K
osmos
Numer 1 (234) Strony 105-114 PROBLEMY NAU KBIO LO G ICZNYĆH___________ Polskie Towarzystwo Przyrodników im. KopernikaPanu Profesorowi Lechowi Wojtczakowi z wdzięcznością za wieloletnią współpracę, dzięki której AG = RTbiflAz]/[Ai]) + zFAV znaczy więcej
Sł a w o m i r Pi k u ł a
Instytut Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego PAN Pasteura 3, Warszawa
ATPaza Z BŁON SARKOPLAZMATYCZNEGO RETIKULUM, TRANSPORTUJĄCA JONY WAPNIA
„I was always led in research by my conviction that the primitive basic functions of living matter are brought about by ions, ions being the only powerful tools which life found in the sea water where it originated” Albert Szent-Gyórgyi, Studies from the Institute o f Medical Chemistry,
University of Szeged, 1941
AKTYWNY TRANSPORT JONOW
Różnice pomiędzy składem chemicznym środowiska pozakomórkowego a cytoplazmą i wnętrzem organelli komórkowych wynikają z przebiegu procesów życiowych, ale stanowią również ich podstawę. Różnice te powstają dzię ki właściwości błon biologicznych, polegającej na selektywnym transporcie różnorodnych sub stancji chemicznych, a zatem na utrzymywaniu równowagi pomiędzy procesami nieskrępowa nego kontaktu wymienionych środowisk i za chowania ich odrębności. Transport bardzo wielu związków chemicznych i substancji orga nicznych przez błony biologiczne zachodzi wbrew ich elektrochemicznemu gradientowi i dlatego wymaga wydatku energii. Pierwotnym źródłem tej energii jest światło dla organizmów fotosyntetyzujących lub procesy oddechowe dla organizmów heterotroficznych. W komórkach organizmów eukariotycznych wykorzystanie obu źródeł energii prowadzi do powstania ele ktrochemicznego gradientu stężeń protonów (siła protonomotoryczna — A|ih+) w płasz czyźnie poprzecznej błon wyspecjalizowanych organelli komórkowych, mitochondriów i chlo roplastów ( N i c h o l l s i współaut. 1992, D e M e is
1993, S k u l a c h e v 1994). Oba składniki A u h + , chemiczny gradient stężeń protonów i elektry czny potencjał błonowy, mogą bezpośrednio służyć jako siła napędowa transportu różnych
substancji w płaszczyźnie poprzecznej błon. W błonie plazmatycznej, gdzie znajdują się ważne systemy transportu odpowiedzialne za przeży cie komórki, energia w takiej formie nie jest wykorzystywana w sposób bezpośredni. Dlate go też w mitochondriach AgH+ ulega zamianie na chemiczny związek przejściowy, adenozyno- trójfosforan (ATP), w wyniku działalności syn- tazy ATP (powszechnie określanej mianem ATP- azy typu FoFi). ATP jest transportowany z mi tochondriów do cytoplazmy przez translokazę nukleotydów adeninowych zależną od potencja łu transmembranowego, która katalizuje ele- ktrogenną wymianę ATP/ADP/AMP ( A p r i l l e 1993). Zmagazynowana w ATP energia jest przekształcana z powrotem w elektrochemiczny gradient stężeń jonów w płaszczyźnie poprze cznej błon, dzięki czemu zachodzi przez nie aktywny transport substancji. W błonach endo- somów, lizosomów i pęcherzyków wydzielni- czych ATP jest zużywany na powtórne wytwo rzenie AąH+ w wyniku działania ATPaz typu V ( F i l l i n g a m e 1996), enzymów przypominają cych mitochondrialną ATPazę typu FoFi. W płaszczyźnie poprzecznej błony plazmatycznej, dzięki hydrolizie ATP i uwolnionej w ten sposób energii, wytwarza się elektrochemiczny gra dient stężeń jonów, przeważnie jednak nie H+, a raczej Na+, K+ i Ca2+. W procesie tym biorą
się w znaczny sposób od ATPaz typu V i F0F1
( N i c h o l l s i współaut. 1992, D e M e is 1993, In e s i 1994, F i l l i n g a m e 1996). Różnice te doty czą nie tylko struktuiy wymienionych białek, ale przede wszystkim mechanizmu katalizowa nej przez nie reakcji. W przypadku ATPaz typu P w cyklu katalitycznym enzymów tej klasy zachodzi autofosforylacja białka, zjawisko nie znane wśród innych typów ATPaz. Powstanie gradientu stężeń kationów (na przykład Na+) w płaszczyźnie poprzecznej błony wymaga bezpo średniego zużycia energii zmagazynowanej w ATP, w tym przypadku przez Na+,K+-ATPazę, i transport jonów określany jest mianem pier wotnego transportu czynnego. Mechanizm tego typu transportu zakłada istnienie pojedynczego białka wytwarzającego elektrochemiczny gra dient stężeń nieorganicznego kationu (In e s i
1994, A n d e r s e n i Y i l s e n 1995). Elektrochemi
ny jako siła napędowa wielu procesów trans portowych (wtórny transport czynny). We wszy stkich przypadkach transport związków organi cznych, istotnych dla przeżycia komórki, takich jak aminokwasy czy glukoza, lub produktów końcowych ich metabolizmu, których komórka musi się pozbyć, odbywa się z udziałem specy ficznych białek transportujących.
Opisany model, czerpiący z podstaw teorii chemiosmotycznej Mitchella ( N i c h o l l s i współ aut. 1992, D e M e i s 1993, K r u p k a 1994, S k u la - CHEV 1994) zyskał powszechną akceptację mię dzy innymi ze względu na podobieństwa pomię dzy ATPazami, choć funkcje jakie pełnią te en zymy mogą być tak różne, jak produkcja kwasu w żołądku, uwalnianie neurotransmiterów czy synteza ATP w trakcie fotosyntezy (D e M e is 1993, C a r a f o l i 1994, C a r a f o l i i S t a u f f e r 1994, M o l l e r i współaut. 1996).
