfecteerd wordt voordat een goede groei van de gewenste schimmel is opgetreden. Hierdoor krijgt dit vreemde organisme een veel grotere kans om zich te ontwikkelen, een kans die bij een grote enting veel kleiner is. Om deze

reden wordt de fer~entatieketel gegnt uit een zgn. zaai tank , die ongeveer

IJ.:}

10%

van het volumefermentatieketel heeft. Indien de zaaitank een te

grote inhoud heeft om direct vanuit een laboratoriumcultuur van enige tientallen liters geênt te worden, wordt nog een zaaitank voorgeschakeld.

De inhoud van het gebruikte ketels, 90 m3 , is zodanig dat een tweede en

een eerste zaaitank noodzakelijk zijn van resp. 7,6 m3 en 0,7 m3• Deze

ketels zijn op dezelfde wijze uitgevoerd als de grote fermentatieketels. Na enten wordt de schimmel in een eerste fermentatie ongeveer twee dagen gekweekt, daarna na overenten nog twee dagen in de tweede zaaitank. Voor

de vier fermentatieketels, 6 dagen per fermentatiegang, zijn twee tweede

zaai tanks en twee eerste zaai tanks nodig.

Luchtfilters.

Bij de aerobe fermentatie, zoals deze optreedt bij de penicilline-fermentatie, zijn grote hoeveelheden steriele lucht nodig. Deze steriele lucht is te verkrijgen door bestraling met ultraviolet licht (13), door electrostatische precipitatie (14), door filtraties door kolommen met

poreuse media zoals glaswol, katoenvezels en geactiveerde kool (12)

(15)

(16)

(17)

en door wassen met desinfecterende middelen

(19)

(20). Een

chemische behandeling is meestal niet toepasbaar daar er steeds kleine hoeveelheden desinfectans in de fermentatievloeistof terecht komen met alle gevolgen daarvan.

Als andere methoden voor luchtsterilisatie worden ook gebruikt

sterke verhitting van de lucht tot 3500 - 5000

c

~ door verwarmen in

een buizensysteem of door sterke compressie in een compressor (11). De toepassing

-11

De toepassing van warmte voor een grote schaal productie is echter

oneconomisch, zodat van de genoemde methoden alleen de filtratie door

poreuse media wordt toegepast.

Van de poreuse media worden vooral glaswol en slakkenwol toegepast.

Naast een grote efficiency bij een geringe laagdikte

malen gesteriliseerd worden met stoom (120

---

0 estoom)

ciency daalt (12) (15) (16) (17) (35) (36).

kunnen zij herhaalde zonder dat de

effi-Met deze vezelfilter-materialen kan nooit een absolute steriliteit

bereikt worden, daar de openingen tussen de vezels steegs groter zijn dan de organismen. Het steriliserende karakter van deze vezelfilters be-rust op het vasthouden van de microorganismen en naarmate het aantal botsingen tussen het microorganisme en de vezel stijgt, stijgt ook de efficiency.

Deze efficiency van de glaswolfilters zal sterk afhankelijk zijn van

de diameter van de vezels - meest efficient bij diameter van beneden 6 micron (12) (15) -, van de dichtheid van de opeengepakte vezels (15) en van de snelheid van de doorstromende lucht. Bij toenemende stroomsnelheden treedt eerst een daling van de efficiency op, maar daarna stijgt de ef-ficiency snel tot hoge waarden (16) (17) (35) (36).

Glaswolvezels hebben echter het nadeel dat zij bij herhaalde sterili-satie neiging tot kanaalvorming vertonen. Door toevoeging van een klein percentage kunststoffen, b.v. polyaethyleen, worden de vezels vastgelegd, zodat dit bezwaar is opgeheven (17) (35) (36).

Bij de luchtfilters in het schema is een luchtsnelheid van ~ ~[~~

genomen, bij een filterdikte van 1 cm, waarbij zij ieder aan de zijkanten over 10 cm zijn ingeklemd.

Bij het inblazen van de lucht wordt in de ketel een overdruk gehand-haafd. Hierdoor wordt een beter oplossen van de zuurstof in het medium verkregen en wordt infectie van buitenaf tegengegaan.

Overdrukfilter.

