[2008/Nr 4] Banzo(a)piren a procesy jednoelektrodowego utleniania w organizmie

Maciej Gawlik, Jerzy Brandys

BENZO(A)PIREN A PROCESY JEDNOELEKTRONOWEGO UTLENIANIA W ORGANIZMIE

Katedra Toksykologii Collegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego w Krakowie Kierownik: prof. dr hab. J. Brandys

Hasła kluczowe: wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne, benzo(a)piren, utlenianie jednoelektronowe, kooksydacja.

Key words: polycyclic aromatic hydrocarbons, benzo(a)pyrene, one-electron oxida-tion, co-oxidation.

Przedstawiono związek pomiędzy przemianami benzo(a)pirenu (BaP), reprezen-tanta grupy wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych (WWA), a na-sileniem jednoelektronowych procesów oksydacyjnych w organizmie człowieka. Powszechne skażenie środowiska związkami z grupy WWA oraz ich duży, niewy-jaśniony do końca potencjał rakotwórczy, skłaniają do wnikliwej analizy również aspektu oksydacyjnego jako źródła procesów nowotworowych. Opisano trzy głów-ne kierunki prooksydacyjnych przemian BaP: oksydacyjna biotransformacja przy udziale frakcji mikrosomalnej, kooksydacja i utlenianie nieenzymatyczne.

Udział procesów jednoelektronowych oraz cząsteczki tlenu w oddychaniu komór-kowym i przemianach metabolicznych prowadzi do powstawania ugrupowań o bar-dzo wysokim potencjale chemicznym. Benzo(a)piren znany jest przede wszystkim jako związek o charakterze mutagennym i kancerogennym. Jednak, jak wynika to z niektórych badań, może także uczestniczyć w przemianach, w których powstają właśnie wysoce reaktywne pochodne. Może do tego dochodzić w procesie oksyda-cyjnej biotransformacji BaP, w procesie jego współutleniania ze związkami endo-gennymi bądź utleniania BaP na drodze nieenzymatycznej.

OKSYDACYJNA BIOTRANSFORMACJA BaP

Sprzyjający eliminacji lipofi lowych ksenobiotyków, takich jak BaP, proces oksy-dacyjnej biotransformacji, niesie ze sobą zagrożenia wynikające z tworzenia reak-tywnych produktów przejściowych ROMs (ang. reactive oxygenated metabolites ROMs) (1, 2).

Jednym z głównych czynników powodujących wzrost produkcjicząsteczek ak-tywnych w procesach jednoelektronowego utleniania pod wpływem BaP jest udział w procesie biotransformacji tego związku mikrosomalnych monooksygenaz o funk-cji mieszanej zależnych od cytochromu P450. Stwierdzono, że izoformy odpowie-dzialne za utlenianie pierścieni aromatycznych BaP są indukowane za pośredni-ctwem czynników transkrypcyjnych, których białkiem inicjującym jest receptor Ah

(ang. aryl hydrocarbon receptor). Wraz z innym białkiem Arnt (ang. Ah receptor nuclear transporter), podobnie jak Ah zawierającym charakterystyczne ugrupowa-nie bHLH/PAS (ang. basic helix-loop-helix/Per-Arnt-Sim), zapoczątkowują one szlak regulacyjny związany ściśle z tzw. baterią genową, w skład której wchodzą geny dla istotnych enzymów uczestniczących w procesach metabolicznych (1, 3, 4). Oprócz genów dla wspomnianych monooksygenaz zależnych od cytochromu P450, w tym izoform CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1 i enzymów z podrodziny CYP3A (1, 3), w przypadku myszy stwierdzono, że w skład baterii wchodzą również geny dla NADPH-zależnej oksydoreduktazy chinonowej (NQO1), cytozolowej dehydroge-nazy aldehydowej (ALDH3A1), UDP-glukuronylotransferazy (UGT1A6) i S-trans-ferazy glutationowej (GSTA1) (1). Na rolę receptora Ah w apoptozie pod wpływem mutagennych metabolitów BaP wskazali Chen i współpr. (5).