EWOLUCJA ATPaz TYPU P
Wszystkie żyjące na naszej planecie organi zmy pochodzą prawdopodobnie od jednego wspólnego przodka. W wyniku procesu dywer gencji wyewoluowały ostatecznie w trzy królew- stwa: Eubakteriae, Archaebakteriae i Eukariota (Iw a b e i współaut. 1989, B r o w n i D o o l i t t l e 1995). W tym samym czasie ewoluowały białka odpowiedzialne za transport elektrolitów i me tabolitów do i z komórki. Mimo że białka te wykorzystują różne źródła energii, a także róż nią się mechanizmami transportu, wykazują zadziwiające podobieństwa w budowie. Podo bieństwa te opierają się na istnieniu jednostki funkcjonalnej składającej się z ciasno upako wanych sześciu struktur cc-helikalnych, które mogą stanowić całość lub część kanału błono wego. Wydaje się, że niektóre z rodzin białek transportujących powstały na drodze konwer gencji, inne ze wspólnej cząsteczki prekursoro- wej na drodze dywergencji. Proces ten zacho dził w różnym czasie w toku ewolucji ( S a i e r
1993).
Na podstawie budowy i mechanizmu działa nia można wyróżnić następujące rodziny białek transportujących: a) kanały jonowe zależne od potencjału błonowego; b) główne integralne białka błonowe (MIP, ang. major intrinsic pro tein, białko z komórek włóknistych soczewek ssaków, ChIP, białko tworzące porę dla wody w błonie ludzkich erytrocytów.); c) uniportery, symportery i antyportery (MFS, ang. major fa cilitator superfamily; APC, ang. transport pro teins specific for amino acids, polyamines and choline; SSF, ang. sodium: solute symporter
family; SNF, ang. sodium:neurotransmitter symporters family); d) mitochondrialne białka nośnikowe; e) permeazy bakteryjne i f) systemy transportu wykorzystujące energię zmagazyno waną w ATP (ATPazy typu P, V , FoFi, transpo rtery należące do rodziny ABC, ang. ATP bin ding casette ) ( S a i e r 1993). W oparciu o dane zgromadzone na temat różnych ATPaz typu P, szczególnie transportujących jony Cu+, Cd2+ i Hg2+ (podtyp Pi) ( L u t s e n k o i K a p la n 1995, S o l i oz i V u l p e 1996), przypuszcza się że proATP- azy organizmów prokariotycznych powstały w trakcie ewolucji w celu regulacji stężenia jonów metali ciężkich w cytoplazmie komórek tych organizmów ( M o l l e r i współaut. 1996) (rys. 1). Większość występujących we współczesnych organizmach ATPaz typu P należy do podtypu P2, grupującego białka zdolne do transportu kationów o niższych masach atomowych (H+, Na+, K+, Ca2+). Różna specyficzność tych en zymów w stosunku do transportowanych jo nów jest związana prawdopodobnie ze zwię kszoną liczbą domen transbłonowych (M10- M 11), w porównaniu z podtypem Pi (M6) ( G r e e n
1992, L u t s e n k o i K a p la n 1995, M o l l e r i współaut. 1996). Trzeci podtyp P3 (KdpABC- -ATPazy) pod względem specyficzności w sto sunku do transportowanych jon ów metali przypomina podtyp P2 z wyjątkiem tego, że
enzymy tej grupy nie są zdolne do transportu kationów jako białka monomeryczne, a jedynie jako składnik bardziej skomplikowanego syste
mu katalitycznego ( L u t s e n k o i K a p la n 1995, S o l i oz i V u l p e 1996).
Rys. 1. Drzewo filogenetyczne ATPaz typu P.
ATPazy typu P istniały ju ż we wczesnych etapach rozwoju orga nizmów żywych na naszej plane cie, chociaż nie pełniły jeszcze w tym czasie kluczowej roli w utrzy maniu homeostazy kationów w cy- toplazm ie. U zaran ia ew olucji doszło do podziału enzymów tej grupy na białka transportujące jo ny metali ciężkich (typ I) i jony metali o niższych masach atomo wych (typ II). Typ II w swej pierwot- nej fo rm ie p rz e trw a ł do współczesnych czasów w postaci K d p A B C -A T P a z o rg a n izm ó w p ro k a rio ty c z n y c h , ta k ich ja k Mg2+-ATPaza S. typhimurium i Ca2+-ATPaza Synechococcus PC- C7942. ATPazy te zalicza się do podtypu P3. ATPazy SERCA, jak k olw iek w niew ielkim stopniu p rz y p o m in a ją c e Ca2+-ATPazy współczesnych organizmów, wy e w o lu o w a ły p ra w d o p o d o b n ie przed pow staniem organizm ów wielokomórkowych. Na+,K+-ATP- aza i H+,K+-ATPaza pochodzą od ATPaz SERCA, z którymi tworzą wspólny podtyp P2A. Enzymy te różnią się od ATPaz SERCA obe cnością podjednostki p. ATPazy PMCA i H+-ATPaza oddzieliły się wcześniej na drabinie ewolucyjnej od ATPaz SERCA, tworząc podtyp P2B, o czym świadczą istotne róż nice pomiędzy obiema grupami enzymów. W komórkach roślin i grzybów H+-ATPazy przejęły od ATPaz typu F0F1 funkcję transpo rtu protonów w płaszczyźnie po przecznej błony plazm atycznej (Mo l le r i współaut. 1996).