Voorafgaande aan de penicilline-extractie wordt het mycelium ge-scheiden van de cultuurvloeistof. Deze bewerking dient ook onder steriele

~

~~.omstandigheden te geschieden. Voor deze bewerking werd een overdrukfilter

(( gekozen (33). Hierbij is naast voldoende drukval over het filter, weinig

/\

~

kans op infectie daar de filtratie verloopt in een afgesloten ruimte en

eventuele lekken alleen naar buiten lekken. Hoewel ~~n groot filter zeker

mogelijk is, is het beter twee kleinere filters te nemen daar de

cultuur-vloeistof zo snel mogelijk verder verwerkt moet worden. Blijft de

la

-cultuurvloeistof zonder luchttoevoer na beëindigen van de fermentatie lang staan dan bestaat de kans dat de cultuurvloeistof waardeloos wordt door lysis van de schimmel. Valt één van de filters uit dan kan de

vloeistof, zij het met verminderde snelheid, toch verder verwerkt worden.

Warmtewisselaar.

Om ontleding van de penicilline tegen te gaan, - de oplossing is nu

~~

minder stabiel daar het mycelium verdwenen is, - moet de cultuurvloeistof

i,\.;<t"- 1, zo snel mogelijk afgekoeld worden tot __ ~~~~~ Om de lage temperatuur te

~

handhaven

i~

l

de

o~slagtank

na de warmtewisselaar

~~i~ole!rd~

7

'::--\

r 'A C)

.l

LtlC

v-

~

'

,

"v

~

/IA

0

,1

-[l.~

~ pA V' / \vv ~M 'v'- 'w J..jvJ tI" I V'U_

g

GI'

-I

'

~!!E~~!!~=~~~~E~!~~E'

/

Bij de extractie van de penicilline uit de cultuurvloeistof wordt de cultuurvloeistof na aan zuren tot pH=2.0 gemengd met amylacetaat. Na goede menging worden de vloeistoffen weer gescheiden. De amylacetaat wordt daar-na eerst geëxtraheerd met een buffer met pH=?, vervolgens wordt dese

buffer geëxtraheerd met amylacetaat bij pH=2.0. Bij deze extractie biedt de scheiding van de cultuurvloeistof en de amylacetaat na de menging moeilijkheden daar de ontstane emulsie moeilijk te scheiden is ondanks de

gebruikte hoogtoerental-centrifuge. Door deze moeilijke scheiding van de

emulsie blijft de penicilline lang bij pH=2, waarbij de stabiliteit zeer gering is. Door gebruik te maken van de zgn. Podbielniak

extractie-apparaten wordt deze moeilijkheid ondervangen daar hier een scheiding

wordt verkregen voordat emulsievorming optreedt.

Voor de eerste trap worden twee extractie-apparaten gebruikt, die

\,', continue werken, voor de tweede en derde extractie is ieder één

extractie-"

'-~ apparaat nodig, dat niet continu werkt.

De beide tussentijdse opslagvaten zijn goed geisoleerd om de vloei-stoffen bij lage temperatuur te bewaren om ontleding te voorkomen.

?.

~

È)

het voorkomen van emulsievorming duun de extractie kort,

onge-veer

25

sec verblijf tijd in het apparaat, tegen enige minuten bij

ge-scheiden mengvaten en scheidingscentrifuges, waardoor de ontleding van de

-~

penicilline sterk verminderd wordt. \ /' "

y '

Bedrijven van de fabriek.

Bij de fermentatie wordt de fabriek bedrevep op de beschreven wijze,

waarbij de fermentatie verloopt bij

24-26

0 C. Na iedere fermentatiegang

wordt de gebruikte apparatuur, de ketels, de leidingen en de luchtfilters gesteriliseerd met stoom. Van de andere apparatuur wordt de overdrukfilter,

-de warmte-wisselaar en -de opslagketel na ie-der gebruik gesteriliseerd met stoom. Bij de Podbielniak-extractie-apparaten wordt slechts weinig

sterilisatie toegepast daar in deze apparaten weinig infectie optreedt door de aanwezigheid van het amylacetaat.

IB~;e;eninge~

l

naar

aanleiding van een Podbielniak-extractie-apparaat.

