Mutanten met veranderde DNA-samenstelling: Een kritisch onderzoek

DNA-SAMENSTELLING,

EEN KRITISCH ONDERZOEK

PROEFSCHRIFT

TER VERKRIJGING VAN DE GRAAD VAN DOCTOR IN DE TECHNISCHE WETENSCHAPPEN AAN DE TECH-NISCHE HOGESCHOOL TE DELFT OP GEZAG VAN DE RECTOR MAGNIFICUS DR. IR. C. J. D. M. VERHAGEN, HOOGLERAAR IN DE AFDELING DER TECHNISCHE NATUURKUNDE, VOOR EEN COMMISSIE UIT DE

SENAAT TE VERDEDIGEN OP WOENSDAG 15 OKTOBER 1969 TE 16 UUR

DOOR

JOHANNES BERTUS VAN DER PLAAT scheikundig ingenieur

geboren te Suiakatta

DRUKKERIJ J. H. PASMANS - 's-GRAVENHAGE ;

Hoofdstuk I ALGEMENE INLEIDING

1. Inleiding 7 2. Structuur en eigenschappen van nuclefnezuren 11

a. Chemische samenstelling 11

b. Structuur 1,3 c. Moleculairgewicht 15

d. F y s i s c h e eigenschappen 15 3. Functie van nuclefnezuren en de invloed van

bepaalde antibiotica 19 a. Replicatie 20 b. Transcriptie 21 c. Translatie 23 4. Mutaüe 27

a. Mechanismen van mutatie 27 b. Werking van gebruikte mutagentia 29

c. Mutanten met veranderde DNA-samenstelling 33

d. DNA - DNA hybridisatie 35

5. Literatuur 37 Hoofdstuk II EXPERIMENTEEL GEDEELTE

1. Microorganismen 41 2. Media en kweekmethodes 41

3. Mutagentia en mutatie-inductie 43 4. R e s i s t e n t i e tegen antibiotica en acridines 46

5. Fenotypische eigenschappen van agrobacteria

en verwante stammen 47 a. Tumor-inducerend vermogen 47

b. Cytochroom-c oxydase 48 6. Bereiding en a n a l y s e van celwandpreparaten 48

7. Agglutinatie-titers 50 8. Isolatie en zuivering van DNA 51

9. Easesamenstelling van de DN A's 53

a. Bepaling van T 53 b . Evenwichtssedimentatie in een CsCl-gradiènt 56

c. Het UV-spectrum van DNA bij pH=3 58 d. Chemische base-analyse van DNA 58

10. DNA - DNA hybridisatie 60

AGROBACTERIUM TUMEFACIENS

1. Inleiding 64 2. DNA-baseanalyse 65

3. Probleemstelling van het onderzoek en

theoretische benadering 67 4. Mutatie- en revertie-experimenten 69

5. R e s i s t e n t i e tegen groeiremmende stoffen 72

6. Serumtiters 73 7. Celwandsamenstelling 74

8. Cytochroom-c oxydase activiteit 77

9. DNA - DNA h y b r i d i s a ü e 78

10. DNA- homologie 81 11. Conclusie 83 12. Literatuur 84 Hoofdstuk IV RESULTATEN VAN ONDERZOEK AAN ANDERE

MICRO ORG AN ISMEN

1. Inleiding 85 2. Mutanten van Bacillus subtilis 168 85

a. Mutatie-experimenten 85 b. Genetische verwantschap 87 3. Mutanten van Staphylococcus aureus 209 88

a. Mutatie-experimenten 88 b. Genetische verwantschap 89 4. Mutanten van Bacterium paracoli 5099 90

a. Mutatie-experimenten 90 b. Genetische verwantschap 93 5. Mutanten van Azotobacte/ chroococcum C77 95

