Medycyna Wet. 2008, 64 (2) 237
Praca oryginalna Original paper
Insulinopodobne czynniki wzrostu (IGF-I i IGF-II; in-sulin-like growth factors) zaliczane s¹ do peptydów o nis-kim ciê¿arze cz¹steczkowym, promuj¹cych mitozê i ró¿-nicowanie w ró¿nych typach komórek (5, 6). Wi¹¿¹ siê one ze specyficznymi receptorami (typu I i II ) na po-wierzchni komórek docelowych oraz z ca³¹ rodzin¹ bia-³ek wi¹¿¹cych (IGFBPs; insulin-like growth factor bin-ding proteins), które równie¿ reguluj¹ dzia³anie IGF w poszczególnych tkankach. W rozrodzie ludzi i zwie-rz¹t IGF-I i IGF-II odgrywaj¹ bardzo znacz¹c¹ rolê (11). Badania wykaza³y, ¿e w endometrium macicy, jak i w na-b³onku jajowodu wystêpuj¹ receptory dla tych czynników, a ekspresja genów dla tych receptorów jest zale¿na od fazy cyklu rujowego. Wysoka koncentracja receptorów dla IGF-I i IGF-II w nab³onku jajowodu i gruczo³ów ma-cicy sugeruje, ¿e zadaniem IGF-I i IGF-II jest regulacja aktywnoci wydzielniczej b³ony luzowej w celu zapew-nienia korzystnego rodowiska dla rozwoju embrionów (11). Dowiadczenia z transferem zarodków dowiod³y, ¿e brak odpowiedniej synchronizacji rodowiska dawcy
ma-cicy i biorcy ogranicza w du¿ym stopniu mo¿liwoæ prze-¿ycia zarodków.
U koni proces implantacji oraz tworzenie siê ³o¿yska regulowany jest tak¿e po czêci przez IGF-I i IGF-II. Ba-dania Lennarda i wsp. (12) wykaza³y ekspresjê genu dla IGF-II w zarodku, a potem w p³odzie i ³o¿ysku pomiêdzy 14. a 150. dniem ci¹¿y.
Dowiedziono, ¿e IGF-I i IGF-II dzia³aj¹ mitogennie na wczesny zarodek, powoduj¹c intensywny jego wzrost (1, 5, 6, 18). Stwierdzono tak¿e, ¿e ekspresja receptorów dla tych czynników zale¿y cile od stadium, w jakim zaro-dek siê znajduje. Herrler i wsp. (7) w swych badaniach wykryli aktywnoæ IGF-I i kilka innych bia³ek wi¹¿¹cych IGF (BPs-3 binding protein) w przedimplantacyjnym za-rodku koñskim, a cile w jego b³onie, p³ynie pêcherzy-kowym i kapsule oraz mRNA dla IGFBP-3. Wykazano, ¿e IGFBP-3 jest bardzo wa¿nym czynnikiem dla prawid-³owego rozwoju zarodkowego. Czynnik ten wydzielany jest przez zarodek klaczy pocz¹wszy ju¿ od 10. dnia po zap³odnieniu. Jego dzia³anie opiera siê na stymulacji em-brionu do syntezy IGF-I, który z kolei jest bezporednim stymulatorem i protektorem jego dalszego rozwoju (9).
Stê¿enie insulinopodobnych czynników wzrostu
IGF-I i IGF-II w surowicy rebnych klaczy
w okresie oko³oimplantacyjnym*
)
LESZEK KRAKOWSKI, ZYGMUNT WRONA, KRZYSZTOF KOSTRO*, BARBARA ZDZISIÑSKA**
Zak³ad Andrologii i Biotechnologii Rozrodu Katedry i Kliniki Rozrodu Zwierz¹t Wydzia³u Medycyny Weterynaryjnej AR, ul. G³êboka 30, 20-612 Lublin
*Zak³ad Epizootiologii i Klinika Chorób Zakanych Instytutu Chorób Zakanych i Inwazyjnych
**Zak³ad Wirusologii i Immunologii Wydzia³u Biologii i Nauk o Ziemi UMCS, ul. Akademicka 19, 20-003 Lublin
Krakowski L., Wrona Z., Kostro K., Zdzisiñska B.