De Podbielniak extractie-apparaten worden in het schema toegepast bij de extractie en de zuivering van de penicilline G. Deze Podbielniak extractie-apparaten werken als een schotelkolom waarin het raffinaat en het extract in tegenstroom ten opzichte van elkaar bewegen. Het is

moge-lijk om bij gegeven werkomstandigheden te berekenen met hoeveel

theoretische schotels in een tegenstroom-extractie, het Podbielniak extractie-apparaat overeenkomt.

Berekening van het aantal theoretische schotels voor de extractie van de

cultuurvloeistof.

Bij deze extractie wordt gebruik gemaakt van het systeem

amylacetaat-water. Zowel de oplosbaarheid van het amylacetaat in water als van water in amylacetaat zijn gering, beide 2 gram per liter. Deze

hoeveelheid is zo gering dat de beide phasen bij benadering als volkomen

onmengbaar beschouwd kunnen worden. Bovendien wordt als

extractievloei-nJ.et

stof watervrij amylacetaat gebruikt, maar het evenwichtsmengsel van amylacetaat en water, zoals dit teruggewonnen wordt na extractie.

Op iedere schotel wordt evenwicht verondersteld tussen de beide phasen op de schotel. De penicaline-oplossing in het amylacetaat en het

~ cultuurmedium is zeer verdund, zodat de verdelingswet van Nernst als

geldend mag worden aangenomen; in cultuurmedium 1.2 gram penicilline/

~ liter. De grootte van de verdelingsco~fficient is ~~;an de pH.

Penicilline is een zwak zuur, zodat, afhankelijk van de pH, de hoeveel-heid ongedissocieerd zuur van de pH in de waterlaag verandert. (In het

amylacetaat lost alleen ongedissocieerd zuur

op).

De pK waarde penicilline G bedraagt

2.74.

De verdelingscoëfficient Do voor ongedissocieerd penicilline

be-draagt 20, zodat bij iedere pH de verdelingscoëfficient D (nu verhouding

concentratie penicilline in amylacetaat en totale hoeveelheid gedissocieerd en niet-gedissocieerd penicilline

cultuurvloeistof) berekend kan worden.

Voor pH

=

2 geldt:

=

, Ho pen. pen. pen'

=

0.182 pen. pen' pen penicilline in

=

0.182 - De

-- 12 --

•

De totale hoeveelheid penicilline in het cultuurmedium is

pen + pen'

=

1,182 pen.

20

De verdelingsco~fficient D

=

--1~.~lr82-

₌

17

(1) •

Voor een stapsgewijze berekening van de adsorptietoren is het nodig

naast deze verdelingsco~fficient, die een verband geeft tussen de phasen

op de schotel, een verband te weten tussen stromen die de schotel

ver-f _

-laten. Uit het evenwicht op de schotel zijn, daar de stromen die de schotel verlaten dezelfde samenstelling hebben als de overeenkomstige phasen op de schotel, de stromen die de schotel verlaten bekend in samenT stelling. i

I

j -

---

1

schotel n

J

..

j

E

-n

I

n+l Uit (2) Y _m

=

Rm-l _E m x m-l

Bij beschouwen van het gedeelte van de

kolom tussen de stippellijnen is voor

penicilline de volgende materiaal-balans op te stellen:

EmYm + Rnxn = En+l Yn+l + Rm_l xm_l (2)

E en R zijn volumina van resp. de

extractiephase (amylacetaat) en

de raffinaatphase (cultuur-medium)

x en y zijn aantal Eenheden penicilline per volume-eenheid voor resp.

raffinaat en de extractphase.

In formule (2) is y 1

=

0, daar het

n+

binnenkomende schone amylacetaat geen

penicilline bevat. Ru E m x n

De beide vloeistoffen, amylacetaat en water, zijn bij benadering

volkomen onmengbaar verondersteld, zodat de vloeistofstromen door de

gehele kolom gelijk blijven, zodat

Uit (3)

R R

m-l n

o

=

E

=

~ = verhouding water - amylacetaat.

m m

y _m

=

0 x _m-1 Ox _n

In vergelijking (4) is het verband tussen de vloeistofstroom die de schotel verlaat en de stroom die op de schotel komt gegeven,

Uit (1 ) Uit (4) en

Ym

=

D _.i5 x _m (5)

(5) is de gehele kolom te berekenen.