6. Conclusie 98 7. Literatuur 99

SAMENVATTING 100

Hoofdstuk 1 ALGEMENE INLEIDING

1. Inleiding

Het begrip mutatie vindt zijn oorsprong in het vakgebied der ge-netica of erfelijkheidsleer. De wijze waarop erfelijke eigenschappen van generatie op generatie worden overgedragen is in de eerste helft van deze eeuw voornamelijk onderzocht bij hogere organismen. Aan-leiding hiertoe is geweest de herontdekking door D E V R I E S , C O R R E N S en VON TSCHERMAK van de ingenieuze experimenten van de Oosten-rijkse monnik M E N D E L met erwten en bonen, welke door hem zijn be-schreven in zijn testament a l s " V e r s u c h e über P f l a n z e n - H y b r i d e n " ' . Sinds 1940 heeft de bacteriêle genetica zeer veel bijgedragen tot de genetica in het algemeen en de biochemische achtergrond van de erfe-lijkheidsleer. Twee belangrijke redenen kunnen hiervoor worden aan-gevoerd. Ten e e r s t e is het duidelijk geworden dat de basisprincipes der genetica geldig zijn voor zowel dieren, planten als microorganis-men. Ten tweede zijn bacteriën als studieobject aantrekkelijker omdat ze, in tegenstelling tot hogere organismen, zich zeer snel vermenig-vuldigen, de populatie enorm groot i s , en betrekkelijk eenvoudig zijn te kweken.

Onderzoek naar de principes en de chemische achtergrond van erfelijkheid en variatie heeft duidelijk gemaakt dat hetgeen overgedra-gen wordt van overgedra-generatie naar overgedra-generatie een aantal determinanten (in-formatie) is van goed gedefinieerde chemische aard. Deze determinan-ten controleren chemische processen in de cel en bepalen tot welke chemische r e a c t i e s het individu in staat i s . Het totale aantal erfelijke determinanten wordt het genotype genoema.

Ondanks identiteit van het genotype kunnen er toch grote ver-schillen zijn in uiterlijk of morfologische eigenschappen t u s s e n twee individuen. Deze worden veroorzaakt door verschillen in de omgeving waarin zij zich bevinden. Erfelijk is dus het vermogen op een bepaalde wi'j'ze op omgevingscondities te reageren. De uiteindelijke verschij-ningsvorm van een individu, als resultante van het vermogen zekere r e a c t i e s uit te voeren en de invloed van de omgeving, wordt het pheno-type genoemd. Het voorgaande houdt niet in dat het genopheno-type ongevoe-lig i s voor de omgeving. Veranderingen in het genotype kunnen in alle organismen optreden en bepaalde stoffen of omgevingscondities zijn in staat gebleken de frekwentie van zulke veranderingen te verhogen. Om blijvende veranderingen in organismen te beschrijven werd reeds in

1901 door D E V R I E S ^ het begrip mutatie gebruikt. Met mutaties worden dus veranderingen in het genotype bedoeld. Volgens onze huidige in-zichten zijn deze van chemische aard en voltrekken zij zich in de stoffelijke drager der erfelijke eigenschappen het desoxyribonucleïne-zuur (DNA*).

F i g . 1 Electronenralcroscopische opname van DNA vrijgemaakt uit bacteriofaag T2 (overgenomen met toestemming van Dr.A.K. Kleinschmidt en E l s e v i e r s Uitg.Mij.N.V. uit Biochim.Bio-phys.Acto, 61 (1962) 857, f l g . l ) .

Nuclefnezuren werden in 1871 door M I E S C H E R in dierlijke cel-kernen ontdekt en in 1889 door A L T M A N N ook in plantencellen ge-vonden. Laatstgenoemde onderzoeker heeft ook de naam nuclefnezuren voorgesteld vanwege het zure karakter van deze verbindingen en het feit dat ze in de celkern (kern=nucleus) voorkomen. Later bleek even-wel dat nuclefnezuren ook worden gevonden in het cytoplasma. DNA treft men aan in de celkernen van hogere organismen, waarin het met eiwitten structureel is georganiseerd als chromosomen , voorts bij bacteriën in de kernachtige substantie en in vele virussen (figuur 1). DNA wordt ook aangetroffen in mitochondriën van gisten en hogere organismen, bovendien bij algen en planten in de chloroplasten . De genetische functie van deze DNA's is tot dusverre nog niet opgehel-derd. Naast DNA bevat elke cel verscheidene fibonuclelnezuren (RNA). De functie van deze RN A's zal onder 3 uitvoeriger worden besproken.

DNA en RNA zijn de algemeen gebruikte afkortingen voor desoxyribonucleïne-zuur en ribonucleitiedesoxyribonucleïne-zuur (zie pag. 11).