POMPY WAPNIOWE
2+
Ca -ATPazy (pompy wapniowe) są niezbęd ne w procesie usuwania Ca + z cytozolu zarów no przez błonę plazmatyczną na zewnątrz ko mórki, lub do przestrzeni wewnętrznej systemu kanalików i cystern błon endo(sarko)plazma- tycznego retikulum (ER lub SR). Jakkolwiek Ca2+-ATPazy z błony plazmatycznej i błon ER są bardzo do siebie podobne pod względem strukturalnym i pełnionej funkcji, istnieje efe ktywny mechanizm molekularny, który jest od powiedzialny za to, że właściwe białka są wbu dowywane w odpowiednie błony w trakcie pro cesu biogenezy (F o le tti i współaut. 1995). Biał ka Ca +-ATPaz występujących w błonie plazma tycznej są kodowane przez cztery geny (PMCA1,
PMCA2, PMCA3 i PMCA4), a w błonach we
wnątrzkomórkowych przez trzy [SERCA 1, SER-
CA2 i SERCA3) ( G r o v e r i K h a n 1992, W u i współaut. 1995). Izoformy PMCA1 i 4 występują w większości komórek, podczas gdy izoformy
PMCA2 i 3 tylko w błonie komórek wyspecjali
zowanych tkanek. Proces różnicowego składa nia (ang. alternative splicing) RNA prowadzi dodatkowo do zwiększenia liczby izoform enzy mu ( G r o v e r i K h a n 1992, C a r a f o l i 1994, C a r a - f o l i i S t a u f f e r 1994). Izoformy te różnią się czułością na fosforylację przez zależną od cykli cznych nukleotydów kinazę białkową.
Pompy wapniowe z błony plazmatycznej są stymulowane przez kalmodulinę, podczas gdy
CA2 są stymulowane przez fosfolamban. Enzym
będący produktem ekspresji genu SERCA3 ule ga fosforylacji przez zależną od cAMP kinazę białkową (G r o v e r i Khan 1992, MacLennan i
T o y o fu k u 1992). W przypadku genów rodziny
SERCA, podobnie do PMCA, został także opisa
ny proces różnicowego składania i wykazano, że ekspresja powstających izoform jest specyficz na dla tkanki i może ulegać zaburzeniu w wy niku transformacji nowotworowej. Zróżnicowa nie tkankowe rozmieszczenia izoform Ca +- -ATPaz oraz różne mechanizmy regulacji tych enzymów są odpowiedzialne za różnice w odpo wiedzi komórek na pobudzenie oraz za ich róż ną plastyczność (G r o v e r i Khan 1992).
Ca2+-ATPaza z błony plazmatycznej, białko o masie cząsteczkowej 140 kDa, jest odpowie dzialna za regulację stężenia Ca2+ w komórce, a zatem jest zaangażowana w szeregu proce sach, w których niewielkie zmiany stężenia Ca2+ ogrywają kluczową rolę (C a r a fo li 1994,
C a r a fo li i S t a u f f e r 1994). Aktywność enzymu jest regulowana na wiele sposobów, oprócz kal- moduliny, między innymi przez anionowe fosfo lipidy, fosforylację przez kinazy białkowe, a tak że proces oligomeryzacji cząsteczek enzymu
(C a r a fo li 1994). C-końcowy rejon cząsteczki AT
Pazy, oddziałując z domemą położoną w pobliżu centrum aktywnego enzymu, obniża jego aktyw ność w stanie spoczynkowym (C a r a fo li i S t a u f
f e r 1994). Transportującą jony wapnia ATPazę
z błon ER(SR), białko o masie cząsteczkowej 110 kDa, charakteryzuje funkcjonalny związek po- między domeną katalityczną enzymu, zlokalizo waną w części łańcucha polipeptydowego ekspo nowanej do cytoplazmy (miejsce auto fosforylacji), a rejonem odpowiedzialnym za wiązanie Ca , zanurzonym w dwuwarstwie lipidowej. Domeny
na obie wpływa związanie specyficznego inhibi tora ATPazy, tapsigarginy, z cząsteczką białka
(A n d e rs e n i V ils e n 1995, H ussain i współaut. 1995, W a ld r o n i współaut. 1995, M a r to n o s i
1996). Opisany związek funkcjonalny stanowi mechanistyczną podstawę procesu translokacji Ca2+ w płaszczyźnie poprzecznej błony (M a r t o
nosi i współaut. 1987, M a r to n o s i 1996). Regu
lacja cyklu skurczowo-rozkurczowego mięśni szkieletowych jest osiągana w wyniku zależnego od ATP transportu Ca2+ przez błonę SR (M e lz e r
i współaut. 1995). Proces ten ma znaczenie uni wersalne, nie tylko w kontroli ruchliwości, a także metabolizmu komórek.
Pełna maszyneria molekularna procesu transportu Ca2+ zawiera się jedynie w cząstecz ce Ca -ATPazy (M acLennan i współaut. 1985,
M a r to n o s i i współaut. 1987, M acLennan i T o y o fu k u 1992, D e M e is i współaut. 1996, M a r
t o n o s i 1996). Aktywny transport Ca2+ jest ste-
chiometrycznie związany z hydrolizą ATP. W cyklu katalicznym Ca2+-ATPazy można wyróżnić następujące fazy: związanie dwóch jonów wapnia do miejsc w cząsteczce enzymu o wysokim powi nowactwie w konformacji Ei, po którym nastę puje fosforylacja grupy karboksylowej (3 reszty kwasu asparaginowego (w pozycji 351 łańcucha polipeptydowego ATPazy) w centrum aktywnym enzymu (ufosforylowany pośrednik, E-P) i po wstanie przejściowej formy Ca2+-Ei-P. Zmiana konformacji enzymu z formy E i do E2 (Ca +-Ei- P) prowadzi do translokacji i uwolnienia Ca + do wnętrza kanalika SR (M a r to n o s i 1995,
1996) (rys. 2). Przejście enzymu z formy E i w formę E2 charakteryzuje się zmianami struktu
ry drugorzędowej białka, powstaniem nowych struktur a-helikalnych i zmianami w zawartości struktur (3 (M a r to n o s i 1996).
Rys. 2. Schemat reakcji składających się na cykl katalityczy Ca -ATPazy z błon SR. Hydroliza A IP prowadzi do autofosforylacji białka enzymatycznego i transportu dwóch jonów wapnia w płaszczyźnie poprzecznej błony. Szczegółowe wyjaśnienia zamieszczono w tekście artykułu.
