[2007/Nr 4] Chromatografia kolumnowa związków fenolowych słodkiego łubinu na żelu krzemionkowym

Anna Rybarczyk, Ryszard Amarowicz

CHROMATOGRAFIA KOLUMNOWA ZWIA˛ZKO

´

W FENOLOWYCH

SŁODKIEGO ŁUBINU NA Z

˙

ELU KRZEMIONKOWYM

Zakład Analizy Z

˙

˙

Instytutu Rozrodu Zwierza˛t i Badan´ Z

˙

Z nasion słodkiego łubinu uzyskano ekstrakt zwia˛zko´w fenolowych stosuja˛c 80% metanol. W wyniku chromatografii kolumnowej na z˙elu krzemionkowym z faza˛ ruchoma˛ chloroform-metanol-woda (35:65:10; v/v/v) wyodre˛bniono cztery frakcje (I – IV) zwia˛z-ko´w fenolowych. Zawartos´c´ fenoli ogo´łem wahała sie˛ w nich od 32 do 112 mg/g. Widmo UV wskazuje na obecnos´c´ izoflawono´w we frakcjach I i II oraz fenolokwaso´w, flawonoli lub flawono´w we frakcjach III i IV.

Hasła kluczowe: słodki łubin, zwia˛zki fenolowe, chromatografia kolumnowa, z˙el

krzemionkowy.

Key words: sweet lupin, phenolic compounds, column chromatography, silica gel.

Nasiona łubinu charakteryzuja˛ sie˛ wysoka˛ wartos´cia˛ odz˙ywcza˛ ze wzgle˛du na

zawartos´c´ białka, składniko´w mineralnych, błonnika, oligocukro´w i zwia˛zko´w

polifenolowych. Łubin moz˙e byc´ uprawiany na obszarach o zmiennych warunkach

klimatycznych i glebowych (1). Zainteresowanie łubinem w obszarze nauki

o z˙ywnos´ci wzrosło z chwila˛ wyhodowania niskoalkaloidowych odmian łubinu (2).

Podobnie jak nasiona innych ros´lin stra˛czkowych, nasiona łubinu sa˛ bogatym

z´ro´dłem zwia˛zko´w fenolowych. Obecnos´c´ izoflawono´w i flawan-3-oli w łubinie

zanotowali Stobiecki i Popenda (3). Zawaros´c´ proantocyjanidyn badali Ricardo da

Silva i wspo´łpr. (4). Flawonoidy ekstrahowane z nasion łubinu benzenem, eterem

etylowym i octanem etylu analizowali Merino i wspo´łpr. (5). Wyste˛powanie

2’-OH-genisteiny, genisteiny i licoizoflawonu-A w ro´z˙nych cze˛s´ciach

anatomicz-nych Lupinus albus zostało potwierdzone przez Baer i wspo´łpr. (6). W cytowanej

pracy izoflawony łubinu wykazywały efekt grzybotoksyczny. Efekt antybakteryjny

zwia˛zko´w fenolowych z nasion wa˛skolistnego łubinu zanotowano wzgle˛dem

Lactobacillus acidophilus, Escherichia coli, Salmonella enteritidis i

Staphylococ-cus aureus (7). Aktywnos´c´ przeciwutleniaja˛ca zwia˛zko´w fenolowych z nasion

łubinu opisana została w kilku pracach naukowych (1, 7, 8, 9).

W s´wietle powyz˙ej przytoczonych informacji zasadne wydaja˛ sie˛ dalsze badania

nad bliz˙szym poznaniem zwia˛zko´w fenolowych łubinu. W procesie oczyszczania

zwia˛zko´w fenolowych podstawowe zastosowanie znajduje chromatografia

kolum-nowa. W niniejszej pracy do rozfrakcjonowania zwia˛zko´w fenolowych z nasion

słodkiego łubinu zastosowano z˙el krzemionkowy.

MATERIAŁ I METODY

Materiał do badan´ stanowiły nasiona słodkiego, białego łubinu odmiany Pikador zakupionego w Os´rodku Hodowli Ros´lin w Olsztynie.