Tot het jaar 1944 nam men aan dat eiwitten de dragers zijn vqn de genetische informatie. Dat DNA deze rol vervult werd ontdekt door

Q

AVERY en medewerkers , die hiermee het tijdperk der moleculaire genetica inleidden. Zij bouwden voort op eerdere onderzoekingen van GRIFFITH . Deze onderzoeker injecteerde bij muizen tegelijkertijd cellen van een, door herhaald overenten kapselloos geworden, pneumo-coccenstam (niet virulente stam met ruwe kolonievorm) en warmte ge-dode cellen van de gekapselde, virulente stam (gladde kolonievorm). Uit deze dieren kon hij levende gekapselde pneumococcen isoleren, die het vermogen tot kapselvorraing ook in het nageslacht behielden. Ondanks dat de gekapselde pneumococcen dus gedood waren bleek toch het vermogen tot kapselvorming op de cellen overgedragen te kunnen worden. De levende cellen waren tot een ander type "getransformeerd". Enige jaren later toonde A L L O W A Y ' ° aan, dat ook celvrije extracten van gekapselde cellen tot transformatie in s t a a t waren. Door zuivering van de transformerende extracten konden A V E R Y en medewerkers aan-tonen dat de transformerende stof DNA i s . Overtuigend was vooral de waarneming dat de transformerende activiteit werd vernietigd door des-oxyribonuclease (een DNA splitsend enzym), maar niet door eiwit-splitsende enzymen.

Een tweede bewijs dat een nucleïnezuur drager der erfelijke e i -genschappen is ,in sommige virussen vervult RNA deze rol) werd ge-leverd door HERSHEY en CHASE ^^ door gebruik te maken van een bacteriofaag (bacterieel virus) van Escherichia coli. Bacteriofagen bestaan uit een eiwitmantel waarbinnen zich nuclefnezuur bevindt. Bij infectie van een bacterie met één faag vindt productie van een groot aantal fagen plaats wat uiteindelijk leidt tot l y s i s van de gastheer en het vrijkomen van deze nieuwe fagen. Om na te gaan welke stof van de faag de informatie voor de reproductie bevat hebben HERSHEY en CHASE de infectie door T fagen vervolgd, waarvan het DNA met radio-actief fosfor en het eiwit met radioradio-actief zwavel waren gemerkt. Op deze wijze konden zij aantonen, dat bij infectie het DNA van de faag in de bacteriecel " g e f n j e c t e e r d " wordt, terwijl de eiwitmantel aan de oppervlakte van de bacterie blijft zitten (fig. 2). Het eiwit kan na de infectie door heftig roeren worden verwijderd zonder dat de faagver-meerdering in de gastheercel hierdoor wordt beïnvloed.

Dit DNA zet de gastheer aan nieuwe fagen te produceren. Opmer-kelijk is dat onder controle van het faag-DNA ook de s y n t h e s e van faagspecifieke eiwitten (zoals b.v. de eiw.itmantel) verloopt. Eiwit-vrij faag-DNA bleek onder bepaalde omstandigheden infectieus te kunnen zijn.

In overeenstemming met de genetische functie van DNA is dat elke cel van een individu een constante hoeveelheid DNA bevat. Daar

V J

(sche-matisch).

de genetische informatie van generatie op generatie wordt overgedra-gen moet de informatie bevattende stof een stabiele structuur bezitten. De mutagene werking van analoga van de bouwstenen van DNA (vgl.4) hebben tevens een sterke aanwijzing gegeven voor de informatiedragen-de rol van DNA.

Alle genoemde feiten rechtvaardigen het, DNA, uitgezonderd bij enige virussen, als drager der erfelijke eigenschappen te beschouwen. Tot besluit is het wellicht nuttig enige begrippen te definiëren die vaak worden gebruikt binnen het gebied der bacteriegenetica;

Het genoom is de som van alle genen van een organisme. In cytolo-gische zin betekent het, het totaal aantal haploide chromo-somen.

Een gen is een deel van de genetische structuur, dat een functie-eenheid vormt. Deze eenheid kan verantwoordelijk zijn voor de ont-wikkeling van een bepaalde eigenschap.

Een cistron is een deel van een gen dat de informatie bezit benodigd voor de synthese van een polypeptideketen.