Ca2+-ATPaza W REGULACJI STĘŻENIA JONÓW WAPNIA W KOMÓRCE
Komórki zużywają energię między innymi na obniżenie stężenia Ca2+ w cytozolu do bardzo niskich wartości. Zewnątrzkomórkowy Ca2+, wchodzący do komórki przez kanały wapniowe w błonie plazmatycznej, jest z powrotem trans portowany na zewnątrz przez zależną od kalmo duliny Ca2+-ATPazę lub wymieniacz Na+/Ca2+. Pula jonów wapnia, która wchodzi do komórki, jest bardzo szybko usuwana przez Ca2+-ATP-
azę, która ma zdolność akumulacji Ca2+ w wyspecjalizowanych przedziałach ER (lub SR), wbrew gradientowi stężeń tego jonu, kosztem rozkładu wysokoenergetycznego wiązania fo sforanowego w cząsteczce ATP ( M a r t o n o s i i współaut. 1987, D e M e i s 1993, C a r a f o l i
1994). W wyniku akumulacji Ca2+jego stężenie w ER może wzrosnąć 10000-krotnie; jakkol wiek kation ten nie występuje w formie wolnej, lecz przede wszystkim związanej z białkami wiążącymi Ca2+ ( M i l n e r i współaut. 1992). Po dobną zdolnością akumulacji charakteryzują się inne organelle komórkowe, jądro i mito chondria, lecz proces ten jest w przypadku tych organelli mniej wydajny.
Stymulacja komórek przez hormony, czyn niki wzrostu i neurotransmitery, które są wią zane przez specyficzne receptory błonowe, pro wadzi do wzrostu stężenia wewnątrzkomór kowego Ca2+. Uruchamiana jest wtedy kaskada zdarzeń prowadząca od zmian konformacyj- nych receptora po związaniu ligandu, poprzez białka G aż do aktywacji fosfolipazy C-(3. Ten ostatni enzym hydrolizuje 4,5-bisfosforan fosfa- tydyloinozytolu. Powstający (l,4,5)-trisfosforan inozytolu (InsPs) wiąże się z receptorem dla tego związku zlokalizowanym w błonach ER. Recep tor InsP3 został oczyszczony (składa się on z
czterech homologicznych peptydów o m. cz. 250 kDa każdy), a jego sekwencja jest poznana. Zrekonstruowany do błony lipidowej wykazuje cechy kanału. W komórce związanie ligandu z receptorem InsP3 powoduje uwolnienie Ca2+ do cytoplazmy (< 30 msek). Podtrzymywanie sty mulacji komórki prowadzi do autodegeneracji receptora i proces ten może być odpowiedzialny za regulację odpowiedzi komórki na pobudze nie. Wydaje się, że stymulacja komórki jest
związana z oscylacją wewnątrzkomórkowego stężenia Ca2+, a częstość oscylacji, ale nie am plituda, zależy od stężenia ligandu (hormonu) ( G r o v e r i K h a n 1992, B e r r i d g e 1995, M e l z e r i współaut. 1995).
Kiedy w organizmie kręgowca włókno mięś nia szkieletowego ulegnie pobudzeniu przez im puls nerwowy, powstający potencjał błonowy ulega w ciągu milisekund rozprzestrzenieniu z miejsca pobudzenia wzdłuż całego włókna. Fala potencjału, docierając do systemu błon poprze cznych kanalików komórki mięśniowej, powo duje wypływ Ca2+ z cystern terminalnych SR, bowiem w komórkach mięśni szkieletowych wy stępuje wyspecjalizowana forma kanału uwal niającego Ca2+ z systemu błon SR, będącego jednocześnie receptorem alkaloidu roślinnego, rianodyny ( M e l z e r i współaut. 1995). Wzrost stężenia jonów wapnia w cytoplazmie jest bez pośrednią przyczyną skurczu mięśnia, gdyż Ca2+ wiążąc się z troponiną C inicjuje w ten sposób skurcz mięśnia. Proces kończy się w wyniku obniżenia stężenia Ca2+ w cytozolu ko mórki mięśniowej, dzięki działaniu Ca2+-ATPa- zy, która katalizuje transport Ca2+ do wnętrza błon SR kosztem energii zmagazynowanej w ATP ( M a r t o n o s i i współaut. 1987, M e l z e r i współaut. 1995). Od momentu odkrycia enzy mu 30 lat temu znacznie wzrosła liczba danych na temat struktury i funkcji enzymu. Gen ko dujący izoformę ATPazy z błon SR mięśni szkie letowych szybkich (SERCA1), a także geny ko dujące inne izoformy enzymu, zostały sklono wane oraz przeprowadzono funkcjonalną eks presję wymienionych białek w komórkach COS-
1 (A n d e r s e n i S o r e n s e n 1996). Dzięki zebra nym informacjom zaproponowano model ki netyczny opisujący m echanizm transportu Ca + (D e M e i s 1993, I n e s i 1994, K r u p k a 1994, H a o i F I a r v e y 1995, M i n t z i G u i l l a i n 1995, C a n e t i współaut. 1996) oraz wykazano istnie nie ścisłych zależności pomiędzy transportem Ca2+ a strukturą ATPazy ( A n d e r s e n i V i l s e n 1995, M a r t o n o s i 1995, 1996) (rys. 3). Wiedzę tę zdobyto między innymi dzięki otrzymaniu i analizie rentgenograficznej kryształów Ca2+- ATPazy.
KRYSZTAŁY Ca2+-ATPazy
Precyzyjna wiedza na temat struktury ma- kromolekuł: białek, kwasów nukleinowych, zło żonych lipidów i cukrów stanowi podstawę dla zrozumienia ich funkcji. Metody krystalografi
czne stanowią nadal jedno z podstawowych narzędzi, które pozwala uzyskać taką wiedzę ( M a r t o n o s i i współaut. 1991). Do chwili obe cnej poznano atomową strukturę ponad 500
nich to integralne białka błonowe, takie jak składniki centrów fotosyntetycznych bakterii purpurowych, kompleks białek fotosystemu II z chloroplastów roślin wyższych, białka fotosy stemu I z ciepłolubnych cyjanobakterii, bakte- riorodopsyna, poryna i maltoporyna z E. coli oraz syntaza prostaglandyny H ssaków ( M a r t o - n o s i i współaut. 1991).