-'--../)

- 13 -

\'w t~

~~,

J;\\'

1

i

~

)

~

\jtA. ~v

\,

Bij de extractie (eerste trap) wordt 95-100% van de aanwezige

penicilline uit het cul tuurmedilun geëxtraheerd. Daar de hoeveelheid

penicilline in een oplossing moeilijk nauwkeurig te bepalen is, is het

moeilijk de resterende hoeveelheid penicilline in de waterphase te

be-palen, maar gemiddeld kan

97t.%

genomen worden.

Het fdbielniak extractie-apparaat werkt het meest efficient bij een

water-amylacetaat verhouding

va~

~

waarbij

rond 360

gallon~per

uur

ver-werkt kunnen worden.

Bij berekening van het aantal theoretische schotels onder aanname

van 0

=

5 en x

=

0.025 x 2000

=

50 units/mI, blijkt het Podbielniak

n

extractie-apparaat overeen te komen met 3 theoretische schotels (zie

figuur 1).

De werking van een Podbielniak extractor komt overeen met een

schotelkolom met drie theoretische schotels. De verhouding

cultuurvloei-stof - amylacetaat bepaalt de hoeveelheid penicilline, die in de

cultuur-vloeistof na extractie achterblijft. Naarmate de verhouding amylacetaat

water wordt opgevoerd daalt weliswaar de achtergebleven hoeveelheid

penicilline, maar ook moet deze vergrote hoeveelheid amylacetaat door

destilleren weer gezuiverd worden, waarna het weer te gebruiken is in

het proces. Bij deze destillatie gaat'lsteeds circa 2% van de hoeveelheid

amylacetaat verloren.

Het verlies aan penicilline neemt af bij een stijgend verlies aan

amylacetaat.

Er is een hoeveelheid waarbij de som van deze beide verliezen

, :'

i\,l.(:\

hoeveelheid am lacetaat.

Het Podbielniak extractie-apparaat kon hierbij beschouwd worden als een tegenstroom schotelkolom met drie schotels.

R o 1

i

I

!---""---,----t

I

2

I

1:

3 - - - .- - 1

1

-t

4

t

14

-Volgens (4) geldt Yl = Ox: OX 3 0 (6 ) Y2

=

OX 1 Ox:3 Y₃

=

Ox: 2 Ox:3 (8) Volgens (5) geldt Yl ... Doxl Y2 - Dox2 (10 ) Y 3

=

Dox3

(11)

Uit (6) (7) (8) (9) (10) en (n) : 03 1)7 x ₀ 0 x 3 = 03 02 D _{+ - - +}

-

₊ 0 D2 D (12)

(12) geeft een verband tussen de resterende hoeveelheid penicilline in de cultuurvloeistof x

3

en de verhouding cultuurvloeistof - amylacetaat.

De cultuurvloeistof bevat 2000 eenheden per mI., d.i. x •

o

Wordt voor verschillende verhoudingen cultuurvloeistof - amylacetaat

x berekend, dan worden de volgende

n

o

3 4

5

6

7 x n 9.1 20.0

36.3

57.8

82.7

waarden gevonden:

achtergeblev~arde~ aan penicilline

per li.ter cultuurvloeistof

10.1 x 10-2

22.2 x 10-2

40.3 x 10-2

64.2

x 10-

2

91.8 x 10-2

Uit deze waarden, eenheden per mI, kan de waarde, uitgedrukt in

dollarcenten, van de achtergebleven penicilline berekend worden (zie

tabel). Als prijs voor de penicilline werd de gemiddelde prijs in 1954

genomen, nl. 1,11 dollarcent/l0

5

eenheden. Per liter cultuurvloeistof is

een van 0 afhankelijke hoeveelheid amylacetaat nodig. Voor de berekening

van de hoeveelheid bij terugwinnen verloren gaand amylacetaat werd 2%

.... 15

-van de totale hoeveelheid genomen. Voor de prijs van amylacetaat werd

50 dollarcent per liter genomen.

o

3 4 5 6 7 hoeveelheid amylac. per liter

cultuur-vloeistof 0.333 0.250 0.200 0.167 0.143

verlies (1) amylac. waarde van verlief

per liter cultuur- amylac.

vloeistof 0.0067 33.5 x 10-2 0.0050 25·0 x 10-2 0.0040 20.0 x 10-2 0.0033 16.5 x 10-2 0.0028 14.0 x 10-2

Worden de waarden van de bovenstaande tabellen in een grafiek

uitgezet1 dan ligt het snijpunt bij een cultuurvloeistof - amylacetaat

verhouding van

4,

1.