Fizjologiczna rola monooksygenaz cytochromu P450 obejmuje udział w bioge-nezie steroli i katabolizmie kwasów tłuszczowych (6). W przypadku biotransforma-cji egzogennych ksenobiotyków utlenianie ma na celu wprowadzenie do struktury hydrofobowej polarnych grup, ułatwiających sprzęganie w drugiej fazie przemian metabolicznych z utworzeniem kompleksów łatwo wydalanych w postaci rozpusz-czonej. W trakcie przemian jednoelektronowych z udziałem tlenu cząsteczkowego dochodzi do ubocznego tworzenia się ROS (ang. reactive oxygen species): aniono-rodnika ponadtlenkowego O2• oraz nadtlenku wodoru H2O2. Puntarulo i Cederbaum

(7) wykazali ten fakt w przypadku ludzkich mikrosomów dla izoform CYP1A1, 1A2, 2B6 i 3A4 w zmodyfi kowanych genetycznie komórkach limfoblastów. Ska-la tworzenia ROS jest największa w sytuacji, kiedy nadekspresji monooksygenaz cytochromowych nie towarzyszy skuteczne utlenianie substratu, a więc kiedy do-chodzi do rozprzęgania redukcji cząsteczki tlenu i procesu biotransformacji, co jest szczególnie dobrze widoczne w przypadku 2,3,7,8-tetrachloro-p-dibenzodioksyny (TCDD). U myszy zaobserwowano wystąpienie przewlekłego szoku tlenowego w całym organizmie pod wpływem dioksyn (8).

Z procesem biotransformacji BaP wiążą się dodatkowe źródła wolnych rodników i reaktywnych form tlenu. Jak wykazał Cavalieri i Rogan (9) przemiany metabolicz-ne BaP mogą przebiegać w dwóch kierunkach (ryc. 1). Pierwszy, zachodzący przy udziale enzymów mikrosomalnych cytochromu P450, prowadzi przez etap epoksydu zgodnie z tzw. mechanizmem przesunięcia NIH (przegrupowanie wewnątrzcząstecz-kowe z migracją atomu wodoru; nazwa pochodzi od amerykańskiego National Insti-tute of Health, gdzie przesunięcie zostało odkryte) (6) do dihydrodiolu z możliwością utworzenia diolepoksydu i ostatecznie tetraolu. Drugi kierunek obejmuje proces jed-noelektronowego utleniania zarówno pod wpływem enzymów mikrosomalnych jak i peroksydaz. Efektem jest utworzenie kationorodnika BaP przekształcanego następ-nie przy udziale cytochromu P450 do odpowiednich chinonów (ryc. 1).

W przypadku utleniania jednoelektronowego inicjatorem procesów wolnorodni-kowych może być kationorodnik BaP oraz anionorodnik semichinonowy powstają-cy podczas powstają-cyklu oksydapowstają-cyjno-redukpowstają-cyjnego chinonów.

W układzie baterii genowej receptora Ah jest zawarty również czynnik kompen-sujący nasilenie procesów oksydacyjnych pod wpływem przemian metabolicznych przebiegających przy udziale monooksygenaz cytochromu P450. Jest nim recep-torowa indukcja enzymów przeciwdziałających rozwojowi stresu oksydacyjnego

wspomagana zwrotnie przez elektrofi lowe produkty metabolizmu oraz ROS stymu-lujące miejsca regulatorowe genów EPREs (ang. electrophile response elements). Ekspresji ulegają geny dla wspomnianych izoform NQO, ALDH, UGT i GST. NQO katalizuje dwuelektronową redukcję chinonów, w tym chinonowych metabolitów BaP (10), która jest znacznie bezpieczniejsza dla komórki od reakcji jednoelektro-nowej w kontekście tworzenia wolnych rodników i ROS. Z kolei ALDH uczestniczy w detoksykacji aldehydowych produktów peroksydacji lipidów, między innymi 4-hydroksy-2-nonenalu inicjującego powstawanie nadtlenku wodoru w komórce (11). UGT i GST są kluczowymi enzymami II fazy biotransformacji biorącymi udział w sprzęganiu elektrofi lowych metabolitów, w tym fenoli i chinonów.

