Diagnostyka serologiczna układowych
chorób tkanki łącznej – wykrywanie
przeciwciał ANA i ANCA według
międzynarodowych konsensusów
i wytycznych
Serological diagnosis of systemic connective tissue
diseases – detection of ANA and ANCA antibodies according
to international consensuses and guidelines
Anna Krefta, Sylwia Elert‑Kopeć, Witold Tłustochowicz
Klinika Chorób Wewnętrznych i Reumatologii CSK MON WIM w Warszawie; kierownik: prof. dr hab. med. Witold Tłustochowicz
Streszczenie. Przeciwciała przeciwjądrowe (ANA) i przeciwciała przeciw cytoplazmie granulocytów obojętnochłonnych
(ANCA) są podstawowym elementem diagnostyki układowych chorób tkanki łącznej. W ostatnich latach ze względu na wprowadzenie nowatorskich technologii ich oznaczania ponownie oceniono przydatność dostępnych metod. W 2014 r. międzynarodowa grupa ekspertów EULAR stworzyła rekomendacje dla interpretacji ANA oznaczanych różnymi
metodami. W rekomendacjach tych podkreślono rolę immunofluorescencji bezpośredniej jako metody referencyjnej i istotność określenia, czy mamy do czynienia z jądrowym, czy cytoplazmatycznym typem świecenia. W 2016 r. swoje wytyczne przedstawił Międzynarodowy konsensus w sprawie wzorów świecenia ANA, a w 2017 r. wytyczne zrewidował Międzynarodowy konsensus dotyczący badania ANCA w ziarniniakowatości z zapaleniem naczyń i mikroskopowym zapaleniu naczyń, według których duża czułość i swoistość testów antygenowoswoistych wykrywających PR3‑ANCA i MPO ANCA pozwalają na odstąpienie od wykonywania testów immunofluorescencji pośredniej. W poniższym artykule omówiono zasady oznaczania i interpretacji klinicznej ANA i ANCA według międzynarodowych konsensusów i wytycznych.
Słowa kluczowe: przeciwciała ANA, przeciwciała ANCA, diagnostyka serologiczna, ANCA‑zależne zapalenia naczyń Abstract. Antinuclear antibodies (ANA) and antineutrophil cytoplasmic antiobodies (ANCA) are an essential element in
the diagnosis of systemic connective tissue diseases. In recent years, due to the introduction of innovative technologies for their determination, the usefulness of available methods has been reassessed. In 2014, the international EULAR (European League Against Rheumatism) expert group created recommendations for interpreting ANA using different methods. These recommendations highlighted the role of direct immunofluorescence as a reference method and the importance of determining, whether we are dealing with a nuclear or cytoplasmic type of glow. In 2016, its guidelines were presented by the International Consensus on ANA Lighting Patterns (ICAP), and in 2017, the guidelines were revised by the international consensus on ANCA in granulomatosis with vasculitis (GPA) and microscopic vasculitis (MPA), according to which the high sensitivity and specificity of antigen‑specific PR3‑ANCA and MPO‑ANCA detection tests allow for the abandonment of indirect immunofluorescence tests. The article below discusses the principles for the determination and clinical interpretation of ANA and ANCA antibodies according to international consensuses and guidelines.
Key words: ANA antibodies, ANCA antibodies, ANCA‑associated vasculitis, serological diagnostics
Nadesłano: 28.04.2020. Przyjęto do druku: 24.06.2020 Nie zgłoszono sprzeczności interesów.
Lek. Wojsk., 2020; 98 (3): 206–212 Copyright by Wojskowy Instytut Medyczny
Adres do korespondencji
lek. Anna Krefta
Klinika Chorób Wewnętrznych i Reumatologii CSK MON WIM
ul. Szaserów 128, 04‑141 Warszawa e‑mail: akrefta@wim.mil.pl
w celu dokładnego omówienia i opracowania konsen-susu odnośnie do ujednolicenia raportowania wyników ANA i morfologii wzorców świecenia obserwowanych w pośrednim teście immunofluorescencji pośredniej na komórkach HEp‑2 oraz oceny, czy wzorce cytopla-zmatyczne i mitotyczne należy zgłaszać jako pozytyw-ne lub pozytyw-negatywpozytyw-ne.
Rekomendacje EULAR z 2014 r.