Deze waarde is lager dan de algemeen gebruikte verhouding van vijf,

maar bij de bovenstaande berekening zijn enkele factoren buiten

be-schouw~ing gelaten. Zo is ook de verwijdering van verontreinigingen bijv.

penicilline, afhankelijk van de gebruikte hoeveelheid amylacetaat. Die '

factoren kunnen zo belangrijk zijn dat het voordelen biedt niet de meest economische cultuurvloeistof - vreter verhouding te gebruiken.

\.j

2. Kirk-Othmer

1.

Perlman, D.

i.

Johnson, M.J.

i.

Warner, F.E., Cook A.M.,

Train, D.

6. Brown, W.E., Peterson, W.R.

1.

Barthomo1en, W.R., Karow, E.O.,

Sfab, M.R. 8. Goldschmidt, M.C., KoffIer, R.

.2..

Calam, C. T. , Driver, N., Bowers, R.R. 10. Robinson, G.N. 11. Stark, W.R., Pohler, G.M. 12. Parker, A., Cherry, G.B.

13. Mellors, R.

!i.

Munden, D.L.

12..

Cherry, G.B., Mc.Cann, E.P., Parker, A.

16. Sykes, G.

11.

Rumphrey, Gaden, E.L.

18. Per1man, D., Tempel, A.E.,

12·

idem Brown, W.E.

20. Beesch, S.C., Shrill, G.M. 21. Pfeifer~ V.F., Vojnovich, C. 22. 23.

M·

.?2.

26.

ll·

28. ~. 30. Sainclivier, M. Perlman,

D.,

O'Brien, E.

Wegrich, O.G., Shurter, R.A. Finn, R.K •

Tabenkin, B., Lehr, R.,

Wayman, A., Go1dberg, M.W. Anderson, R.F.

Singh, K., Johnson, M.J.

Behrens, P .K.,

- Encyc10pedia of Chem.Techn., deel 9·

L!

- Botan. Rev. ~ (1950) 449.

- Ann. N.Y. Acad. Sci. 48 (1946) 51.

- Chem. and Ind~(1954) 114.

- Ind. and Eng. Chem. ~ (1950) 1169.

- Ind. and Eng. Chem. ~ (1950),1801,1810

- Ind. and Eng. Chem. 42 (1950) 1819

- J. Appl. Chem.

1

(1951) 209 •

- Chem. and Ind. (1955) 194.

- Ind. and Eng. Chem. 42 (1950) 1789. - Chem. and Ind. (1950) 806.

- J. Appl. Chem. ~ (1952) 68.

- J. App1. Chem. ~ (1952) 65.

- J. Appl. Chem.

1

(1951) S 103. - Chem. and Ind. (1954) 303.

- Ind. and Eng. Chem.

11

(1955) 924.

- Ind. and Eng. Chem. ~ (1953) 1961.

- Ind. and Eng. Chem. ~ (1953) 1958.

- Ind. and Eng. Chem.

11

(1955) 1869.

- Ind. and Eng. Chem.

Ai

(1952) 1940.

- Bu11.Scientif. de Bretagne xxv (1950)33

- Arch.Biochim.Biophys.

2l

(1954) 266.

- Ind. and Eng. Chem. ~ (1953) 1153.

- Bact. Rev. 18 (1954) 254.

- Arch.Biochim.Biophys. 38 (1952) 43.

Ind. and Eng. Chem. ~ (1953) 768.

- J. Bact. ~ (1948) 339.

- J.Biol.Chem.

112

(1948) 165·

- J. Bact.

21

(1941) 329·

31- Mortimer, D.C., Johnson, M.J. - J.Am.Chem.Soc.

1!

(1952) 4098.

R·

Arnstein, H.R.V., Grant, P.T. - Biochem.J.

22

(1953) v.

33. Nickolaus,

N.,

Dahlstrom, D.A. - Chem. Eng. Progress

2S

(1956) 81 M.

ll·

Raper, K.B. - Ann. N.Y. Acad. Sci. 48 (1946) 41.

li·

Maxon, W.D., Gaden, E.L. - Ind. and Eng. Chem. 48 (1956) 2177.