WSPÓŁUTLENIANIE BaP

W większości narządów alternatywnym źródłem aktywnych oksydacyjnie cząste-czek są procesy kooksydacji BaP czyli współutleniania ze związkami endogennymi zachodzące przy udziale enzymów cytozolowych, syntazy prostaglandyny H i lipo-oksygenazy. Aktywnymi oksydacyjnie czynnikami w tym przypadku są prawdopo-dobnie lipidowe rodniki nadtlenkowe powstające w procesie peroksydacji lipidów. Pierwszymi autorami, którzy wskazali na tę drogę aktywacji metabolicznej BaP byli Dix i Marnett (12,13), a następnie Byczkowski i współpr. (14–19). Analizując różnorodne układy zdolne do inicjowania procesów peroksydacyjnych badacze ci obserwowali w warunkach in vitro powstawanie charakterystycznych dla procesów jednoelektronowych produktów przemian BaP i jego specyfi cznych metabolitów.

Ryc. 1. Możliwe kierunki aktywacji metabolicznej benzo(a)pirenu (wg (4)).

Między innymi w układzie inkubacyjnym zawierającym BaP oraz frakcję mikro-somalną ludzkich łożysk (14) stwierdzano istotny wzrost stężenia benzo(a)piren--6,12-dionu po dodaniu żelaza częściowo chelatowanego przez EDTA. Jednocześnie obserwowano wzrost poziomu związków reagujących z kwasem tiobarbiturowym TBARS (ang. thiobarbituric acid reactive substances), wskazujący na nasilenie pro-cesów peroksydacji lipidów. Zgodnie ze stwierdzaną stosunkowo nikłą aktywnością monoksygenaz cytochromu P450 w mikrosomach łożysk, uzyskany profi l produktów reakcji, ze znaczną przewagą związków chinonowych, przypisano kooksydacji BaP w obecności jonów żelaza pod wpływem procesów peroksydacyjnych. Potwierdze-niem tego były dodatkowe obserwacje dokonane po zastąpieniu BaP jego metaboli-tem, (+) benzo(a)piren-7,8-dihydrodiolem. W obecności jonów żelaza dwukrotnie wzrosła ilość powstającego (-)-anti-diolepoksydu, produktu specyfi cznego dla utle-niania jednoelektronowego, oznaczanego w tym przypadku jako trans-anti-tetraol. Reakcja epoksydacji bardzo dobrze korelowała z powstawaniem dialdehydu malo-nowego (MDA), co dowodzi bezpośredniego związku peroksydacji lipidów z ak-tywacją BaP. Ponieważ ani BaP ani jego diolowa pochodna nie wykazują zdolności do reagowania z anionorodnikiem ponadtlenkowym oraz nadtlenkami lipidowymi, w opisanym przypadku katalityczną rolę spełniają jony żelaza Fe3+_{, które oprócz}

ini-cjowania procesu peroksydacji w obecności NADPH prowadzą do powstawania ka-tionorodnika BaP oraz analogicznego ugrupowania w dihydrodiolu. W stosunku do tej aktywnej postaci prawdopodobnym czynnikiem utleniającym jest lipidowy rodnik nadtlenkowy wytwarzany na etapie propagacji łańcucha peroksydacyjnego.

Możliwość kooksydacji BaP-7,8-dihydrodiolu w warunkach nasilonej peroksy-dacji lipidów Byczkowski i współpr. obserwowali także w układzie zawierającym lipooksygenazę izolowaną z nasion soi i ludzkich łożysk (15, 16). W pierwszym przypadku, w obecności kwasu linolowego dochodziło do charakterystycznej epok-sydacji pochodnej BaP, co wskazywało na proces jednoelektronowy. Dodanie spe-cyfi cznego inhibitora lipooksygenazy, kwasu nor-dihydrogwajaretowego (NDGA), powodowało zahamowanie reakcji. Bardzo podobne wyniki uzyskano w przypadku lipooksygenazy z łożysk ludzkich. Ponieważ lipooksygenaza sojowa nie zawiera żelaza hemowego, wcześniej wskazywanego jako czynnik niezbędny w procesie ko-oksydacji BaP, uzyskane wyniki wymownie wskazują na udział lipidowego rodnika nadtlenkowego w przemianach metabolitu BaP.