Serum concentration of IGF-I and IGF-II in pregnant mares during a perimplant period
Summary
In the reproduction of animals and humans, insulin-like factors (IGF-I , IGF-II) play a significant role. Among others, they stimulate growth of the ovarian follicle, embryo development, egg implantation and they inhibit cell apoptosis. In horses the implantation process and placenta development is partly regulated by IGF-I and IGF-II. Research was conducted on 18 mares during early pregnancy. The study has revealed the existence of some differences in the level of IGF-I and IGF-II. A significant increase of IGF-I in comparison to the preovulation period (311 ng/ml) was noted 12 h after ovulation (356 ng/ml), 72 h (328 ng/ml), 7 days (340 ng/ml) and at 35 (344 ng/ml) and at 55 (360 ng/ml) days of gestation. The concentration of IGF-II also increased but only at the 6th day after ovulation. The concentration of IGF-II before ovulation was 4.8 ng/ml and up until the 6 days after ovulation it ranged from 8.2 to 9.6 ng/ml. The differences in the levels of IGF-I and IGF-II before and after ovulation and during the pregnancy could result from the activation of an embryo genome and from the preparation of endometrium for implantation.
Keywords: mare, ovulation, embryo, IGF-I, IGF-II
Medycyna Wet. 2008, 64 (2) 238
Badania wykaza³y tak¿e, ¿e IGF-I posiada równie¿ zdol-noæ do wywo³ania mierci komórkowej potencjalnie ata-kuj¹cych zarodek komórek uk³adu odpornociowego (10). St¹d te¿ oprócz bezporedniego wp³ywu na rozwój em-brionu koñskiego, IGF-I i IGF-II s¹ tak¿e czynnikami o dzia³aniu immunoregulacyjnym. Dotychczas niewiele jest danych dotycz¹cych kszta³towania siê poziomów IGF-I oraz IGF-II u klaczy w okresie rozwoju wczesnej ci¹¿y.
Celem niniejszych badañ by³o okrelenie surowiczego stê¿enia IGF-I i IGF-II u klaczy w okresie oko³oimplan-tacyjnym w aspekcie wykorzystania ich w przysz³oci jako wskaników prawid³owoci implantacji.
Materia³ i metody
Badaniem objêto 18 klaczy czystej krwi arabskiej i pe³nej angielskiej w wieku 4-10 lat pochodz¹cych ze Stada Ogierów i od hodowców indywidualnych. Masa cia³a klaczy waha³a siê w granicach 400-500 kg, a warunki hodowlane i ¿ywieniowe nie budzi³y zastrze¿eñ. Ca³oæ badañ przeprowadzono w okre-sie aktywnoci p³ciowej, tj. od kwietnia do koñca czerwca.
Wybrane do badañ klacze by³y klinicznie zdrowe i wykazy-wa³y regularne cykle rujowe,
potwierdzone badaniem ultra-sonograficznym (aparat do USG Aloka SSD 500), przy u¿yciu sondy rektalnej o czês-totliwoci 5 MHz. Wszystkie klacze zosta³y poddane zabie-gowi inseminacji nasieniem wie¿ym rozrzedzonym. Mo-ment inseminacji okrelono badaniem USG i badaniem palpacyjnym jajników. Pierw-sze badania w celu stwierdze-nia ci¹¿y wykonane by³y w 14. dniu po owulacji, a nastêpnie w 21., 35. i 55. dniu.
Materia³ do badañ stano-wi³a krew, któr¹ pobrano od klaczy z ¿y³y szyjnej ze-wnêtrznej do ja³owych sili-konowych probówek typu Vacuette 9 ml (Greiner Labo-ratechnik GmbH, Austria), z przyspieszaczem wykrze-piania. Po odwirowaniu otrzyman¹ surowicê zlano do ja³owych probówek typu Eppendorf 2 ml i zamro¿ono w temperaturze 74°C. Krew do badañ pobierana by³a o tej samej porze dnia, tj. o godzi-nie 7 rano w nastêpuj¹cych przedzia³ach czasowych: tu¿ przed owulacj¹ i pierwsz¹ in-seminacj¹ (próba 0), nastêp-nie w 12., 24., 72., 96. h i w 6., 7., 10. dniu po owulacji oraz po stwierdzeniu ci¹¿y w 14., 21., 35. i 55.
Czynniki IGF-I i IGF-II oznaczono metod¹ immuno-radiometryczn¹ (IRMA) u¿y-waj¹c gotowego zestawu IGF-I i IGF-II;
Non-extrac-tion IRMA DSL, firmy Diagnostic System Laboratories, Inc, USA. Oznaczenia wykonano zgodnie z za³¹czon¹ procedur¹.
Wyniki badañ poddano komputerowej analizie statystycz-nej testem t-Studenta, wyznaczaj¹c redni¹ (x), odchylenie stan-dardowe (± SD) oraz istotnoæ ró¿nic na poziomie p £ 0,01 i p £ 0,05.