.Ji.

Gaden, E.L., Rumphrey, A.E. - Ind. and Eng. Chem. 48 (1956) 2172 •

li'

- Oostenrijks patent 174.153 (10-3-1953).

38. 01dshue, J.Y. - Ind. and Eng. Chem. 48 (1956) 2194.

te

8

.r o ~

o

o

cr-I

-Q,

1

t

0 ... o o ~

_,

,'tt

!WIt+;+-,

+f'TIH:H tg±! f;iFttt .I++fl 1iI U I: t!W 111:: I11 U

.. f1l111 ISt! .L· ~j.ll!+l ,P± ,.L';J:!:+'lITT:!t: f f.t Ç1IIIJ. J

iHIt! i1+ h=tlhi!-tE tri' " t ; f.it:-Wi :;.;: I f+! ~ ic! .• ,r-t ' . " , ..

1111 I :.;t: ';F 411 :+11 c:.: t;t:~;i' I H , o l i ! ~ Tr;:;

·I~H-,h·rr'+++, " " . ' . 'I ""'1":-1 Illj'l r:·"--'

"'+'

tt-t+t-t~: -t+--î-,Î - t~ ~

:::1

~:::I::: . .I11i ~ ~- =t~~ ±r

I+tS-:a:s;[ ", '"1' .• , . . . .,. ,i,· ~ ':l TC:>: 'C:l-TT • 'Itt , •. 'Ij:r' "-1

~--!-:l: .. ,- '-'-- -.- -,-- -':;,.--:::~ -1i:t :::_~ ql~~ 1- -+- - .;::-:-.

HTi++t+ + , . . , - + c . '1' ':t:;. ,T+- ': :;U:: ... , iU' I I 1:

i

f H · j::; -L..h-f... f.-..-..I

-t~. '~1_~: :i±t±±±i-'J~ tt!J tl-l H .. -!=ELr ;~: .' .

I·..,....,. ~_ .. ~;r .. h 'r' .. , ',,'I·.,c.., Ff:;ürt il h ' ' ' ' .. ~" , . . .

~ • ., .... j:-S!±fTI::n ::r=1ITt JJ' Li 1 ::0 ~::-c;.

~f

;

# ,t;±t:;: ::., . ..,. .+;. ..tllt!;:lt ~ . : ~L:i!i I~! : ;T~ w.::)i. . ' . ' ffl :: :.: I ::rfE.+. . "-1r:t=:r+. 1';:::;::;:

;fi+ '~~: I.:fri:l-'.;:.r:; ., rr-rh !T'-rr Tt:;::j I t;:t~Il:tr ""! 1 n i t U: • 'f~ tt· f+L1+n-'1 ;-;:-: "::1=

-Wt H- ~~f-~, " e-+- ~~~:-t!tttt -l~t: -~rtt:i- H::-~: ~ -l.i.~ltl-~!",. i~ =r::r.

. . .. f ... ltqll-I:;.:!;·' T' , .. , rrlTrl:.tH;:t+t!Hl .... \'111

t i ' · '

rEl]' 'I rIT',

I'" ;;;.;

r-..

t:::t-1J::ttllltl:f:Hlr J=!~ jicWtrt:";::[ :'d ;iE E-nl;:j! 1::!tliJrl fT!! ll- ij i Ui 11 il ,!I :1 dM rii di jt+ll::-t-';:

"1' ,,,'

:m

'I"

'1" 'j"

;hrlin

_{i ",.} ,L, , .. , I'"

,I

I" ", " jl'· , .. , "'I+t'~~1'mHff:1'

TT -t -hr' ~ t-t- 1- l t - · ;..';-! ' T! 1: n 1111 1 tlll ' t ' 1 !!' I! j~. ' 1 T ' , •• Tt d r-t· -< :-:r:r

:_L:~ILq: ;1-;L:+ n:-i+!;, 1:1- :q ;"'1 ::'r ):!I 11 11 : ! '; 11 I;: 1-1:: .:;: ~~ .... t -I .--:~):

[:ri_. '~ l' ~. ~.~·L :'~f ,:::1-_{,.-- • . • . ;} j'" ::h-f+:H: _.! "11 _l W' !JlI!~H 1"1 :: i

dil'