Een locus is de plaats van een gen of een groep bij eenhorende genen op de genetische kaart.

Markers zijn markeringen van een gen door punt- of blokmutaties. Mutatie is de sprongsgewijze opgetreden blijvende verandering van een

gen. Individuen, die een gemuteerd gen bezitten noemt men mutanten.

2. Structuur en eigenschappen van nuclefnezuren a. Chemische samenstelling

Nuclefnezuren zijn hoogpolymere macromoleculen opgebouwd uit nucleotiden. Deze eenheden bestaan op hun beurt uit drie componenten, nl. een stikstofhoudende base, een suiker (pentose) en een orthofosfaat-groep. De pentose kan zijn D-ribose (I) of D-2-desoxyribose (II) en hierop berust de indeling in ribo- en desoxyribo-nuclefnezuren.

HOCH2 ^ 0 OH

„/ \^y \

X./

In de a n g e l s a k s i s c h e literatuur worden de afkortingen RNA (van RiboNucleic Acid) en DNA (van DeoxyriboNucleic Acid) gebruikt. Deze afkortingen hebben over de gehele wereld een dermate grote ingang ge-vonden, dat ze algemeen worden aanvaard.

Zowel DNA als RNA bevatten vier verschillende nucleotiden, die zich in hun basen onderscheiden. In beide nuclefnezuren komen de purine-derivaten adenine (III) en guanine (IV) voor. DNA bevat als pyri-midine-derivaten thymine (V) en cytosine (VI); in RNA komt in plaats van thymine uracil (VII) voor.

N^e

H

M

W

Het is gebruikelijk de namen der basen afgekort weer te geven met de eerste letter, dus voor de purines A en G, voor de pyrimidines C, T en U.

Behalve de reeds genoemde heterocyclische basen komt in het DNA van vele hogere organismen ook een geringe hoeveelheid 5-raethyl-cytosine (VIII) voor . In de T-even fagen van E.coli is geen 5-raethyl-cytosine aanwezig maar 5-hydroxymethyl-cytosine (IX), terwijl naast desoxyri-bose ook glucose wordt aangetroffen^^. Recent is gebleken dat 5-me-thyl-cytosine en 6-methylam.ino-purine (X) ook wijd verspreid onder de bacteriêle DNA's voorkomen, alhoewel ook bepaalde bacteriestammen in het geheel geen gemethyleerde basen blijken te bevatten'"*.

Een nucleotide is het purine- of pyrimidinederivaat via resp. het N9 of N] gebonden aan het e e r s t e koolstofatoom van de suiker. De fosfaatgroep kan veresterd zijn aan de 3'- of 5'-hydroxyl-groep van de pentose. Weergegeven is de formule van thymidine-5'-monofosfaat (XI). Een polynucleotide ontstaat door fosfodiësterbinding tussen de 3 ' - en 5'- plaatsen van de respectievelijke suikers (XII).

HO

\

Base Base Base Base

1' 2'

^^xh

N

zn

Wegens de 3 ' - en 5 ' - bindingen tussen suiker en fosfaat heeft zo'n molecuul een bepaalde richtingszin of polariteit. Het ene einde der keten bezit een onveresterde suiker, terwijl aan de andere zijde een fosfaatgroep s t a a t .

b. Structuur

WATSON en CRICK stelden op b a s i s van vele gegevens, ook van andere onderzoekers, een model voor van de ruimtelijke structuur van DNA. Röntgenografisch onderzoek van DNA van verschillend ori-gine toonde aan dat het een spiraalvormige structuur b e z i t ' ^ . Een der-gelijke spiraal noemt men een helix. Verdere gegevens wezen er op dat

DNA bestaat uit twee polynucleotideketens gerangschikt als een dub-belhelix. Alhoewel de basesamenstelling van DNA van verschillende organismen grote variatie bezit, ontdekte C H A R G A F F een algemeen geldige regel: adenine en thymine komen in gelijke hoeveelheden voor (A=T). Hetzelfde geldt voor guanine en cytosine (G=C). Daardoor is ook het aantal purines (A+G) s t e e d s gelijk aan het aantal pyrimidines (T+C).