Zmielona˛ pro´bke˛ nasion o masie 40 g przesypana˛ do kolby okra˛głodennej o obj. 500 cm3

zalano 80% (v/v) roztworem metanolu przy stosunku materiału stałego do solwentu 1:8 (w/v) (10). Naste˛pnie szczelnie zamknie˛ta˛ kolbe˛ umieszczono w łaz´ni wodnej z wytrza˛saniem. Ekstrakcje˛ prowadzono przez 15 min. w temp. 60°C. Po schłodzeniu metanolowy supernatant filtrowano przez bibułe˛ Whatman 1. Pozostały na sa˛czku materiał przenoszono z powrotem do kolbki. Ekstrakcje˛ przeprowadzono trzykrot-nie, a uzyskane przesa˛cza ła˛czono. Z tak uzyskanego materiału oddestylowano metanol w wyparce rotacyjnej w temp. 40°C, pozostała˛ zas´ wode˛ usunie˛to na drodze liofilizacji.

Kolumne˛ chromatograficzna˛ wypełniona˛ z˙elem krzemionkowym (40 – 63 μm; Merck) przemyto najpierw w kolejnos´ci trzema obje˛tos´ciami metanolu i fazy ruchomej chloroform-metanol-woda (35:65:10; v/v/v) (11). Ekstrakt (500 mg) rozpuszczono w 5 cm3

metanolu i naniesiono na kolumne˛. Eluat zbierano za pomoca˛ kolektora frakcji (4 cm3

/probo´wke˛). Rozdział chromatograficzny monitorowa-no poprzez pomiar ge˛stos´ci optycznej eluatu w UV przy dł. fali 270 i 330 nm. W oparciu o wykres´lony chromatogram uzskany eluat poła˛czono w gło´wne frakcje. Po odparowaniu rozpuszczalnika w wyparce rotacyjnej w temp. 45°C uzyskany materiał zwaz˙ono. Zawartos´c´ fenoli ogo´łem w tak uzyskanych frakcjach oznaczono kolorymetrycznie z odczynnikiem fenolowym Folina-Ciocalteu’a (12). Kwas sinapowy przyje˛to w niniejszej pracy jako substancje˛ wzorcowa˛. Widmo w UV zwia˛zko´w fenolowych zawartych w poszczego´lnych frakcjach zarejestrowano za pomoca˛ spektrofotometru Beckman DU 7500.

WYNIKI I ICH OMO

´

W wyniku chromatografii kolumnowej na z˙elu krzmionkowym z faza˛ ruchoma˛ chloroform-metanol-woda (35:65:10; v/v/v) z ekstraktu metanolowego nasion słodkiego łubinu uzyskano cztery frakcje (I – IV) zawieraja˛ce zwia˛zki fenolowe (ryc. 1). Frakcja I charakteryzowała sie˛ najwie˛kszym udziałem

Ryc. 1. Rozdział ekstraktu zwia˛zko´w fenolowych z nasion słodkiego łubinu na kolumnie z z˙elem krzemionkowym.

Fig. 1. Silica gel column chromatography of phenolic compounds from the extract of sweet lupin seeds.

masowym w ekstrakcie (tab. I). Zawartos´c´ zwiazko´w fenolowych w niej była jednak najmniejsza˛ (32.6 mg/g). Masy frakcji II i III były podobne, jednak zawartos´c´ fenoli we frakcji III była wyraz´nie wyz˙sza niz˙ we frakcji II (odpowiednio 55 i 91 mg/g). Masa uzyskanej frakcji IV była wprawdzie najniz˙sza, jednak zawartos´c´ w niej zwia˛zko´w fenolowych była najwyz˙sza (112 mg/g).