Rekomendacje EULAR z 2014 r. przedstawiono w tabe-li 1. [3]
W punkcie 10. rekomendacji ustalono punkt odcię-cia wartości prawidłowych na mianie przeciwodcię-ciał 1:160. W 2018 r. przeprowadzono przegląd systematyczny pi-śmiennictwa i metaanalizę retrospektywną 13 000 cho-rych na toczeń rumieniowaty układowy, u któcho-rych ozna-czano przeciwciała ANA metodą IIF HEp‑2. Wyniki tego badania potwierdzają dużą czułość i specyficzność ANA oznaczonych tą metodą w diagnostyce tocznia i umoż-liwiły ustalenie punktu odcięcia miana przeciwciał ANA na mianie 1:80 [4]. Bazując na powyższej metaanalizie, w nowych kryteriach klasyfikacyjnych EULAR/ACR tocz-nia rumieniowatego układowego z 2019 r. ustalono obec-ność przeciwciał ANA w mianie 1:80 jako obowiązkowe kryterium wstępne w diagnostyce SLE. Za metodę refe-rencyjną uznano oznaczanie przeciwciał metodą immu-nofluorescencji pośredniej na podłożu HEp‑2; ze wzglę-du na trwające obecnie prace mające na celu standary-zację metod stosowanych w serologii i potencjalny dal-szy rozwój na tym polu, za wynik dodatni można jednak uznać wynik innego równoważnego testu immunolo-gicznego na fazie stałej [5].
W przypadku pozytywnego testu ANA zaleca się po-danie typu świecenia i miana, a oprócz jądrowego typu świecenia powinno się opisać występowanie świece-nia cytoplazmatycznego i aparatu podziałowego. Znajo-mość miana, a zwłaszcza wzoru świecenia przeciwciał, znacząco zwiększa naszą zdolność do zróżnicowania ANA‑dodatnich osób zdrowych i chorych z układowymi chorobami tkanki łącznej. Miano ANA jest większe u pa-cjentów z UChTŁ niż u osób zdrowych. Typy świecenia: jądrowe homogenne, jądrowe gruboplamiste i jądrowe centromerowe, występują niemal wyłącznie u pacjen-tów z UChTŁ. Przeciwciała gęste drobnoziarniste wystę-pują typowo u zdrowych osób. Najczęściej stwierdzane wzory świecenia – jądrowe drobnoziarniste – występu-ją zarówno u osób zdrowych, jak i u chorych z UChTŁ, u tych pierwszych w mniejszych mianach [6]. Zarów-no omawiane wytyczne EULAR, jak i zalecenia Ameri-can College of Rheumatology (ACR) mówią o odstąpie-niu od poszerzania diagnostyki w kierunku autoprzeciw-ciał swoistych, takich jak anty‑dsDNA czy anty‑Sm, jeśli wynik testu przesiewowego był ujemny i brak jest kli-nicznych przesłanek sugerujących UChTŁ. Wyjątek sta-nowią autoprzeciwciała reagujące z Jo‑1 i SS‑A, gdyż
Wstęp
U podłoża układowych chorób tkanki łącznej (UChTŁ) leżą zaburzenia odpowiedzi immunologicznej, zarów-no typu komórkowego, jak i humoralnego. Przejawem tych zaburzeń są między innymi obecne w surowicy au-toprzeciwciała. Najczęściej wykorzystywane w prakty-ce klinicznej są badania w kierunku przeciwciał przeciw-jądrowych (antinuclear antibodies – ANA) i przeciwciał przeciw cytoplazmie granulocytów obojętnochłonnych (antineutrophil cytoplasmic antibodies – ANCA).
Na przestrzeni ostatnich lat pojawiło się wiele no-wych metod i osiągnięć w wykrywaniu ANA i ANCA. Obok oryginalnego testu immunofluorescencji bezpo-średniej z użyciem linii komórkowej Hep‑2 (IIFA‑Hep‑2) i testów ELISA pojawiły się nowatorskie technologie fazy stałej, takie jak ALBIA (addressable laser bead
immuno-assay), chemiluminescencja, FEIA (fluorescent‑enzyme immunoassay), LIA (line immunoassays). Metody te
róż-nią się czułością, specyficznością i profilem antygenów, co mnoży niewiadome odnośnie do standaryzacji i inter-pretacji ich wyników. W związku z tym międzynarodo-we grupy ekspertów podjęły próbę stworzenia rekomen-dacji dla osób zlecających i interpretujących te badania.
Przeciwciała przeciwjądrowe (ANA)
Przeciwciała przeciwjądrowe (ANA) są podstawowym elementem diagnostyki układowych chorób tkanki łącz-nej. Klasycznie od 1950 r. oznaczane są metodą immu-nofluorescencji bezpośredniej z użyciem linii komórko-wej Hep‑2 (IIFA‑Hep‑2), która stanowi złoty standard dia-gnostyczny [1,2]. Tytuł złotego standardu IIFA otrzymała dzięki dużej czułości w stosunku do układowych chorób tkanki łącznej (głównie tocznia rumieniowatego układo-wego i twardziny układowej), licznym wynikom badań naukowych potwierdzających ich praktyczne zastoso-wanie oraz znaczeniu historycznemu, gdyż wyniki uzy-skane właśnie tą metodą służyły pierwotnie do ustala-nia kryteriów rozpoznado ustala-nia chorób.