W przypadku Ca2+-ATPazy z błon SR mięśni szkieletowych stwierdzono, że dwa różniące się od siebie typy kryształów białka powstają w błonach SR w wyniku stabilizacji enzymu w jednej z dwóch form konformacyjnych Ei lub E2 ( M a r t o n o s i i współaut. 1991). Typ o symetrii
P2, indukowany przez jony wanadowe w środo wisku pozbawionym Ca2+, jest zbudowany z łańcuchów dimerów ATPazy układających się w prawoskrętną helisę. Odpowiada on strukturze i oddziaływaniom enzymu w konformacji E2. W
obecności 0,1 mM CaCb lub stechiometrycz- nych stężeń jonów metali z grupy lantanowców (w środowisku o pH 8,0) w SR powstają kryszta ły o symetrii P I, które są zbudowane z mono merów ATPazy w konformacji Ei. Jakkolwiek
dla określenia makroskopowego kształtu czą steczki enzymu i charakteru oddziaływań po między białkami w błonie, rozdzielczość w tym przypadku stanowiła granicę nie do przekrocze nia. Nie można było zatem odpowiedzieć na pytanie, w jaki sposób Ca2+ są transportowane przez ATPazę na poziomie molekularnym ( M a r t o n o s i i współaut. 1991). Stąd konieczne było otrzymanie właściwych trójwymiarowych kry ształów ATPazy, rosnących w roztworze do wy miarów, które pozwoliłyby na ich analizę z za stosowaniem metody dyfrakcji promieni X. By uzyskać takie właśnie kryształy białka należało spełnić między innymi następujące wymagania: a) znaleźć warunki przeprowadzenia białka bło nowego w formę rozpuszczalną, najbardziej zbliżone do warunków naturalnych czyli najle piej naśladujące środowisko błonowe w celu zachowania aktywności enzymu ( P i k u ł a i współaut. 1988, 1994), b) zapobiec inaktywacji enzymu, spowodowanej procesami denaturacji, oksydacji i proteolizy, c) stworzyć warunki, w których specyficzne oddziaływania pomiędzy hydrofitowymi rejonami cząsteczek ATPazy bę
Rys. 3. Model przedstawiający rozmieszczenie domen funkcjonalnych w cząsteczce Ca2+-ATPazy z błon SR, opracowany na podstawie przewidywań struktury drugorzędowej białka w oparciu o sekwencję aminokwasową enzymu.
Na rysunku zaznaczono dziesięć segmentów transmembranowych (M 1 -M 1 0 ), a także te domeny w cząsteczce białka enzymatycznego, w obrębie których mutacje punktowe reszt aminokwasowych prowadziły do utraty przez ATPazę zdolności do wiązania Ca2+ lub transportu kationów (oznaczono jako miejsce wiązania jonów wapnia) (Ma cLe n n a ni współaut. 1985,
dą przeważały nad oddziaływaniami hydrofobo wymi prowadzącymi do agregacji cząsteczek en zymu (Ta y l o r i współaut. 1988). W wyniku długoterminowej stabilizacji aktywności ATP azy po rozpuszczeniu enzymu w obecności wła ściwego detergentu (Pi k u ł a i współaut. 1988) zaobserwowano powstawanie trójwymiarowych struktur krystalicznych enzymu (Ta y l o r i współaut. 1988). Stwierdzono, że za powstawa nie krystalicznych struktur enzymu jest odpo wiedzialny wywołany przez Ca2+ proces oli- gomeryzacji cząsteczek ATPazy (Ke r e s z t e s i współaut. 1989).
Opierając się na powyższych kryteriach otrzymano kryształy białka, których analiza po zwoliła na zrekonstruowanie kształtu cząstecz ki enzymu z rozdzielczością 1,4 nm (To y o s h i m a i współaut. 1993, St o k e s i współaut. 1994) (rys. 4), potwierdzającego istnienie hydrofilowe- go kanału w białku, przez który Ca + są trans portowane do wnętrza kanalików SR. Model ten został potwierdzony także z zastosowaniem in nych metod (Ba y l e i współaut. 1995). Analiza krystalograficzna nie pozwala jednak ściśle od powiedzieć na pytanie, jaki jest molekularny mechanizm działania takiego kanału.
Rys. 4. Model cząsteczki Ca2+-ATPazy opraco wany na podstawie danych uzyskanych w wyni ku ob serw acji m ik rosk op ow ych i an alizy rentgenograficznej kryształów białka.
W części cząsteczki ATPazy znajdującej się w błonie wyróżniono trzy makrodomeny: A1-A2, B oraz C. Frag ment łańcucha polipeptydowego znajdujący się od strony światła kanalika SR łączy domeny A i B. Dome na A l przechodzi w szyjkę, wiążącą część ATPazy zanurzoną w dwuwarstwie lipidowej błony z hydrofilo- wą główką, wyeksponowaną po cytoplazmatycznej stronie błon SR. W główce tej jest zlokalizowane cen trum aktywne enzymu. Domena A2 łączy się z domeną B i niewielkim fragmentem łańcucha polipeptyd owego, eksponowanego po stronie ekstracytoplazmatycznej błony. Oznaczenia M1-M10 odpowiadają domenom transmembranowym zaznaczonym na rysunku 3 (To
y o s h im a i współaut. 1993, St o k e s i współaut. 1994).
KANAŁ WAPNIOWY W CZĄSTECZCE Ca2+-ATPazy
O i
Ca -ATPaza wiąże dwa jony wapnia z wy sokim powinowactwem (Kd = 1CT7 M ) od strony cytoplazmatycznej błony do miejsc wiążących na swojej cząsteczce, zlokalizowanych prawdo podobnie w domenie transbłonowej białka (Ma r t o n o s i 1996). Wiązanie dwóch kationów jest sekwencyjne i kooperatywne. Na tym etapie oba kationy mogą łatwo wymieniać się z pulą Ca2+ w cytoplazmie. Fosforylacja enzymu przez ATP blokuje tę wymianę. Kontrowersje budzi nadal sposób translokacji jonów wapnia przez błonę. Jedna grupa badaczy (In e s i 1994) przy puszcza, że dwa Ca2+ przechodzą przez kanał w cząsteczce białka zgodnie z mechanizmem se kwencyjnym, pierwszy jon, który wchodzi do
kanału, jako pierwszy osiąga wnętrze kanalika SR. Inni badacze (Je n c k s 1995) uważają, że kolejność, w jakiej oba kationy opuszczają ka nał w cząsteczce białka, jest nie do odróżnienia. Różnice pomiędzy obiema grupami poglądów mogą wynikać z zastosowanych technik badaw czych (Ma r t o n o s i 1996).