Wyniki i omówienie
rednie wartoci koncentracji IGF-I w surowicy bada-nych klaczy przedstawiono na ryc. 1. Wynika z nich, ¿e w poszczególnych okresach pobrañ istnia³y ró¿nice w stê-¿eniu IGF-I. Na krótko przed owulacj¹ stê¿enie IGF-I wynosi³o 311,8 ng/ml, natomiast w 55. dniu ci¹¿y 360,3 ng/ml. Pierwszy wyrany wzrost stê¿enia IGF-I zaobser-wowano w 12. godzinie po owulacji, a nastêpnie w 72. godzinie i 7. dniu. Jednak wzrost ten w porównaniu do stê¿enia przed owulacj¹ nie by³ statystycznie istotny. Po stwierdzeniu ci¹¿y w 14. dniu poziom IGF-I by³ porów-nywalny do stwierdzonego przed owulacj¹. Pocz¹wszy od 14. dnia ci¹¿y obserwowano ponowny, choæ statystycz-nie statystycz-nieistotny, wyrany wzrost czynnika IGF-I, który mia³
Ryc. 2. Stê¿enie IGF-II w surowicy klaczy w okresie oko³oimplantacyjnym (n = 18) (x ± SD) Objanienia: a, b, c, d istotnoæ ró¿nic pomiêdzy poszczególnymi okresami badañ przy (p £ 0,05); A, B, C, D przy (p £ 0,01) 280 290 300 310 320 330 340 350 360 370 311,8 (±93,1)311,8 (±93,1) 356,2 (±58,0)356,2 (±58,0) 314,2 (±90,6)314,2 (±90,6) 329,0 (±110,4)329,0 (±110,4) 311,4 (±80,6)311,4 (±80,6) 313,7 (±115,4)313,7 (±115,4) 340,6 (±123,8)340,6 (±123,8) 317,0 (±99,7)317,0 (±99,7) (±158,0)(±158,0)314,8314,8 319,9 (±93,4)319,9 (±93,4) 344,4 (±119,4)344,4 (±119,4) 360,4 (± 74,5)360,4 (± 74,5) 0 12 h 24 h 72 h 96 h 6 d 7 d 10 d 14 d 21 d 35 d 55 d ci¹¿a Stê¿enie IGF-I (ng/ml) po owulacji 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 4,8 (±3,0)4,8 (±3,0) aA abB c AdD aE bd d BC DE 8,2 (±5,4)8,2 (±5,4) (±4,9)(±4,9)8,28,2 9,6 (±4,2)9,6 (±4,2) 8,9 (±5,3)8,9 (±5,3) 9,5 (±3,1)9,5 (±3,1) 8,4 (±2,4)8,4 (±2,4) 7,2 (±3,5)7,2 (±3,5) (±5,2)(±5,2)7,17,1 6,0 (±3,0)6,0 (±3,0) (±3,1)(±3,1)6,16,1 4,6 (±2,2)4,6 (±2,2) 0 12 h 24 h 72 h 96 h 6 d 7 d 10 d 14 d 21 d 35 d 55 d ci¹¿a Stê¿enie IGF-II (ng/ml) po owulacji
Medycyna Wet. 2008, 64 (2) 239 miejsce kolejno w 21., 35. i 55. dniu. Nieco inaczej
kszta³-towa³a siê koncentracja IGF-II (ryc. 2). Statystycznie istot-ny wzrost stê¿enia IGF-II w porównaniu do stê¿enia sprzed owulacji stwierdzono tak¿e w 12. godzinie po owu-lacji i wzrasta³ on z ma³ymi wahaniami do 6. dnia. Nato-miast pocz¹wszy od 7. dnia stê¿enie IGF-II stopniowo siê obni¿a³o i w 55. dniu ci¹¿y zbli¿y³o siê do stê¿enia, jakie stwierdzono przed owulacj¹.
Koncentracja IGF-I we krwi cz³owieka i zwierz¹t do-mowych jest relatywnie sta³a. Posiada on doæ d³ugi okres pó³trwania i nie podlega rytmowi dziennemu (2). Liczni autorzy (2, 4, 8, 14 ,15) podkrelaj¹ jednak, ¿e na stê¿e-nie IGF-I we krwi ma wp³yw du¿o czynników, takich jak: p³eæ, wiek, masa cia³a oraz ¿ywienie. Badania Malinow-skiego i wsp. (14) wykaza³y, ¿e u koni najwy¿sze stê¿e-nie IGF-I notuje siê u osobników m³odych do 9. miesi¹ca ¿ycia, natomiast u klaczy starszych znacz¹co siê ono ob-ni¿a. Podobnym czynnikiem ró¿nicuj¹cym jest p³eæ zwie-rzêcia, gdy¿ wy¿sze stê¿enia IGF-I notowano u ogierów ni¿ u klaczy (2).