Na przestrzeni ostatnich lat, wobec rosnącego za-potrzebowania na oznaczenia przeciwciał ANA i praco-chłonności metody referencyjnej, rozwinęły się alter-natywne metody i techniki ich oznaczania. W związku z tym międzynarodowa grupa ekspertów EULAR (Euro-pean League Against Rheumatism) w 2014 r. stworzyła rekomendacje dla interpretacji ANA oznaczanych róż-nymi metodami. W rekomendacjach tych podkreślono rolę immunofluorescencji bezpośredniej jako metody re-ferencyjnej i istotność określenia, czy mamy do czynie-nia z jądrowym, czy z cytoplazmatycznym typem świe-cenia. Również w 2014 r. zainicjowany został Między-narodowy Konsensus w Sprawie Wzorów Świecenia ANA (International Consensus on ANA Patterns – ICAP)
Tabela 1. Rekomendacje EULAR 2014 dotyczące wykrywania przeciwciał do składników komórkowych zwyczajowo określanych jako ANA [3] Table 1. EULAR 2014 recommendations for detection of autoantibodies to cellular components commonly referred to as ANA [3]
Diagnoza układowej choroby tkanki łącznej wymaga wykonania panelu specjalistycznych testów laboratoryjnych (m.in. ANA, anty‑dsDNA i ENA)
Testy w kierunku ANA, anty‑dsDNA i anty‑ENA powinny być uwzględnione w wykrywaniu autoprzeciwciał w ramach diagnostyki układowych chorób tkanki łącznej, a także niektórych innych chorób autoimmunologicznych
Testem pierwszego rzutu w diagnostyce układowych chorób tkanki łącznej jest test w kierunku ANA
Testy w kierunku ANA przeznaczone są przede wszystkim do celów diagnostycznych, a nie monitorowania postępu choroby
Metoda immunofluorescencji pośredniej (IIF) jest metodą referencyjną dla badań przesiewowych w kierunku ANA; można zastosować alternatywne testy, pamiętając jednak o tym, że ich współczynnik wyników fałszywie ujemnych i fałszywie dodatnich może być różny; z tego względu, jeśli podejrzenie kliniczne układowej choroby tkanki łącznej jest silne, a wynik metody alternatywnej jest ujemny, należy wykonać test metodą IIF Laboratoria diagnostyczne powinny podawać metodę zastosowaną do wykrywania ANA przy podawaniu wyniku
Testy oparte na mieszaninie ograniczonej liczby określonych antygenów jądrowych nie powinny być nazywać testem ANA ani badaniem przesiewowym w kierunku ANA
Laboratoria stosujące własne testy wewnętrzne do wykrywania ANA, anty‑dsDNA i swoistych przeciwciał anty‑ENA powinny standaryzować każdy test zgodnie ze standardami międzynarodowymi (np. WHO, CDC/IUIS)
W przypadku badań przesiewowych ANA za pomocą IIF koniugat (roztwór przeciwciał antyludzkich znakowanych fluoresceiną) powinien zawierać jako przeciwciała drugorzędowe przeciwciała przeciwko ludzkiej IgG znakowane fluorochromem
Wykonanie testu ANA metodą IIF zależy od odczynników, sprzętu i innych lokalnych czynników, dlatego rozcieńczenie przesiewowe – dodatnie – należy określić lokalnie; jako nieprawidłowy wynik ANA powinno się przyjąć miano >95. percentyla dla zdrowej populacji kontrolnej; zasadniczo, przy stosowaniu konwencjonalnych substratów HEp‑2(000) dla populacji dorosłych ocenianych pod kątem układowych chorób tkanki łącznej odpowiednie wydaje się rozcieńczenie 1:160
W przypadku pozytywnego testu ANA zaleca się podanie typu świecenia i największego rozcieńczenia Typy świecenia należy opisywać zgodnie z wystandaryzowaną terminologią
Oprócz jądrowego typu świecenia powinno się opisać występowanie świecenia cytoplazmatycznego i aparatu podziałowego
W przypadku dodatniego badania w kierunku ANA przy klinicznym podejrzeniu tocznia układowego sugeruje się wykonanie testu w kierunku przeciwciał anty‑dsDNA
Testem o najwyższej specyficzności do oznaczania przeciwciał anty‑dsDNA jest CLIFT – metoda immunofluorescencji pośredniej
z wykorzystaniem wiciowca Crithidium luciliae, lub technika Farra – radioimmunologiczna metoda fazy płynnej, w której reagują przeciwciała ze znanym znakowanym antygenem; metody alternatywne, głównie ELISA, cechują się mniejszą specyficznością i w związku z tym ich dodatni wynik powinien być potwierdzony metodą CLIFT lub Farra