De samenstelling van een DNA heeft dus maar een variabele grootheid, de verhouding QXC • die wordt bepaald door het organisme. Op grond van al deze gegevens stelden WATSON en CRICK het volgende struc-tuurmodel voor:

Een DNA-molecuul bestaat uit twee ketens, welke een tegenstelde polariteit bezitten en tot een dubbelspiraal om elkaar zijn ge-wonden. Twee tegenoverstaande basen vormen daarbij met hun neven-valenties waterstofbruggen, wacffbij s t e e d s adenine met thymine en guanine met cytosine i s gepaard. De structuur van DNA i s in figuur 3 weergegeven.

F i g . 3 Schematische voorstelling en molecuulmodel van DNA (uit R . P . L e v i n e , Genetics, Holt, New York 1962).

Het feit dat de ketens antiparallel zijn-is later door CHARGAFF en medewerkers bewezen . Opvalt dat basenparen loodrecht op de heUxas staan, maar niet loodrecht op de suikerfosfaatketens. De water-stofbruggen bevinden zich terzijde van de h e l i x a s . Op energetische gronden is gebleken dat er geen andere baseparing dan A—T en G—C mogelijk i s . Structureel zien deze baseparen er uit als in fig. 4.

Fig. 4 Baseparing tussen p\irines en pyrimidines in DNA.

Latere onderzoekingen wezen uit dat niet alleen waterstofbruggen maar ook London dispersie-krachten wezenlijk bijdragen tot de stabili-teit van de dubbelhelix . De structuur van DNA zoals in fig. 3 komt overeen met de B-configuratie zoals beschreven door LANGRIDGE C S . . Karakteristiek hieraan is een lengte per winding (helix-pitch) van 34 A, die tien nucleotiden omvat. Nauwkeurig röntgenonderzoek kan alleen worden verricht aan kristallijn DNA in een zoutvorm. Door verandering van de vochtigheidsgraad kan dan de A-configuratie ont-staan . In intacte biologische structuren (bacteriofaag, spermatozoon, erythrocytkernen, etc.) is het DNA nagenoeg altijd in de B-configuratie. Ook voor DNA in waterige oplossing is het bestaan van de B-vorm aannemelijk gemaakt^^. LEWIN^^' meent dat in deze toestand de baseparing zoals in fig. 4 aangegeven overgaat in hydratie-baseparing door het met DNA geassocieerde water.

De volgorde van de baseparen in DNA is niet alternerend regel-matig, zoals men tot in de veertiger jaren dacht. De basevolgorde i s schriftvormig, d.w.z. onregelmatig, maar zinvol. Deze stelt een code voor, die syntheseaanwijzingen voor de cel bevat.

In enkele gevallen, zoals faag c^X 174, komt DNA ook als een enkele keten voor . De structuur van RNA i s in de meeste gevallen ook die van een enkele polynucleotideketen, waarin de bouwstenen middels 3'-5'-fosfodiësterbindingen zijn verbonden. Omdat in de cel verschillende soorten RNA voorkomen met ieder een eigen functie i s het onmogelijk te spreken over de structuur van het RNA. Uit de in-middels bekende basevolgorde van verscheidene transfer-RNA's '

(t-RNA) en van 5 S-ribosomaal RNA^® (r-RNA) kan worden afgeleid dat bij deze moleculen, door vorming van een lus, bepaalde stukken van de keten een complementaire basevolgorde hebben. Op deze wijze kan inter-keten baseparing optreden, waardoor het molecuul ten dele een structuur bezit welke lijkt op de DNA-dubbelhelix. Daar het recent ver-scheidene onderzoekers is gelukt een t—RNA in kristallijne vorm te verkrijgen is de weg naar röntgenografisch structuuronderzoek geopend. De resultaten hiervan kunnen de veronderstellingen over de baseparing in RNA bevestigen.

c. Moleculairgewicht

Bij een detinitie van het moleculairgewicht rijst de vraag wat een onderzoeker een DNA-molecuul noemt. Velen hebben aanwijzingen ge-vonden dat zowel het dierlijke als bacteriêle chromosoom uit sub-een-heden bestaat die door kleine stukjes eiwit met elkaar zijn verbonden. De moleculairgewichten van de sub-eenheden van kalfs-thymus DNA zijn opgegeven als ongeveer 250.000^^, maar ook a l s 500.000^°. De verhouding massa tot lengte voor DNA in de B-configuratie is 2 x 10^ daltons//!, zodat in dit geval de lengte van de dubbelhelix 0,13 tot 0,25 u zou zijn. De grootste DNA-subeenheden uit E.coli g e f s o l e e r d ^ '