Kooksydacja BaP i jego dihydrodiolowej pochodnej była obserwowana przez Byczkowskiego i współpr. (17, 18) również w innych układach charakteryzujących się obecnością enzymatycznych i nieenzymatycznych inicjatorów procesu perok-sydacji. Zwiększone powstawanie pochodnych chinonowych, zwłaszcza BaP--6,12-dionu, wykazano w układzie zawierającym mikrosomy izolowane z wątro-by myszy oraz układ ksantyna–oksydaza ksantynowa w obecności chelatowanych przez EDTA jonów żelaza i BaP (17). Układ ksantyna–oksydaza ksantynowa jest w warunkach fi zjologicznych generatorem anionorodnika ponadtlenkowego, który w obecności jonów żelaza Fe3+ _{w reakcji Fentona prowadzi do powstania rodnika}

hydroksylowego z nadtlenku wodoru. Prawdopodobnie, obok wspomnianego już mechanizmu z udziałem lipidowego rodnika nadtlenkowego, w opisanym układzie właśnie rodnik hydroksylowy wykazuje bezpośrednią zdolność do jednoelektrono-wej aktywacji BaP.

Innym przykładem kooksydacji jest opisana także przez Byczkowskiego i współpr. (18) aktywacja nieenzymatyczna benzo(a)piren-7,8-dihydrodiolu w łożyskach ludz-kich w obecności wanadu w warunkach in vitro. Do zainicjowania procesu perok-sydacji lipidów niezbędne jest powstanie kompleksu (V(IV)-OO._{) w reakcji V(V)}

z anionorodnikiem ponadtlenkowym. Dlatego skutecznym inhibitorem procesu na tym etapie jest dysmutaza ponadtlenkowa (SOD) ograniczająca podaż O2•. Z chwilą

pojawienia się w układzie nawet niewielkich ilości wodoronadtlenków lipidowych znaczenia nabierają następujące reakcje

LOOH + V(IV) → LO• _{+ V(V) + OH}–

LOOH + V(V) → LOO• _{+ V(IV) + H}+

uniezależniające etap propagacji peroksydacji od obecności SOD, co obserwowane było w przytoczonych badaniach.

Dodatkowa możliwość uczestnictwa BaP i jego metabolitów w procesach jedno-elektronowych w organizmie przejawia się w utleniającym działaniu na te związki ROS pochodzących z wybuchu oddechowego fagocytów (ang. respiratory burst). Trush i współpr. (20) opisali charakterystyczną dla procesów jednoelektronowych aktywację BaP-7,8-dihydrodiolu do odpowiedniego diolepoksydu (BPDE) w obec-ności aktywowanych estrami forbolu granulocytów. Inhibitorami tego procesu był kompleks miedziCu(II) z kwasem 3,5-diizopropylowym mimetyzujący działanie dysmutazy ponadtlenkowej oraz azydki hamujące działanie mieloperoksydazy. Wskazuje to na udział ROS w przemianie dihydrodiolu w tym anionorodnika po-nadtlenkowego i nadtlenku wodoru. Stymulujący efekt na opisany proces jednoelek-tronowej aktywacji metabolicznej obserwowali Constantin i współpr. (21) eksponu-jąc zaktywowane jak poprzednio granulocyty na ditlenek siarki i azotu. W obecności ROS pochodzących z wybuchu tlenowego dochodzi prawdopodobnie do powstania wolnego rodnika trójtlenku siarki (SO3–.), który w reakcji z tlenem cząsteczkowym

daje rodnik ponadtlenkowy (. _OOSO

3–). Rodnik ten wywiera bezpośrednie działanie

utleniające na dihydrodiol wraz ze wspomnianymi ROS wzmagając poziom akty-wacji pochodnej BaP. W stosunku do próby kontrolnej, tj. do układu zawierającego tylko granulocyty i dihydrodiol poziom tetraolu mierzonego w układzie z granulocy-tami aktywowanymi i SO2 był ok. 8-krotnie wyższy, zaś w stosunku do układu

zak-tywowanych granulocytów bez udziału SO2 efekt był większy dwukrotnie.