Wynik badania przeciwciał anty‑dsDNA powinien zawierać opis zastosowanej do ich oznaczania metody Wynik przeciwciał anty‑dsDNA powinien być podany ilościowo (lub półilościowo w przypadku metody CLIFT)
W celu monitorowania aktywności SLE przez ilościowe oznaczenie przeciwciał anty‑dsDNA do porównania powinno się zastosować tę samą stosowaną wcześniej metodę
W przypadku pozytywnego testu przesiewowego ANA rekomenduje się wykonanie testu dla specyficznych przeciwciał anty‑ENA Przy wynikach przeciwciał anty‑ENA należy podać zastosowaną metodę; w przypadku rozbieżności z IIF lub z obrazem klinicznym należy rozważyć zastosowanie dodatkowej metody diagnostycznej
Wyniki testów przeciwciał dla specyficznych ENA powinny być wyszczególnione osobno; jeśli test w kierunku ENA jest w całości określony jako negatywny, konieczne jest określenie, które antygeny były zawarte w tym teście
Ilościowe oznaczenie dodatnich przeciwciał anty‑RNP jest rekomendowane w przypadku klinicznego podejrzenia mieszanej układowej choroby tkanki łącznej
W przypadku istotnego klinicznego podejrzenia bez względu na wynik ANA można wykonać testy w kierunku autoprzeciwciał do specyficznych ENA, np. anty‑Sm przy podejrzeniu SLE, anty Jo‑1 przy podejrzeniu miopatii zapalnej, anty‑SS‑A przy wrodzonym bloku serca, toczniu noworodków, podejrzeniu zespołu Sjögrena lub podostrego tocznia skórnego
Każde laboratorium powinno zweryfikować wartość odcięcia dla stosowanych zestawów do oznaczania ANA; zaleca się stosowanie surowic dobranych pod względem wieku i płci zdrowych pacjentów z ogólnej populacji lokalnej; wartości odcięcia należy zdefiniować jako 95. percentyl Każde laboratorium powinno zweryfikować zalecany poziom odcięcia dla zestawów używanych do oznaczania przeciwciał anty‑dsDNA i anty‑ENA; zalecane jest użycie odpowiedniej liczby próbek od pacjentów z odpowiednimi chorobami autoimmunologicznymi, grupy kontrolnej zebranej wśród osób chorych i grupy kontrolnej od osób zdrowych; punkty odcięcia powinny być zdefiniowane za pomocą analizy krzywej ROC ANA – przeciwciała przeciwjądrowe, anty‑ENA – przeciwciała przeciwko rozpuszczalnym antygenom jądra komórkowego, anty‑dsDNA – przeciwciała przeciwko dwuniciowemu DNA, IIF – immunofluorescencja pośrednia, WHO – Światowa Organizacja Zdrowia, CDC – Centers for Disease Control and Prevention, IUIS – International Union of Immunological Societies, CLIFT – Crithidia luciliae immunofluorescence test,
Informacja, czy wynik testu jest pozytywny, czy ne-gatywny, określenie wzoru świecenia (w przypadku metody IIF) i poziomu przeciwciał (określony mianem przeciwciał, intensywnością fluorescencji lub w przy-padku metod alternatywnych – w unitach). W przy-padku mieszanych typów świecenia jako pierwsze powinny być opisane typy świecenia jądrowego, na-stępnie cytoplazmatycznego, a nana-stępnie mitotycz-nego; po każdym z nich należy podać ich miano.
Interpretacja – porada odnośnie do konieczności wy-konania dalszych testów lub możliwego kontekstu kli-nicznego stwierdzanych przeciwciał.
Rekomendacje ACR i EASI (European Autoimmuni-ty Standardization Initiative) zezwalają na używanie al-ternatywnych do IIF metod wykrywania ANA. Sporną kwestią pozostaje, czy obecność cytoplazmatycznego lub mitotycznego typu świecenia jąder komórkowych raportować jako ANA‑pozytywne, czy ANA‑negatywne: rekomendacje międzynarodowe ACR i EASI nie zajmu-ją jasnego stanowiska w tej kwestii, stwierdzazajmu-jąc jedy-nie, że wzory świecenia cytoplazmatycznego i mitotycz-nego powinny być odnotowane w wyniku. ECGSG (Eu-ropean Consensus Finding Study Group on Laboratory Investigation in Reumatology, grupa EULAR) natomiast ekspresja antygenu na komórkach HEp‑2 często jest
nie-wystarczająca, co może być przyczyną wyników fałszy-wie ujemnych [7].
Należy również pamiętać, że autoprzeciwciała nale-ży zlecać wyłączenie ze wskazań klinicznych, przy istot-nym podejrzeniu układowej choroby tkanki łącznej, gdyż w małym mianie obecne są nawet u 25% popula-cji, zwłaszcza w przypadku ciąży, infekpopula-cji, chorób nowo-tworowych czy chorób autoimmunizacyjnych narządo-wo snarządo-woistych (np. autoimmunologicznego zapalenia tar-czycy) [8].