W ostatnich latach podkrela siê znacz¹c¹ rolê IGF-I i IGF-II w procesach rozrodczych u ludzi i zwierz¹t. Wie-le uwagi powiêcono roli, jak¹ spe³niaj¹ te czynniki we wczesnym rozwoju zarodkowym i utrzymaniu ci¹¿y. W opinii wielu autorów wp³ywaj¹ one, miêdzy innymi, na szybki rozwój zarodka, hamuj¹ proces apoptozy za-rodkowej oraz u³atwiaj¹ jego implantacjê (1, 7, 9, 12, 13, 16, 17, 19). Znaczenie obu czynników podkrela fakt na-zwania ich czynnikami prze¿ycia. Ponadto badania do-wiod³y, ¿e czynnik IGF-I w znacz¹cy sposób wp³ywa tak¿e na rozwój pêcherzyka jajnikowego i produkcjê hormo-nów steroidowych (1, 3, 9).
Badania w³asne wykaza³y, ¿e wzrost stê¿enia IGF-I i IGF-II przypada³ na doæ wa¿ne dla rozwoju zarodka okresy. Mo¿na zatem domniemywaæ, ¿e wzrost stê¿enia IGF-I obserwowany w 12., 72. godzinie i 7. dniu po owu-lacji móg³ mieæ zwi¹zek z aktywacj¹ genomu zarodka i przygotowaniem endometrium macicy do dalszego jego rozwoju. W tym wa¿nym okresie zarodek nabiera zdol-noci do pe³nego kontaktu z otaczaj¹cym go rodowiskiem jajowodu i macicy. Badania przeprowadzone in vitro przez Waltersa i wsp. (18) w sposób jednoznaczny potwierdza-j¹ korzystny wp³yw czynnika IGF-I na wczesny rozwój embrionu klaczy. Do podobnych wniosków doszli Herr-ler i wsp. (7). Autorzy ci zauwa¿yli, ¿e zarodki przetrzy-mywane w p³ynie do hodowli z dodatkiem IGF-I rozwi-ja³y siê lepiej i nie obserwowano u nich symptomów apop-tozy, w przeciwieñstwie do zarodków hodowanych bez dodatku tego czynnika. Ponowny wzrost poziomu IGF-I, który obserwowano w 21., 35. i 55. dniu ci¹¿y, móg³ byæ zwi¹zany z przygotowaniem endometrium do implanta-cji. Po krótkiej wêdrówce zarodka w macicy nastêpuje jego zagnie¿d¿enie, które ma miejsce ju¿ 18. dnia, nato-miast pocz¹tek implantacji 35. dnia. Wynika z tego, ¿e IGF-I jest czynnikiem o bardzo istotnym znaczeniu w pro-cesie implantacji.
Analizuj¹c wzrost stê¿enia IGF-II, który nastêpowa³ do 6. dnia po owulacji, mo¿na przypuszczaæ, ¿e wzrost ten móg³ byæ zwi¹zany, podobnie jak w przypadku IGF-I, z rozwojem zarodka i zmianami w endometrium macicy. Z danych pimiennictwa wynika, ¿e oddzia³ywanie i wzrost zawartoci obu czynników w okresie
embrioge-nezy jest podporz¹dkowany dzia³aniu estrogenów (1, 9, 12, 17, 18). Pod wp³ywem tych hormonów blastocysta generuje uwalnianie IGF-I i IGF-II, które w sposób auto-krynny przyczyniaj¹ siê do prawid³owego wzrostu za-rodka.
Do uzyskanych wyników nale¿y podejæ z pewn¹ re-zerw¹, gdy¿ jest zbyt ma³o danych dotycz¹cych kszta³to-wania siê surowiczego stê¿enia IGF-I i IGF-II u klaczy w okresie wczesnej ci¹¿y. Brakuje tak¿e danych referen-cyjnych u koni, poniewa¿ liczne laboratoria na wiecie uzyskiwa³y zró¿nicowane wyniki, u¿ywaj¹c ró¿nych me-tod badawczych. W zwi¹zku z tym interpretacja nych wyników staje siê trudna. Na standaryzacjê uzyska-nych wyników oraz dok³adnego okrelenia roli czynni-ków wzrostu w rozrodzie zwierz¹t mo¿e pozwoliæ konty-nuacja tego rodzaju badañ.