T a b e l a I

Charakterystyka frakcji zwia˛zko´w fenolowych uzyskanych w wyniku chromatografii kolumnowej na z˙elu krzemionkowym

T a b l e I

Characteristic of the fractions of phenolic compounds obtained using a silica gel column chromatography

Frakcja Masa (mg)

Zawartos´c´ fenoli ogo´łem (mg/g) Maksimum w widmie UV (nm) I II III IV 230 103 100 18 32±1 55±2 91±3 112±4 271, 279, 286 270 271, 331 275, 327

Ryc. 2. Widma UV zwia˛zko´w fenolowych w frakcjach uzyskanych w wyniku chromatografii kolumnowej na z˙elu krzemionkowym.

Fig. 2. UV spectra of phenolic compounds found in fractions obtained using a silica gel column chromatography.

Uzyskane w pracy zawartos´ci zwia˛zko´w fenolowych we frakcjach II – IV uznac´ nalez˙y za wysokie. Sa˛ one wyz˙sze lub zbliz˙one do zawaros´ci jakie stwierdzono w przypadku frakcji uzyskanych z nasion ros´lin stra˛czkowych i oleistych za pomoca˛ chromatografii kolumnowej na z˙elu Sephadex LH-20 z metanolem lub etanolem jako fazami ruchomymi (13 – 16). W chromatografii na z˙elu krzemionkowym w odro´z˙-nieniu od chromatografii na lipofilnym Sephadeksie dominuja˛cy pik odpowiadaja˛cy zwia˛zkom fenolo-wym charakteryzuje sie˛ wie˛ksza˛ obje˛tos´cia˛ elucji.

Widmo UV zwia˛zko´w fenolowych zawartych we frakcjach I – IV było zro´z˙nicowane (ryc. 2). W przypadku frakcji I i II zanotowano silne pasma absorpcji przy kro´tszych długos´ciach fali (tab. I). Ich z´ro´dłem mogły byc´ izoflawony (17). Obecnos´c´ tej grupy flawonoido´w w nasionach łubinu opisana jest w pis´miennictwie (18). Maksimum w widmie frakcji III i IV wskazuje o zawartos´ci w tych frakcjach fenolokwaso´w (19). Stosunkowo wysokie odczyty absorbancji w obszarze 340 – 360 nm przemawiaja˛ o obecnos´ci w tych frakcjach najprawdopodobniej ro´wniez˙ flawonoli lub flawono´w (17).

WNIOSKI

Zastosowana metoda chromatografii kolumnowej na z˙elu krzemionkowym

po-zwala wyodre˛bnic´ z ekstraktu metanolowego z nasion łubinu słodkiego frakcje

ro´z˙nia˛ce sie˛ zawartos´cia˛ i składem zwia˛zko´w fenolowych. Ten rodzaj

chromato-grafii moz˙e byc´ stosowany w uzyskiwaniu czystych zwia˛zko´w fenolowych nasion

słodkiego łubinu jako etap poprzedzaja˛cy semipreparatywna˛ metode˛ HPLC w

ukła-dzie odwro´conych faz. Nalez˙y podkres´lic´, z˙e koszt z˙elu krzemionkowego jest

wielokrotnie niz˙szy niz˙ z˙elu Sephadex LH-20, kto´ry najcze˛s´ciej jest stosowany

w chromatografii kolumnowej ekstrakto´w zwia˛zko´w fenolowych z surowco´w

ros´linnych.

A. R y b a r c z y k, R. A m a r o w i c z

SILICA GEL COLUMN CHROMATOGRAPHY OF PHENOLIC COMPOUNDS IN SWEET LUPIN SEEDS EXTRACT

S u m m a r y

Extract of sweet lupin seeds was prepared using 80% methanol. Four fractions (I-IV) were separated from the crude extract on a silica gel column using chloroform-methanol-water (35:65:10; v/v/v/) as the mobile phase. The content of total phenolics in the resultant fractions ranged from 32 to 112 mg/g. Results of UV spectroscopy show the presence of isoflavones in fractions I and II, and phenolic acids, flavonols or flavones in fractions III and IV.

PIS

´

1. Tsaliki E., Lagouri G., Doxastakis L.G.: Evaluation of the antioxidant activity of lupin seed flour and derivatives (Lupinus albus ssp. Graecus). Food Chem., 1999; 65: 71-75. – 2. Gladstones J.S.: Development of lupins as new crop legume. Food Australia, 1990; 42: 270-276. – 3. Stobiecki M.,

Popenda M.: Flavan-3-ols from seeds of Lupinus augustifolius. Phytochemistry, 1994; 37: 1707-1711.