Rodzaje najczęściej stwierdzanych przeciwciał prze-ciwjądrowych przedstawiono w tabeli 2. [3]
Międzynarodowy konsensus w sprawie
wzorów świecenia ANA
Wnioski międzynarodowego konsensusu w sprawie wzorów świecenia ANA (International Consensus on ANA Patterns – ICAP) z 2016 r. pokrywają się w większo-ści z rekomendacjami EULAR. ICAP zaproponował rapor-towanie wyników testów ANA wg poniższego schematu.
Podanie zastosowanego testu immunologicznego (np. IIF na HEp‑2, HEP‑2000, ALBIA, ELISA itd.)
Tabela 2. Przeciwciała ANA: najczęstsze stwierdzane typy świecenia [3] Table 2. ANA antibodies: the most commonly observed glow types [3]
jądrowe skojarzone z typem świecenia antygeny typowe jednostki chorobowe
homogenny dsDNA, histony, chromatyna/nukleosomy SLE, toczeń i zapalenie naczyń indukowane lekami, MIZS
gruboziarnisty/gruboplamisty U1‑snRNP (RNP), U2‑6SnRNP (Sm) – przeciwko
splicesomalnemu małemu jądrowemu RNP MCTD, SLE, objaw Raynauda, SSc, SS, nieokreślona układowa choroba tkanki łącznej drobnoziarnisty SS‑A, SS‑B, topoizomeraza‑1 (Scl‑70) SLE, SS, SSc, IM, MCTD
centromerowy kinetochor: CENP‑A i B (C, F) SSc, objaw Raynauda
jąderkowy PM/Scl, URNP, RNA‑polimaraza, To/Th SSc, objaw Raynauda, IM, zespoły nakładania
cytoplazmatyczne
rozsiany RibP (rybosomalne białko P), Jo‑1 SLE, IM
drobnoziarnisty Jo‑1 (syntetaza histydylo t‑RNA), SRP, PDH
(dehudrogenaza pirogronianowa – mitochondria) miopatie zapalne, DM, PBC, śródmiąższowa choroba płuc
rzadziej stwierdzane typy świecenia – jądrowe
obwodowy LAP1/2 gp210, nucleoporin p62 SLE, RZS, zapalne choroby wątroby, IM
gęsty drobnoziarnisty DFS70/LEDGF‑P75 u zdrowych osób
jąderkowy U3‑SnRNP (fibrylaryna) SSc
multiple nuclear dots Sp100, PML, p80‑coilin PBC, SS
centrosomowy enolaza, pericentrin SSc, choroby zapalne
rzadkie wzory
cytoplazmatyczne związane z chorobami neurologicznymi, ataksją móżdżkową, PBC, i innymi stanami zapalnymi DM – dermatomiositis, IM – miopatie zapalne, MCTD – mieszana układowa choroba tkanki łącznej, MIZS – młodzieńcze idiopatyczne zapalenie stawów, PBC – marskość żółciowa wątroby, RZS – reumatoidalne zapalenie stawów, SLE – toczeń rumieniowaty układowy, SS – zespół Sjögrena, SSc – twardzina układowa
jak ekspertów EULAR i ICAP, metodą referencyjną dla wykrywania ANA pozostaje IIF na podłożu HEp‑2.