Pimiennictwo
1.Carneiro G., Lorenzo P., Pimentel C., Pegoraro L., Bertolini M., Ball B., Anderson G., Liu I.: Influence of insulin-like growth factor-I and its interaction with gonadotropins, estradiol, and fetal calf serum in vitro maturation and parthenogenic development in equine oocytes. Biol. Reprod. 2001, 56, 889--905.
2.Champion Z. J., Breier B. H., Ewen W. E., Tobin T. T., Casey P. J.: Blood plasma concentration of insulin-like growth factor-I (IGF-I) in resting standardbred horses. Vet. J. 2002, 163, 45-50.
3.Davidson T. R., Chamberlain C. S., Bridges S., Spicer L. J.: Effect of follicle size on in vitro production of steroids and insulin-like growth factor (IGF-I), IGF-II, and the IGF-binding proteins by equine ovarian granulosa cells. Biol. Reprod. 2002, 66, 1640-1648.
4.Deichsel K., Aurich J., Parvizi N., Bruckmaier R. M., Aurich C.: LH and IGF-I release during oestrus and early luteal phase in lactating and non-lactating horse mares. Anim. Reprod. Sci. 2006, 91, 97-106.
5.Fabian D., Ilkova G., Rehák P., Czikková S., Baran V., Koppel J.: Inhibitory
effect of IGF-I on induced apoptosis in mous preimplantation embryos cultured in vitro. Theriogenology 2004, 61, 745-755.
6.Fabian D., Koppel J., Maddox-Hyttel P.: Apoptosis processes during mam-malian preimplantation development. Theriogenology 2005, 64, 221-231. 7.Herrler A., Krusche C. A., Beier H. M.: Insulin and insulin-like growth factor-I
promote rabbit blastocyst development and prevent apoptosis. Biol. Reprod. 1998, 59, 1302-1310.
8.Hess-Dudan F., Vacher P. Y., Bruckmaier R. M., Weishaupt M. A., Burger D., Blum J. W.: Immunoreactive insulin-like growth factor I and insulin in blood plasma and milk of mares and in blood plasma of foals. Equine Vet. J. 1994, 26, 134-139.
9.Hul K. L., Harvey S.: Growth hormone: role in female reproduction. J. Endo-crinol. 2001, 168, 1-23.
10.Kooijman R.: Regulation of apoptosis by insulin-like growth factor (IGF)-I. Cytokine 2006, 17, 305-323.
11.Kurpisz M.: Molekularne podstawy rozrodczoci cz³owieka i innych ssaków. Termedia Wydawnictwa Medyczne, Poznañ 2002, s. 152.
12.Lennard S. N., Stewart F., Allen W. R.: Insulin-like growth factor II gene expres-sion in the fetus and placenta of the horse during the first half of gestation. J. Reprod. Fertil. 1995, 103, 169-179.
13.Letcher R., Simmen R. C., Bazer F. W., Simmen F. A.: Insulin-like growth factor-I expression during early conceptus development in the pig. Biol. Reprod. 1989, 41, 1143-1151.
14.Malinowski K., Christensen R. A., Hafs H. D., Scanes C. G.: Age and breed differencens in thyriod hormones, insulin-like growth factor (IGF-I) and IGF binding proteins in female horses. J. Anim. Sci. 1996, 74, 1936-1942. 15.Ozawa A., Inokuma H., Johke T.: The relationship between plasma insulin-like
growth factor-I (IGF-I) level and body weight in the horse. J. Vet. Med. Sci. 1995, 57, 1105-1107.
16.Popot M. A., Bobin S., Bonnaire Y., Delahaut P. H., Closset J.: IGF-I plasma concentrations in non-treated horses and horses administered with methionyl equine somatotropin. Res. Vet. Sci. 2001, 71, 167-173.
17.Schäfer-Somi: Cytokines during early pregnacy of mammals: a review. Anim. Reprod. Sci. 2003, 75, 73-94.
18.Walters K. W., Roser J. F., Anderson G. B.: Maternal-conceptus signalling during early pregnancy in mares: oestrogen and insulin-like growth factor I. Reprod. 2001, 121, 331-338.
19.Yimaz A., Davis M. E., Simmen R. C. M.: Analysis of female reproductive traits in Angus beef divergently selected for blood serum insulin-like growth factor I concentration. Theriogenology 2006, 65, 1180-1190.
Adres autora: dr hab. Leszek Krakowski, prof. nadzw. AR, ul. Królowej Jadwigi 6/28, 20-282 Lublin; e-mail: Leszek.Krakowski@ar.lublin.pl