11:;

'ifl ' ..

lilt 1 ;·1' 111 j" 11 ; l.tl I " -1 'I' Ii I; 11111 ' I .... ::: II;~ I;:; : .. '"

hffltt

t..

ffiIfflf

..

j III • I T I . , • p 'I;: " t ' . '. I T ' " •• f-:-.-: ' " f ' ~ -I .- -~

W' c:- olW-jl±:; 'q ',I" "ti I ., '''I 'lr! ','1' '''I ,i! " I L r , ' li 11" " .. '.j .... 1 "

;lf' cr Fj':;:Il:;:; ~i-1 ,iC;-: ~:T l:±! Hrlit!' lil! ;1: Ili 17 It. 1 H r+ J.b: '::::: :';i:l::'i

'T'l

~t "'··ll·~ ~JÊ~ ' T ' . -,-,;.cj

1"1

nu .

'I' I " I 'i' 1111 j' ,

ij ffr·'·"

TIl· ,]', ~

" . rt',. 'I:t +1 cu' .... 1'·'[" "1 'ij' '" ti .. , I • , . . " , . " L'

Lg- -' ._,Jr , .. :-_;.:.. 4-:: ::_:; I:: ;:1· i:,. :;1 lil .J .-. t j: :.:: :.~ ;1" :11:.. . +-1

'I"" Te,+" ' .. _t~j~·t ti _{1#' , ,,,}

'I

_{Hl I' , ' , " , " "}

11' rT, 1I 11 ,., '" IT1'

"!' ,.. '

, lL: I ; " T I ' ' ' ; ' ' I ' "I , I .. " "," , I IJ-I· '1 i·' I 1 I' I'" t 'i i,' ,.

ril; r; ~·t:!·1;: :.+ ~i'~, ' ! : , ! ! ,. l\: ~ !! ': ;! I ! ' . 11 : + 1 : I::!: r -r:. =: ::=

ll~: H I I:;

!

t: I ~; Ll i! I i i : i : i ::!: ;: 11: ~ 1 i i ,: I .j I· 11 ! fT 1~;I'';:J;lTT f:T:

::=tttt

i j , / -.-1 :;-:- .:~"; .• ~l rti=t"~ ·,I~ ,'-I. ·1 I , ' Ij 1 [I I . Ij l;j- H ' :-m-:-H-. ~mi W;'I'~!i~ltiFW ~ ..

ti-l·!

r

Î- ;"1 ::1; :i

!nllil

l 111 i 11jl IL

II!

Ir:lr:":l'·j'ri'7+:

:C" .. 1",,71 ... ;; "'1 'I "I,i-' .. !-'- t" 1I1 I I TI [,+ i" .. rl" c . . . t,+:~,,, i r " IIJI .!~ " ' t - - ! , - I ,,-t·- - 1 - , 1 . -11- 11 I . , -~T 1-

t-+--lit

+H-utrntm idtlLd ;1:l.11;i01~ijl, Irft'}f '::1l1!llf!Ji

f!

:tIl I LlU

t·'!V·j

rltilt::!IH ~.!

_+ ~~h=i _;t!-_,r. ' I " -tt_l- I l~tJ- .,1, -H t· , 1 - I I ~ 1 ' I "IlH- ~Lt·W· 1--+ ~:L

Htl-tli++++ilrrl' , ,'·L".:1 "" I',r rnr~: "1 r:::::

HU'

I

'Lj ,'Hl rn ~rlfrrlti:," .~ ..

n 'ltP~p::j:ftl:++lÊl':rt :'11 tlt.J :ti] ~i t:' lil 11 i 1 +ttii Ilr 111 IIll:L:~.;i ±d:··

f"''''' ,++~, ftRt, ,-E~t~.i 1 1

' 'ti, t;' Itltl:t'ttif !-';1:

l!f

1

t--r--t-1 Hj+ë ~r-'-H-" ~ tt-. rm ïml':+~-~ I ' .. H- I:.: j

1+ffifl:f:4IJi:-Ht,'J:

:S!!±m

n~qmij

r

1

r:!

i

j rtt ;:P: :tt:

•

m

.m _;::w

I

r-tffiî.~ Hrr::tl r;:;+; r.rq:J mlFlf.

:ri i-::r, :1. I1!