Przeciwciała przeciw cytoplazmie
granulocytów obojętnochłonnych
(ANCA)
Rys historyczny
Od kilku dziesięcioleci przeciwciała przeciwko cytopla-zmie neutrofili (ANCA) są uznawane za niezwykle ważne narzędzie laboratoryjne w diagnostyce zapalenia małych naczyń, to jest ziarniniakowatości z zapaleniem naczyń (GPA), mikroskopowego zapalenia naczyń (MPA) i eozy-nofilowej ziarniniakowatości z zapaleniem naczyń. Wy-różnia się 2 rodzaje tych przeciwciał: cANCA (o cytopla-zmatycznym typie świecenia w badaniu metodą immu-nofluorescencji pośredniej z wykorzystaniem jako źró-dła antygenu granulocytów obojętnochłonnych, które sugeruje klasyfikowanie wzorów cytoplazmatycznych
jako ANA‑negatywne [9]. Zdaniem autorów pracy war-te uwagi jest rozwiązanie brazylijskie, czyli raportowa-nie typów świecenia cytoplazmatycznego jako ANA‑po-zytywne, ale z dopiskiem, że ANA jest testem wykrywa-jącym autoantygeny wszystkich struktur komórki, a nie tylko jej jądra. Umożliwiłoby to dodatkowo spójną inter-pretację alternatywnych do IIF metod badania ANA, któ-re wykrywają jako pozytywne zarówno wzorce cytopla-zmatyczne, jak i mitotyczne, bez możliwości ich odróż-nienia i opisania. Wykrywanie ANA metodą IIF pozwala uzyskać najwięcej dodatkowych danych wartościowych klinicznie – informacje o wzorze świecenia IIF i mianie przeciwciał (co jest istotne z punktu widzenia kliniczne-go – większe miano wiąże się z większym prawdopodo-bieństwem potwierdzenia rozpoznania układowej choro-by tkanki łącznej; co więcej, większe miano to większa szansa na identyfikację antygenu rozpoznawanego w te-stach antygenowoswoistych, różne typy świecenia koja-rzą się z innymi chorobami). Naszym zdaniem, podobnie
Rycina 1. Historia przeciwciał ANCA w zapaleniach naczyń [18] Figure 1. History of ANCA antibodies in vasculitis [18]
pierwsze powiązane ANCA z kłębuszkowym zapaleniem nerek wykrycie ANCA u chorych na GPA 1982 1985 1988 1989 1990 1998 1999 2000 2002 2005 2006 2007 2009 2010 2012 2014 2017 komercyjne badania ANCA ELISA ELISA podwójnego wiązania (capture ELISA) MPO zidentyfikwana jako autoantygen PR‑3 zidentyfikowane jako autoantygen EULAR rozważa włączenie ANCA do kryteriów diagnostycznych
rola PR‑3‑ANCA w patogenezie AAV opublikowanie
międzynarodowego konsensusu na temat
diagnostyki ANCA
testy LIA i DIA (Dot i Line Immunoassay) rola MPO‑ANCA w patogenezie AAV testy FEIA (Fluorescent Enzyme Immunoassay) ALBIA (Addressable Laser Bead Immunoassay)
automatyczne rozpoznawanie wzoru ANCA cytobead IIF zrewidowanie nazewnictwa AAV na Chapell‑Hill Consensus Conference testy ELISA 3‑generacji (Anchor ELISA) testy immunofluorescencji pośredniej BioChip aktualizacja wytycznych diagnostyki ANCA testy chemiluminescencyjne
zmienność pomiędzy dwiema przetestowanymi meto-dami IIF, i po drugie – dużą wydajność badania PR3‑AN-CA i MPO‑ANPR3‑AN-CA testami immunologicznymi fazy stałej w odróżnianiu osób z ANCA‑zależnym zapaleniem naczyń od osób zdrowych. Dla wszystkich testów swoistość dla PR3‑ANCA była nieznacznie większa niż dla MPO‑AN-CA (98–99% vs 96–99%); dla metody IIF swoistość dla c‑ANCA była znacznie większa niż dla p‑ANCA i wyno-siła odpowiednio 97% i 81%. Czułość cANCA dla wy-krywania GPA wynosiła 63% vs 75–80% dla PR3‑ANCA. Czułość pANCA dla wykrywania MPA wynosiła 89% vs 68–86% dla wykrywania MPO‑ANCA [17]. Uzyskane dane stały się podstawą do dokonania rewizji między-narodowego konsensusu w sprawie metod badania su-rowic w kierunku przeciwciał ANCA w 2017 r.
w testach immunoenzymatycznych fazy stałej reagują z proteinazą 3 i wówczas określane są jako PR3‑ANCA) oraz pANCA – o okołojądrowym typie świecenia, któ-re w testach immunoenzymatycznych fazy stałej któ- re-agują z mieloperoksydazą i wówczas określane są jako MPO‑ANCA [10]. Pierwsze wytyczne z 1999 r. dotyczą-ce oznaczania ANCA w diagnostydotyczą-ce zapaleń naczyń zale-cały wykonywanie badania screeningowego metodą po-średniej immunofluorescencji (IIF) na utrwalonych eta-nolem neutrofilach i potwierdzenie pozytywnych wyni-ków testem ELISA specyficznym dla proteinazy 3 (PR3) oraz mieloperoksydazy (MPO) [11]. Metaanaliza z 2001 r. potwierdziła dużą precyzyjność diagnostyczną połą-czenia wzoru cytoplazmatycznego IIF (C‑ANCA) z bada-niem PR3‑ANCA lub wzoru okołojądrowego IIF (P‑ANCA) z badaniem MPO‑ANCA [12]. Od czasu opublikowa-nia tego międzynarodowego konsensusu pojawiło się jednak wiele nowych metod i osiągnięć w wykrywa-niu PR3‑ANCA i MPO‑ANCA. Obok oryginalnego testu ELISA pojawiły się nowatorskie technologie fazy stałej, takie jak testy immunologiczne adresowalnego lasera, oparte na chemiluminescencji (CLIA), testy immunoen-zymatyczne (FEIA), LIA i inne. Co więcej, ewoluował spo-sób wiązania antygenu z fazą stałą, od bezpośredniego wiązania (testy I generacji), w kierunku wiązania poprzez przeciwciało monoklonalne (testy II generacji), do wiąza-nia przez łącznik peptydowy (testy III generacji) [13‑15]. Historię przeciwciał ANCA w zapaleniach naczyń przed-stawiono na rycinie 1.