Zgodnie ze standardowym modelem katali tycznym enzymu E1-E2 miejsca wiążące Ca2+ w
cząsteczce enzymu oscylują pomiędzy miejsca mi o wysokim i niskim powinowactwie, w związ ku z powyższym wysokie stężenie Ca2+ w świetle kanalika SR powinno hamować zależną od Ca2+ fosforylację enzymu. Ponieważ jednak zaobser wowano (Je n c k s 1995), że nie ma różnic pomię
pęcherzykach SR, które zakumulowały w swo im wnętrzu Ca2+ a pęcherzykami opróżnionymi z kationów powstało przypuszczenie, że w czą steczce enzymu istnieją niezależne miejsca wią zania Ca2+ położone po stronie cytoplazmatycz- nej błony i po stronie wewnętrznej kanalika SR. Zgodnie z tą koncepcją początkowo dwa Ca2+ wiążą się po stronie cytoplazmatycznej błony do miejsc o wysokim powinowactwie do tego katio nu, a następnie po fosforylacji enzymu przez ATP są przenoszone na stronę wewnętrzną, gdzie wiążą się do miejsc o niskim powinowac twie. Stąd są uwalniane do światła kanalika SR (J e n c k s 1995). W świetle opisanej hipotezy trudno jednak pogodzić istnienie czterech miejsc wiążących Ca2+ w cząsteczce białka, bez jednoczesnego założenia, że miejsca te będą ze sobą wzajemnie oddziaływały ( M a r t o n o s i 1996).
Inny kontrowersyjny problem stanowi stru ktura kanału w cząsteczce białka (D e M e i s i współaut. 1996). W oparciu o przewidywaną na podstawie sekwencji enzymu strukturę drugo- rzędową ATPazy (dziesięć domen transmembra- nowych M1-M1 0) i dzięki zastowaniu techniki mutacji punktowych reszt amino kwasowych stwierdzono, że domeny M4, M5, M6, M8 mo głyby tworzyć kanał wapniowy w cząsteczce enzymu, domena M l miałaby być częścią miej sca wiążącego kationy o wysokim powinowac
A n d e r s e n i V i l s e n 1995), a domena M3 odpo wiadać za wrażliwość na tapsigarginę (H u s s a in i współaut. 1995, W a l d r o n i współaut. 1995).
Na podstawie obserwacji, że białko ze zwią zanym jednym lub dwoma kationami zachowu je się różnie i w oparciu o strukturę krystaliczną
enzymu (T o y o s h im a i współaut. 1993), zapro ponowano inne rozwiązanie, istnienie dwóch kanałów utworzonych przez domeny M2-M5 i M4—M6 i M8. Każdy z tych kanałów mógłby być
związany z pojedynczym miejscem wiążącym Ca2+, oscylującym pomiędzy stanem o wysokim i niskim powinowactwie do kationu ( M a r t o n o s i
1996). Adaptując mechanizm działania kana łów wapniowych typu L, by wyjaśnić działanie kanału w cząsteczce ATPazy, zaproponowano, że w nieobecności ATP jon wapnia wiąże się z cząsteczką enzymu z wysokim powinowactwem (K d = 10 M). Jon ten może ulegać wymianie z innymi jonami w cytoplazmie. W wyniku fosfo rylacji drugi jon wapnia przyłączałby się do cząsteczki enzymu, obniżając powinowactwo białka do Ca2+ (K d = 10-3 M) i powodując zam
knięcie kanału w cząsteczce ATPazy od strony cytoplazmatycznej błony ( M i n t z i G u i l l a i n 1995, C a n e t i współaut. 1996, D e M e i s i współ aut. 1996, M a r t o n o s i 1996). Należy przypusz czać, że najbliższe lata przyniosą ostateczne określenie mechanizmu transportu jonów wa pnia przez Ca2+-ATPazę.
REGULACJA SYNTEZY Ca2+-ATPazy PRZEZ JONY WAPNIA
Jednym z podstawowych problemów, jakie zaprzątają uwagę badaczy, jest odpowiedź na pytanie, w jaki sposób jest regulowana synteza Ca2+-ATPazy w trakcie rozwoju osobniczego i w odpowiedzi na zróżnicowaną aktywność mięśni (N o z a is i współaut. 1996). W ciągu kilku tygo dni rozwoju osobniczego zawartość enzymu zmienia się z 1-2% do 80% wszystkich białek
błon SR ( M a r t o n o s i 1982, 1996). Zależna od rodzaju włókien mięśniowych synteza w komór kach właściwych izoform enzymu znajduje się pod kontrolą odpowiednich regionów regulato rowych genów i szerokiej gamy czynników transkrypcyjnych ( F o l e t t i i współaut. 1995, V e r b o o m e n i współaut. 1995, N o z a i s i współ aut. 1996). Jednym z takich czynników są jony wapnia. Wykazano bowiem, że w obecności związków zmieniających przepuszczalność błon dla Ca2+, w komórkach mięśniowych wzrasta synteza Ca2+-ATPazy ( M a r t o n o s i 1996). Zapro ponowano zatem, że regulacja ekspresji genów kodujących białka ATPaz przez jony wapnia odbywa się za pośrednictwem białek wiążących
Ca2+ w jądrze komórkowym, zarówno w trakcie rozwoju osobniczego, jak i w odpowiedzi na aktywność mięśni u osobników dorosłych ( M a r t o n o s i 1996).