Powyż-sze obserwacje mają duże znaczenie dla narażenia na BaP drogą oddechową, któ-remu w środowisku zawsze towarzyszy ekspozycja na dodatkowe zanieczyszczenia w tym związki siarki i azotu. W obecności makrofagów płucnych dochodzi z jednej strony do nasilenia procesów metabolicznych w zakresie działania monooksygenaz (22), co prowadzi do powstawania ROS i ROMs, z drugiej strony wybuch oddecho-wy i bezpośrednia obecność tlenu cząsteczkowego stwarzają dogodne warunki dla propagacji przemian oksydacyjnych. Objawia się to wyraźnym osłabieniem bariery antyoksydacyjnej, co z kolei sprzyja nasileniu procesów peroksydacji lipidów i roz-wojowi stresu oksydacyjnego. Takie właśnie efekty obserwował Garcon i współpr. (23, 24, 25) w modelu in vitro stosując jako nośnik dla BaP cząstki stałe Fe2O3

eksponując różnorodne linie ludzkich komórek płucnych. W przypadku linii A549 (23) po trzydniowej ekspozycji obserwowano znaczny synergiczny efekt połączenia BaP-Fe2O3 w zakresie wzrostu stężenia MDA oraz wzrostu aktywności SOD.

W świetle aktualnych poglądów na temat kancerogenezy chemicznej i jej związku z procesami oksydacyjnymi przedstawione zależności mogą wskazywać na udział procesów jednoelektronowych w skutkach biologicznych narażenia na BaP i inne mutagenne wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne. Nabiera to szczególnego znaczenia we wczesnym wykrywaniu raka, w przypadku BaP i innych WWA zawar-tych w dymie tytoniowym, lokalizowanego głównie w drogach oddechowych. Ostat-nie doOstat-niesienia wskazują (26), że poziom ROMs w surowicy krwi może być jednym z dogodnych biomarkerów wczesnej fazy procesu nowotworowego w płucach.

M. G a w l i k, J. B r a n d y s

BENZO(A)PYRENE AND ONE-ELECTRON OXIDATION PROCESSES IN THE ORGANISM

PIŚMIENNICTWO

1. Nebert D.W., Roe A.L., Dieter M.Z., Solis W.A., Yang Y., Dalton T.P.: Role of the aromatic hydro-carbon receptor and (Ah) gene battery in the oxidative stress response, cell cycle control, and apoptosis. Biochem. Pharmacol., 2000; 59: 65-85. – 2. Hansen T., Seidel A., Borlak J.: The environmental carcinogen 3-nitrobenzanthrone and its main metabolite 3-aminobenzanthrone enhance formation of reactive oxygen intermediates in human A549 lung epithelial cells. Tox. Appl. Pharm., 2007; 221: 222-234. – 3.

Schlezin-ger J.J., White R.D., Stegeman J.J.: Oxidative inactivation of cytochrome P-450 1A (CYP1A) stimulated

by 3,3’,4,4’-tetrachlorobiphenyl: production of reactive oxygen by vertebrate CYP1As. Mol. Pharma-col.,1999; 56: 588-597. – 4. Whitlock J.P.Jr.: Induction of cytochrome P4501A1. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 1999; 39: 103-125. – 5. Chen S., Nguyen N., Tamura K., Karin M., Tukey R.H.: The role of the Ah receptor and p38 in benzo[a]pyrene-7,8-dihydrodiol and benzo[a]pyrene-7,8-dihydrodiol-9,10-epoxide-induced apoptosis. J. Biol. Chem., 2003; 278: 19526-33. – 6. Ortiz de Montellano P.R.: The Cytochrome P450 Oxidative System w Hanbook Of Drug Metabolism pod red. Woolf T.F., Marcel Dekker, Inc. New York, Basel 1999. – 7. Puntarulo S., Cederbaum A.I.: Production of reactive oxygen species by microso-mes enriched in specifi c human cytochrome P450 enzymicroso-mes. Free Rad. Biol. Med., 1998; 24: 1324-1330. – 8. Shertzer H.G., Nebert D.W., Puga A., Ary M., Sonntag D., Dixon K., Robinson L.J., Cianciolo E.,

Dalton T.P.: Dioxin causes a sustained oxidative stress response in the mouse. Biochem. Biophys. Res.

Commun., 1998; 253: 44-48. – 9. Cavalieri E.L., Rogan E.G.: Central role of radical cations in meta-bolic activation of polycyclic aromatic hydrocarbons. Xenobiotica, 1995; 25: 677-688. – 10. Joseph P.,

Jaiswal A.K.: NAD(P)H:quinone oxidoreductase1 (DT diaphorase) specifi cally prevents the formation

of benzo(a)pyrene quinone-DNA adducts generated by cytochrome P4501A1 and P450 reductase. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1994; 91: 8413-8417.