Nowe trendy w diagnostyce –
badania wieloośrodkowe
Wobec kolejnych postępów technologicznych w dia-gnostyce ANCA zakwestionowano pozycję IIF jako me-tody optymalnej. Pierwsze badanie z 2008 r., które za-kwestionowało pozycję IIF w algorytmie testowym ANCA, ujawniło, że badanie w kierunku ANCA meto-dą testów antygenowospecyficznych jest tak samo sku-teczne, jak przyjęty przez międzynarodowy konsensus algorytm z 1999 r. [16] W wieloośrodkowym badaniu z 2016 r. oceniono dokładność szerokiego spektrum do-stępnych obecnie nowoczesnych technologii w wykry-waniu MPO‑ANCA i PR3‑ANCA. Podczas badania po-brano próbki surowicy od 251 pacjentów z ANCA‑za-leżnymi zapaleniami naczyń (GPA i MPA) oraz od 924 pacjentów, u których podejrzewano te choroby, ale osta-tecznie ich nie rozpoznano, którzy stanowili grupę kon-trolną. Surowice zostały zbadane w kierunku obecno-ści cytoplazmatycznego/okołojądrowego wzorca świe-cenia i atypowych ANCA (A‑ANCA) metodą pośredniej immunofluorescencji (IIF) w dwóch niezależnych labora-toriach oraz na obecność PR3‑ANCA i MPO‑ANCA sied-mioma różnymi testami immunologicznymi, m.in. ELI-SA II i III generacji, CLIA i FEIA. Porównanie różnych metod wykrywania ANCA wykazało po pierwsze – dużą
Tabela 3. Międzynarodowy konsensus dotyczący badania ANCA w ziarniniakowatości z zapaleniem naczyń (GPA) i mikroskopowym zapaleniu naczyń (MPA) 2017 [18] Table 3. International consensus on testing of ANCAs in granulomatosis with polyangiitis (GPA) and microscopic polyangiitis (MPA) 2017 [18]
test PR3‑ANCA lub MPO‑ANCA zrób tylko w przypadku klinicznego podejrzenia AAV; objawy sugerujące AAV:
– kłębuszkowe zapalenie nerek, zwłaszcza gwałtownie postępujące – krwawienie pęcherzykowe, zwłaszcza w skojarzeniu z objawami nerkowymi
– zapalenie naczyń skóry z objawami ogólnymi – liczne guzki płucne
– przewlekła destrukcyjna choroba górnych dróg oddechowych – długo trwające zapalenie zatok lub uszu
– podgłośniowe zapalenie krtani
– mononeuritis multiplex lub inna obwodowa neuropatia – masa zagałkowa
– zapalenie twardówki
testem screeningowym powinien być wysokiej jakości test antygenowoswoisty, a nie test wykonywany metodą immunofluorescencji pośredniej
w przypadku wyniku ujemnego przy silnym podejrzeniu choroby należy rozważyć wykonanie drugiego testu immunologicznego, by zwiększyć czułość badania; aby zwiększyć swoistość badania, można wykonać drugi test przy małym mianie przeciwciał w pierwszym teście
nie można wykluczyć AAV jedynie na podstawie ujemnych wyników ANCA – u seronegatywnych pacjentów należy przeprowadzić biopsję zajętych narządów
choć ANCA są niezwykle pomocne w diagnostyce AAV, diagnoza AAV powinna być oparta na objawach kliniczno‑patologicznych interpretację wyników poprawia branie pod uwagę poziomu przeciwciał i ocena wskaźnika prawdopodobieństwa AAV – ANCA‑zależne zapalenia naczyń
Międzynarodowy konsensus dotyczący
badania ANCA w ziarniniakowatości
z zapaleniem naczyń (GPA)
i mikroskopowego zapalenia naczyń (MPA)
2017
Wytyczne przedstawiono w tabeli 3. [18]
Szczegółowa analiza danych potwierdziła, że wskaź-nik prawdopodobieństwa AAV zwiększa się wraz ze zwiększeniem poziomu PR3‑ANCA i MPO‑ANCA we wszystkich testach immunologicznych objętych badaniem. Przeciwciała ANCA są niezwykle pomocne w diagnostyce ANCA‑zależnych zapaleń naczyń, jed-nak rozpoznanie powinno być ustalane przede wszyst-kim na podstawie cech klinicznych. Nawet u 15% cho-rych z AAV nie stwierdza się ich obecności, a najczę-ściej sytuacja ta dotyczy chorych na ograniczoną postać ziarniniakowatości z zapaleniem naczyń [19]. Brak prze-ciwciał ANCA w surowicy nie pozwala więc na pewne wykluczenie choroby [17]. Zdaniem autorów pracy duża czułość i swoistość oraz mniejsza pracochłonność te-stów antygenowoswoistych wykrywających PR3‑ANCA i MPO‑ANCA pozwalają na odstąpienie od wykonywania testów immunofluorescencji pośredniej.