– 4. Ricardo da Silva J.M., Laureano O., Beiaro da Costa M.L.: Total phenol and proanthocyanidin evaluation of Lupinus species. Materiały z konferencji: “7th _{International Lupin Conference”, Evora,} Portugal, 250-254. – 5. Merino E.F., Fuentes E., Plnchuelo A.M.: Phytochemical characterization of lupin species of South America. Materiały z konferencji: “9th

International Lupin Conference”, International Lupin Association, Canterbury, New Zeland, 1999; 291-293. – 6. Baer D., Saelzer R., Vega

M., Ibieta P., Molina L., Baer E., Ibanez Hashagen U.: Isoflavones and anthracnose in Lupinus albus and L. Angustifolius. Materiały z konferencji: “9th _{International Lupin Conference”, International Lupin} Association, Canterbury, New Zeland, 1999; 26-32. – 7. Bielecka M., Gulewicz K., Kozłowska H., Łatosz

łubinu wa˛skolistnego (Lupinus angustifolius L.). Materiały z konferencji: „Łubin we wspo´łczesnym rolnictwie”, Olsztyn, 1997. – 8. Lampart-Szczapa E., Korczak J., Nogala-Kalucka M.,

Zawirska-Wojtasik R.: Antioxidant properties of lupin seed products. Food Chem., 2003; 83: 279-285. – 9. Frijas J., Miranda M.L., Doblado R., Vidal-Valverde C.: Effect of germination and fermentation on the

antioxidant vitamin content and antioxidant capacity of Lupinus albus L. var. Multolupa. Food Chem., 2005; 92: 211-220. – 10. Amarowicz R., Piskuła M., Honke J., Rudnicka B., Troszyn´ska A., Kozłowska

H.: Extraction of phenolic compounds from lentil (Lens culinaris) with various solvents. Pol. J. Food

Nutr. Sci., 1995; 45: 53-62.

11. Amarowicz R., Wanasundara J.K.J.P.D., Shahidi F.: Chromatographic separation of flaxseed phenolics. Nahrung, 1994; 38: 520-526. – 12. Naczk M., Shahidi F.: The effect of methanol-ammonia-water treatment on the content of phenolic acids of canola. Food Chem., 1998; 31: 159-164. – 13.

Amarowicz R., Karamac´ M., Kmita-Głaz˙ewska H., Troszyn´ska A., Kozłowska H.: Antioxidant activity of

phenolic fractions of everlasting pea, faba bean and broad bean. J. Food Lipids, 1998; 3: 199-211. – 14.

Amarowicz R., Naczk M., Shahidi, F.: Antioxidant activity of various fractions of non-tannin phenolics

of canola hulls. J. Agric. Food Chem., 2000; 48: 2755-2759. – 15. Chavan U.D., Amarowicz R., Shahidi

F.: Antioxidant activity of phenolic fractions of beach pea (Lathyrus maritimus L.). J. Food Lipids,

1999; 6: 1-11. – 16. Amarowicz R., Shahidi F.: Application of Sephadex LH-20 chromatography for the separation of cyanogenic glycosides and hydrophylic phenolic fraction from flaxseed. J. Liquid Chrom., 1994; 17: 1291-1299. – 17. Mabry T.J., Markham K.R., Thomas M.B.: The Systematic Identification of Flavonoids, Springer Verlag, New York – Heidelberg – Berlin, 1970; 41-227. – 18. Katagiri Y., Ibrahim

R.K., Tahara S.: HPLC analysis of white lupin isoflavonoids. Biosci. Biotechnol. Biochem., 2000; 64:

1118-1125. – 19. Naczk M., Amarowicz R., Sullivan N., Shahidi F.: Current research developments on polyphenolics of rapeseed/canola: a review. Food Chem., 1998; 62: 489-502.