11. Uchida K., Shiraishi M., Naito Y., Torii Y., Nakamura Y., Osawa T.: Activation of stress signaling pathways by the end product of lipid peroxidation. 4-hydroxy-2-nonenal is a potential inducer of intracel-lular peroxide production. J. Biol. Chem.,1999; 274: 2234-2242. – 12. Dix T.A., Marnett L.J.: Metabolism of polycyclic aromatic hydrocarbon derivatives to ultimate carcinogens during lipid peroxidation. Science, 1983; 221: 77-79. – 13. Dix T.A., Marnett L.J. Detection of the metabolism of polycyclic aromatic hydro-carbon derivatives to ultimate carcinogens during lipid peroxidation. Meth. Enzymol., 1984; 105: 347-352. – 14. Byczkowski J.Z., Kulkarni A.P.: Lipid peroxidation-coupled co-oxygenation of benzo(a)pyrene and benzo(a)pyrene-7,8-dihydrodiol in human term placental microsomes. Placenta, 1990; 11: 17-26. – 15.

Byczkowski J.Z., Kulkarni A.P.: Lipoxygenase-catalyzed epoxidation of benzo(a)pyrene-7,8-dihydrodiol.

Biochem. Biophys. Res. Commun., 1989; 159: 1199-1205. – 16. Joseph P., Srinivasan S.N., Byczkowski

J.Z., Kulkarni A.P.: Bioactivation of benzo(a)pyrene-7,8-dihydrodiol catalyzed by lipoxygenase purifi ed

from human term placenta and conceptal tissues. Reprod. Toxicol., 1994; 8: 307-313. – 17. Byczkowski

J.Z., Gessner T.: Action of xanthine-xanthine oxidase system on microsomal benzo(a)pyrene metabolism

in vitro. Gen. Pharmacol., 1987; 18: 385-395. – 18. Byczkowski J.Z., Kulkarni A.P.: Vanadium redox

cy-cling, lipid peroxidation and co-oxygenation of benzo(a)pyrene-7,8-dihydrodiol. Biochim. Biophys. Acta,

deriva-tive co-oxygenation by environmental pollutants. Bull. Environ. Contam. Toxicol., 1990; 45: 633-640. – 20. Trush M.A., Seed J.L., Kensler T.W.: Oxidant-dependent metabolic activation of polycyclic aromatic hydrocarbons by phorbol ester-stimulated human polymorphonuclear leukocytes: possible link between infl ammation and cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985; 82: 5194-5198.

21. Constantin D., Mehrotra K., Rahimtula A., Moldeus P., Jernstrom B.: Stimulatory effects of sulfur and nitrogen oxides on carcinogen activation in human polymorphonuclear leukocytes. Environ. Health Perspect., 1994; 102: 161-164. – 22. Autrup H., Harris C.C., Stoner G.D., Selkirk J.K., Schafer P.W.,

Trump B.F.: Metabolism of (3H)benzo(a)pyrene by cultured human bronchus and cultured human

pul-monary alveolar macrophages. Lab. Invest., 1978, 38: 217-224. – 23. Garcon G., Shirali P., Garry S.,

Fontaine M., Zerimech F., Martin A., Hannothiaux M.H.: Polycyclic aromatic hydrocarbon coated onto

Fe(2)O(3) particles:assessment of cellular membrane damage and antioxidant system disruption in human epithelial lung cells (L132) in culture. Toxicol. Lett., 2000; 117: 25-35. – 24. Garcon G., Zerimech F.,

Hannothiaux M., Gosset P., Martin A., Marez T., Shirali P.: Antioxidant defense disruption by polycyclic

aromatic hydrocarbons-coated onto Fe(2)O(3) particles in human lung cells (A549). Toxicology, 2001; 166: 129-137. – 25. Garcon G., Garry S., Gosset P., Zerimech F., Martin A., Hannothiaux M., Shirali P.: Benzo(a)pyrene-coated onto Fe(2)O(3) particles-induced lung tissue injury:role of free radicals. Cancer Lett., 2001; 167: 7-15. – 26. Gencer M., Ceylan E., Aksoy N., Uzun K.: Association of serum reactive

oxygen metabolite levels with different histopathological types of lung cancer. Respiration, 2006, 73:

520-524.