Piśmiennictwo
1. Coons AH, Kaplan MH. Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody. J Exp Med, 1950; 91: 1–13
2. Meroni PL, Schur PH. ANA screening: an old test with new recommendations. Ann Rheum Dis, 2010; 69: 1420–1422
3. Agmon‑Levin N, Damoiseaux J, Kallenberg C, et al. International recommen‑ dations for the assessment of autoantibodies to cellular antigens referred to as anti‑nuclear antibodies. Ann Rheum Dis, 2014; 73 (1): 17–23
4. Leuchten N, Hoyer A, Brinks R, et al. Performance of antinuclear antibod‑ ies for classifying systemic lupus erythematosus: a systematic literature review and meta‑regression of diagnostic data. Arthritis Care Res, 2018; 70 (3): 428–438
5. Fanouriakis A, Kostopoulou M, Alunno A, et al. 2019 update of the EULAR recommendations for the management of systemic lupus erythematosus. Ann Rheum Dis, 2019; 78: 736–745
6. Mariz HA, Sato EI, Barbosa SH, et al. Pattern on the antinuclear anti‑ body‑HEp‑2 test is a critical parameter for discriminating antinuclear anti‑ body‑positive healthy individuals and patients with autoimmune rheumatic diseases. Arthritis Rheum, 2011; 63: 191–200
7. American College of Rheumatology. Choosing wisely – an initiative of the ABIM Foundation. Five things physicians and patients should question. www.choosingwisely.org/societies/american‑college‑of‑rheumatology/ 8. Li QZ, Karp DR, Quan J, et al. Risk factors for ANA positivity in healthy
persons. Arthritis Res Ther, 2011; 13: R38
9. Damoiseaux J, von Muhlen CA. International consensus on ANA patterns (ICAP): the bumpy road towards a consensus on reporting ANA results. Auto Immun Highlights, 2016; 7 (1): 1
10. Cohen Tervaert JW, Damoiseaux J. Antineutrophil cytoplasmic autoantibod‑ ies: how are they detected and what is their use for diagnosis, classification and follow‑up? Clin Rev Allergy Immunol, 2012; 43: 211–219
11. Savige J, Gillis D, Benson E, et al. International consensus statement on testing and reporting of antineutrophil cytoplasmic antibodies (ANCA). Am J Clin Pathol, 1999; 111: 507–513
12. Choi HK, Liu S, Merkel PA, et al. Diagnostic performance of antineutrophil cy‑ toplasmic antibody tests for idiopathic vasculitides: metaanalysis with a fo‑ cus on antimyeloperoxidase antibodies. J Rheumatol, 2001; 28: 1584–1590 13. Mahler M, Radice A, Yang W, et al. Development and performance evaluation
of novel chemiluminescence assays for detection of anti‑PR3 and anti‑MPO antibodies. Clin Chim Acta, 2012; 413: 719–726
14. Damoiseaux JG, Slot MC, Vaessen M, et al. Evaluation of a new fluores‑ cent‑enzyme immuno‑assay for diagnosis and follow‑up of ANCA‑associated vasculitis. J Clin Immunol, 2005; 25: 202–208
15. Damoiseaux J, Dähnrich C, Rosemann A, et al. A novel enzyme‑linked immu‑ nosorbent assay using a mixture of human native and recombinant protein‑ ase‑3 significantly improves the diagnostic potential for antineutrophil cyto‑ plasmic antibody‑associated vasculitis. Ann Rheum Dis, 2009; 68: 228–233 16. Vermeersch P, Vervaeke S, Blockmans D, et al. Determination of anti‑neutro‑
phil cytoplasmic antibodies in small vessel vasculitis: Comparative analysis of different strategies. Clin Chim Acta, 2008; 397: 77–81
17. Damoiseaux J, Csernok E, Rasmussen N, et al. Detection of antineutrophil cytoplasmic antibodies (ANCAs): a multicentre European Vasculitis Study Group (EUVAS) evaluation of the value of indirect immunofluorescence (IIF) versus antigen‑specific immunoassays. Ann Rheum Dis, 2017; 76: 647–653 18. Bossuyt X, Cohen Tervaert J, Arimura Y, et al. Revised 2017 international consensus on testing of ANCAs in granulomatosis with polyangiitis and mi‑ croscopic polyangiitis. Nat Rev Rheumatol, 2017; 13: 683–692