.4 ~ '~±t! ~lt1= ~1:ffiiîlE

~

mali

. '

",:1"· r:1RH ~ ~c' ~'.~ .. ,t c-;:rr;-::: "~~H- I+l ~, ·'-cl>++' 'T't '!-".o+' , ... ,,"' r' t':::± .,- - ~r-+-t f---t---.-. ~"" . ".,-+ +T§È • ..:. c-f -~" -trr li;tttj:j::j:U ~" J±l::t 1+l+f."f-+t . , : : : ' , p,

c-ftI8

'+·-~l--r-l---.--H---+-- -.-.-~ ... ' - - J - o r-q ~

:'!li HlltH-i I 'Ct .. + .. :hl11 'i:: : 1:, . i I';·, hTtï1ii

Htlc+nl+i:m::q::rl::l+ :1& Iti: ht1 :, Cl ::::, I rt, Irt I: LUb 1 lr.J-I'j:+.+tIt#H jttj: ,;t; .. '11 j' :li: .", I!'

I;! '

iJ

4 . - - : ---r-tr. ~ ~~: ti--H -;n: :;--1

lFl~~1 ;t;.; r~ , ;1 'Lli~

i:;

'-I",' I·,.j ,rttt "., t 1. , ,~,

I" i 11ti:+l rjli 1'" "ITT fItH~~:

I j:1 ::tl lm ,

:+

I: ci ; I ti 1; .

Ir .

ij,

ffJff,"it' . ','.

'+m:';:'

... " . !ti,1 ,.. 'ltrlilj' ~.' I :1: 1

r'I'IIIII·l!

1, , 1

_4-1 I • 't-- rr--' i·1- • ! . • rmlt+t1- 'ti: tf ltî!i : i rt :: 11: 1 ~itltttJ: titi:1 11,11 :iiL i:: illlill

1mmflWm

;rt~

rt

i

:Is

:ldkl!:

tif:

!!:iljli:

i

I~

:n

H

i:

_h.

Ch 'Ifffffffi +;::

n

g

~' _{ij IHlttjt trr:; rn} 11 'RIL!=! Er;.;:t.: r::1

ii! ! j! li!t t r:.. !t. t·b::i+lI·Tn j',:ff:1::j:::::: rrn-t

I ['IIT _t1 I1

I

I:

i: I I l 1 : j 1 I:!. .,.;.). :' :!

il!l~ IJ

lP

J!

t:t~i~

! ti i

I

U; P t jij'! j 1 I 1::IT t, -~ ~::ti T11fl tui

m

~

tm

1" I1 iJL II! t ,I q I. 1i 11, I; f.:::!::j: l~-! i ! 1 I . H1 I'H ,}T:fHl U::L rfflf:t ,j::lttit

;op

n;

I

+:-lltlr I:::' +ic;-,tL." , Itm~mli~:: '11' , I " "

+tj·tti+tai h~ ;_~L I+-t-~ :tt-ttl~t:-:- ;~-j! :-1:1 lj)-j 11t! i 11 .

I'

1 I: '11'·:, ': I ! Ir; t 1: ~:::t 1::I:I,~:j::i TI' ~ ,w: -UJ ·2.1-1 .l::!." t · ~ . tl+t'itt!' • ·t

'f" [ler'~" +1-- ct-'T t"h +;....1 ',~

H'" '., .. ,"

!

1

j 11 t-1 1..:_:--1-~" , d-'-+---.--t-;..j 1~"" 1 . I ': '

"T-~!.t ; -";- " rt.ri .!:t-;t :.--:--:--:-j 1 :: r! 1

Ê1t

:ti+- '

It+-SU~~; jij] j;r ~~+IlIJ!

ft-'T IH -'rh, , ,.,

4J.;..;.I-~

t+!+1

Hf

I I. L,I :1:1 jl:! ,'c;.;. rIJIr:t:r;+:: tr l:J;J ;i: :l';+:~.: rr-t- r--I-t-=t= ~H---7 t-+ I Lil i ril: : I r i1 1fu r~ j:j:;,.++t q:;::r .! J

rr

.~. ,~ . h ct±±: ,. H!J::t:; f:1.I~. ~l:. 'i:f:ic' , '+ -~ .~,-~ -:!~ .

o

o

=