W ostatnich latach hipoteza ta znalazła po parcie w obserwacjach, że tapsigargina wywo łuje wzrost syntezy Ca2+-ATPazy w komórkach poddanych działaniu tego specyficznego inhibi tora enzymu (H u s s a in i współaut. 1995, W a l d r o n i współaut. 1995). Dodatkowo stwierdzo no, że wzrostowi syntezy ATPazy towarzyszy wzrost syntezy innego białka, GRP78 (białko opiekuńcze, ang. chaperone protein) ( M a r t o n o s i 1982). Ponieważ białka grupy, do której na leży GRP78, oddziałują ze specyficznym dla mięśni szkieletowych czynnikiem transkrypcyj- nym myoD ( L a s s a r i współaut. 1994), jest pra wdopodobne, że wspólny wzrost syntezy Ca2+- ATPazy i białka GRP78 jest odzwierciedleniem rzeczywistych procesów regulacyjnych zacho dzących w komórce mięśniowej. Należy są dzić, że nowe informacje na temat roli innych mięśniowych czyników transkrypcyjnych oraz
dane dotyczące roli Ca2+, ja k o w tórnego przekaźnika sygnałów w proliferacji i różnico waniu się komórek (Be r r i d g e 1995) pozwolą na
wyjaśnienie, w jaki sposób jony wapnia mogą regulować syntezę Ca2+-ATPazy (Ma r t o n o s i
1996).
Ca2+-TRANSPORT ATPase OF SARCOPLASMIC RETICULUM S u m m a ry
Recent advances toward our understanding of the mechanism of transport of calcium ions across sarcoplas mic reticulum membranes and structure-function relation ships characteristic of Ca2+-ATPase, are reviewed. The crucial role of the enzyme in maintenance of Ca2+ homeos tasis within the muscle cell is characterized. The emphasis
is upon evolution of P-type ATPases, the three-dimensional reconstruction of Ca2+-ATPase derived from the diffraction analysis of the protein crystals and based on predictions of the enzyme secondary structure, and upon the structure of Ca2+ channel formed within the Ca2+-ATPase molecule.
LITERATURA
An d e r senJ. P., Vilse nB., 1995. Structure-function relation-
ships o f cation translocation by Ca - and Na - K -A T Pases studied by site-directed mutagenesis. FEBS Lett.
359, 101-106.
An d e r s enJ. P., So r e n s e nT., 1996. Site-directed mutagen
esis studies o f energy coupling in the sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase Biochim. Biophys. Acta 1275,
118-122.
Apr illeJ. R., 1993. Mechanism and regulation o f the mito
chondrial A T P -M g / P i carrier. J. Bioenerg. Biomembr.
25, 473-481.
Ba yleD., We eksD., Sa c h sG., 1995. The membrane topology
o f the rat sarcoplasmic and endoplasmic reticulum cal cium ATPase by in vitro translation scanning. J. Biol.
Chem. 270, 25678-25684.
Berr id g eM. J., 1995. Calcium signalling and cellprolfera-
tion. BioEssays 17, 491-500.
Brow nJ. R., Do o littleW. F., 1995. Root o f the universal
tree o f lf e based on ancient aminoacyl-tRNA synthetase qene duplications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 2441-
2445.
Ca n e t D., Fo r g e V., Gu illa in F., Min t z E„ 1996. Ca2+
translocation across sarcoplasmic reticulum ATPase randomizes the two transported ions. J. Biol. Chem.
271, 20566-20572.
Car af o li E., 1994. Biogenesis: plasma membrane calcium
ATPase: 15 years o f work on the purified enzyme.
FASEB J. 8, 993-1002.
Car af o li E., Sta u f f e r T., 1994. The plasma membrane
calcium pump: Functional domains, regulation o f the activity and tissue specificity o f isoform expression. J.
Neurobiol. 25, 312-324.
De Meis L., 1993. The concept o f energy-rich phosphate
compounds: Water, transport ATPases, and entropie energy. Arch. Biochem. Biophys. 306, 287-296.
De MeisL., Wo l o sk e rH., En g e le n d e rS., 1996. Regulation
o f the channel function o f Ca2+-ATPase. Biochim. Bio
phys. Acta 1275, 105-110.
Fillin g am eR. H., 1996. Membrane sectors o fF - and V-type
ifi-transporting ATPases. Curr. Opin. Struct. Biol. 6,
491-498.
Foletti D., Gu e r in i D., Ca r af o li E., 1995. Subcellular
targeting o f the endoplasmic reticulum and plasma mem
brane Ca pumps: A study using recombinant chime
ras. FASEB J.9, 670-680.
Gr e e n N. M., 1992. Evolutionary relationships within the
fam ily o f P-type cation pumps. Ann. N. Y. Acad. Sci. 671,
104-112.
Gro v e r A. K., KhanI., 1992. Calciumpump isoforms: diver
sity, selectivity and plasticity. Cell Calcium 13, 9-17.
Ha o M.-H., Ha r v e y S. C., 1995. Active transport o f ions
across membranes: Energetic role o f electrostatic and
binding site asymetry. Biochim. Biophys. Acta 1234,
5-14.
Hu s sa inA., Ga r n e t tC., Kle inM. G., Tsai-Wu J. J., Sc h n e id e r
M. F., Ine siG., 1995. Direct involvement o f intracellular
Ca2+ transport ATPase in the development o f thapsigar- gin resistance by Chinese hamster lung fibroblast J.
Biol. Chem. 270, 12140-12146.
Inesi G., 1994. Teaching active transport at the turn o f the
twenty-first century: Resent discoveries and conceptual changes. Biophys. J. 66, 554—560.
Iw ab e N., Nu m a K.-L, Ha se g a w a M., Osaw a S., MiyataT., 1989. Ewolutionary relationship o f archaebacteria, eu-
bacteria, and eukaryotes inferred fro m phylogenetic trees o f duplicated genes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86,
9355-9359.
Jen c k sW. P., 1995. The mechanism o f coupling chemical and
physical reactions by the calcium ATPase o f sarcoplas mic reticulum and other coupled vectorial systems. Bio-
sci. Rep. 15, 283-287.
Ke r e szte sT., Jo n a I., Pik u l aS., Ve g hM., Mu lln e rN., Pa pp
S., Ma r to n o s iA., 1989. Effect o f calcium on the interac
tions between Ca2+-ATPase molecules in sarcoplasmic reticulum. Biochim. Biophys. Acta 984, 326-338.