O

hebben een mol.gew, van 2,5 x 10 . Vast staat in ieder geval dat het gehele chromosoom van E.coli een lengte heeft van ongeveer 1100 u, terwi:jl het mol.gew. wordt geschat op 2,8.10 . Een ringvormige ge-sloten DNA-dubbelhelix bestaat o.a. bij de replicatieve vorm van bac-teriofaag <f>X 174-DNA. De lengte ervan bedraagt 1,64 fi, wat correspon-deert met een mol.gew. van 3,3 x 10 .

Moleculairgewichten van de verschillende RNA's zijn doorgaans lager. Voor t-RNA is het gemiddeld 25.000, voor 5 S ribosomaal-RNA berekent men 42.000. Het messenger-RNA (m-RNA) bezit doorgaans een hoger mol.gew. Het schijnt nogal heterogeen te zijn en men geeft als grootte-orde op een mol.gew. van 100.000 - 500.000 of mogelijk nog hoger.

d. Fysische eigenschappen

Het absorptiespectrum van nuclefnezuren ontstaat uit de som van de absorpties van de purine- en pyrimidinebasen (fig. 5). Dit spectrum bezit een maximum bij 260 m/i en vormt een verklaring voor de schade-lijke en mutagene werking van ultraviolet licht (UV) op levende orga-nismen. Veranderingen door UV vinden niet alleen plaats aan nuclefne-zuren, maar de werking op DNA is voor een groot deel verantwoorde-lijk voor het ontstaan van mutaties bij microorganismen.

In het geval van DNA in de natieve vorm (dubbelhelixstructuur) is gebleken dat de extinctie bij 260 m/z lager is dan op grond van de bijdragen van de basen mag worden verwacht. Dit hypochroom effect vindt zijn oorzaak in de sterke interacties tussen de nelectronen s y s -temen van naburige basen in de geordende structuur . De grootte van het hypochroom effect wordt mede bepaald door de base samenstelling van een DNA en is doorgaans in de orde van 35%. Bij denaturatie van DNA wordt de geordende structuur verbroken en valt de dubbelhelix uiteen in twee losse min of meer kluwenvormige ketens. Hierbij worden de interacties tussen de basen opgeheven.

I 1 1 1 1 1 I

200 220 240 260 280 300 320

» golflengt* in myu

F i g . 5 UV-absorptlespectrum van nucleltiezuren.

Van dit verschijnsel hebben FREDERICQ c . s . gebruik gemaakt om een optische kwantitatieve base-analyse uit te werken. Wanneer DNA is opgelost in 0,1 N azijnzuur (pH van ongeveer 3) zijn base-inter-acties klein geworden. Omdat de extinctie-maxima van de vier basen verschillend zijn zal hun bijdrage tot de extinctie van DNA bij 260 en 280 mfi ook verschillend zijn. Gebleken is dat de verhouding Eggg/Eggo bij pH 3 een functie is van de basesamenstelling. Op deze wijze is het mogelijk een snelle en eenvoudige bepaling te doen van het percentage guanine + cytosine (% GC) van DNA.

Factoren die de stabiliteit van de DNA-dubbelhelix in waterige oplossing bepalen zijn: de ionensterkte en de aard der ionen , voorts de pH van de oplossing ' en de temperatuur . Door veran-deringen van elk van deze factoren alleen of in combinatie met elkaar is denaturatie van DNA te bewerkstelligen, en in alle gevallen zal