Kr u p k a R. M., 1994. The application o f vectorial coupling
theory to the calcium pump. Biochim. Biophys. Acta
1193, 179-185.
La s s a r A. B., Sk a pe k S. X., No v itc h B., 1994. Regulatory
mechanisms that coordinate skeletal muscle differentia tion and cell cycle withdrawal. Curr. Opin. Cell Biol. 6,
788-794
Lu tse n k o S., Ka pl a n J. H., 1995. Organization o f P-type
ATPases: Significance o f structural diversity. Biochem
istry 34, 15607-15613.
Ma cLen n a n D. H., Br a n d lC. J., Ko r c z ak B., Green N. M., 1985. Amino-acid sequence o f a Ca2++Mg2+-dependent
ATPase fro m rabbit muscle sarcoplasmic reticulum, de duced fro m its complementary DNA sequence. Nature
(London) 316, 696-700.
Ma cLe n n a n D. H., Toyo fu k u T., 1992. Structure-function
relationships in the Ca2+ pump o f the sarcoplasmic reticulum Biochem. Soc. Trans. 20, 559-562.
Ma r to n o s iA., 1982. The development o f sarcoplasmic reticu
lum membranes. Annu. Rev. Physiol. 44, 337-355.
Ma r to n o s iA., 1995. The structure and interactions o f Ca2+- ATPase. Biosci. Rep. 15, 263-281.
Ma r to n o s i A., 1996. Structure-function relationships in the
Ca2+-ATPase o f sarcoplasmic reticulum: Facts, specula tions and questions for the future. Biochim. Biophys.
Acta 1275, 111-117.
Ma r to n o s i A., Ta ylo r K. A., Va r g a S., Ting -Be all H. P., 1987. The molecular structure o f sarcoplasmic reticu
Ma r to n o s iA., Ta y l o r K. A., Pik u ł a S., 1991. The crystal
lization o f the Ca2+-ATPase o f sarcoplasmic reticulum.
[W:] H. Mic h e l(red.), Crystallization o f Membrane Pro
teins. CRC Press, Boca Raton, Ann Arbor, Boston,
167-182.
Me l z e rW ., He r r m a n n -Fr a n kA ., Lu ttg a u H. C h., 1995. The
role o f Ca2+ ions in excitation-contraction coupling o f skeletal muscle fibers. Biochim. Biophys. Acta 1241,
59-116.
Miln e rR. E., Fa m u ls k iK. S., Mic h a l a k M., 1992. Calcium
binding proteins in the sarcoplasmic/Xendoplasmic re ticulum o f muscle and nonmuscle cells. Molec. Cell.
Biochem. 112, 1-13.
Mintz E., Gu illa in F., 1995. How do Ca2+ ions through the
sarcoplasmic reticulum membrane. Biosci. Rep. 15,
377-385.
Mo lle r J. V., Ju u lB., LeMa ir e M ., 1996. Structural organ
ization, ion transport, and energy transduction ofP-type ATPases. Biochim. Biophys. Acta 1286, 1-15.
Nic ho lls P., Rand R. P., Fu l le r N., Butko P., 1992. Water,
ions and membrane proteins: How would Darwin look at cytochromes and channels? Biochem. Soc. Trans. 20,
583-589.
No z a s M., Lo m prA.-M., D ’AlbisA., 1996. Sarco(endo)plas-
mic reticulum Ca2+ pump and metabolic enzyme ex pression in rabbit fast-type and slow-type denervated
skeletal muscles. A time study. Eur. J. Biochem. 238,
807-812.
Pik u łaS., Mu lln e rN., Du xL., Ma r t o n o s i A., 1988. Stabili
zation and crystallization o f Ca2+-ATPase in detergent- solubilized sarcoplasmic reticulum J. Biol. Chem. 263,
5277-5286.
Pik u łaS., Epste inL., Ma r t o n o s iA., 1994. The relationship
between phospholipid content and Ca2+-ATPase activity
Sa ie r M. H. Jr., 1993. Convergence and divergence in the
evolution o f transport proteins. BioEssays 16, 23-29.
Sk u la c h e v P. V., 1994. Chemiosmotic concept o f the mem
brane bioenergetic: What is already clear and what is still waiting fo r elucidation? J . Bioenerg. Biomembr. 26,
589-598.
Solio z M., Vu lpe C., 1996. CPx-type ATPases: a class o f
P-type ATPases that pum p heavy metals. Trends
Biochem. Sci. 21, 237-241.
Sto k e s D. V., Ta ylo rW. R., Gr e e n N. M., 1994. Structure,
transmembrane topology and helix packing ofP-type ion pumps. FEBS Lett. 346, 32-38.
Ta ylo rK. A., Mu lln e r N., Pik u ł a S., Dux L., Pe r a c c h ia C.,
Va r g aS., Ma r t o n o s iA., 1988. Electron microscope ob
servations on Ca2+-ATPase microcrystals in detergent- solubilized sarcoplasmic reticulum J. Biol. Chem. 263,
5287-5294.
To y o s h im aCh., Sa s a b eH., Sto k e sD. L., 1993. Three-dimen
sional cryo-electron microscopy o f the calcium ion pump in the sarcoplasmic reticulum membrane. Nature (Lon
don) 362, 469-471.
Ve r b o o m e n H., Me r te n s L., Eg g e r m o n t J., Wu y ta c k F.,
Va n d e n b o sc h L., 1995. Modulation o f SERCA2 activity:
regulated splicing and interaction with phospholamban.
Biosci. Rep. 15, 307-315.
Wa ld r o n R. T., Sh o r tA. D., Gil lD. L., 1995. Thapsigargin-
resistant intracellular calcium pumps. Role in calcium poolfunction and growth o f thapsigargin-resistant cells.
J. Biol. Chem. 270, 11955-11961.
Wu K. D., LeeW. S., We yJ., Bu n g a r dD., Ly tt o nJ., 1995.
Localization and quantification o f endoplasmic reticulum Ca2+ -ATPase isoform transcripts. Am. J. Physiol. 269,