de-ze denaturatie vergede-zeld gaan van een hyperchroom effect bij 260 mft. Deze structuurovergang van DNA vindt zijn oorzaak in het verbreken van de bindingskrachten (waterstofbruggen en v.d. Waals-London krach-ten) tussen de basenparen. Zo kan men een neutrale oplossing van DNA met loog bij 260 m/i spectrofotoraetrisch titreren. In een beperkt pH traject ontstaat dan een scherpe stijging van de extinctie. Eenzelfde extinctiestijging neemt men waar bij verwarmen van een oplossing van DNA. Laatstgenoemd verschijnsel, dat thermische denaturatie wordt genoemd, heeft zelfs een analytische toepassing geyonden. Voor DNA verloopt het ontwinden van de dubbele helix (z.g. uitsmelten) binnen een bepaald temperatuurtraject dat, afhankelijk van de homogeniteit van het betrokken DNA, van 5-12° kan bedragen. Men kan nu de rela-tieve extinctiestijging bij 260 m/a grafisch uitzetten tegen de tempera-tuur en verkrijgt dan een curve zoals in fig. 6. Als karakteristieke temperatuur wordt gekozen die temperatuur waarbij de extinctiestijging de helft van het hyperchroomeffect bedraagt. Deze temperatuur wordt aangegeven als T (midpoint of thermal transition). Voor de meeste DNA's ligt de T t u s s e n 8 0 e n 100°C bij een zoutsterkte van 0.2M-Na'^.

m

Als oplosmiddel wordt meestal "standard saline c i t r a t e " (SSC = 0,15M NaCl + 0,015 M trinatriumcitraat, pH 7,0) gebruikt. Omdat de

denatura-1,0 1 1 1 1 1 1 1 1 r~

ee 90 92 94 96 98 100 temperatuurCC)

tie van DNA, naast de temperatuurafhankelijkheid, ook een kinetisch verschijnsel is , wordt de ligging van T^^^ beïnvloed door de snelheid waarmee de temperatuur wordt verhoogd. Vrij gebruikelijk is een gra-diënt aan te leggen van 1° per 10 minuten, zowel bij discontinue als bij continue temperatuursverhoqing.

Naast de eerder genoemde extinctiestijging bij denaturatie veran-dert ook de v i s c o s i t e i t der oplossing. DNA geeft door de staafvorraige structuur aan een oplossing een tamelijk hoge v i s c o s i t e i t . Bij verhitten gaat deze geordende structuur over in kluwens van enkelstrengig DNA wat gepaard gaat met een sterke daling van de viscositeit . Uit fig. 4 is te zien dat bij baseparing tussen A en T twee waterstofbruggen wor-den gevormd, tussen G en C daarentegen drie. Dit verschil komt tot uiting in de ligging van T • Naarmate een DNA een hoger gehalte aan G + C heeft zal denaturatie bij hogere temperatuur plaats vinden en ligt de T dus ook hoger. MARMUR en_m D O T Y ' * ' ' stelden voor deze afhankelijkheid een empirische relatie vast, nl. T = 6 9 , 3 + 0 , 4 1 (% GC). Dit verschaft ons een tweede manier om met behulp van een fysische methode de basesamenstelling van een DNA te bepalen.

Bepaalde RNA's, die een op DNA gelijkende gedeeltelijke dub-belhelixstructuur bezitten, vertonen bij verwarmen een soortgelijk ef-fect. Zo kan ook een oplossing van t-RNA worden uitgesmolten. Het hyperchroom effect is lager, het smelttraject doorgaans groter dan bij DNA. Voor het verkrijgen van goede smeltcurves is de aanwezigheid van Mg ionen noodzakelijk .

De dichtheid van DNA is tamelijk hoog en wordt doorgaans be-paald door ultracentrifugatie in een oplossing van CsCl. Onder deze omstandigheden is de dichtheid van DNA in de orde van 1,7 g/cm . Een dichtheidsgradié'nt wordt verkregen door een geconcentreerde op-lossing van een neutraal zout langdurig bij een hoog toerental te cen-trifugeren. Door te werken met een zout met een hoog soortelijk ge-wicht zal door de centrifugale kracht een concentratie- en eveneens een dichtheidsgradiënt ontstaan . Gaat men b.v. uit van een CsCl-oplossing met startdichtheid 1,7 (ongeveer 8 M CsCl) dan zal na 20 uur centrifugeren bij 45-000 toeren per minuut de dichtheid in de cel nage-noeg lineair verlopen van 1,63 tot 1,77. Bevat zo'n oplossing ook DNA dan zal deze stof zich daar ophopen waar de dichtheden gelijk zijn. Het DNA zweeft dan als een scherpe band in de gradiënt en men spreekt daarom wel van de " z w e v i n g s d i c h t h e i d " (Engels: buoyant density) van DNA. In het algemeen wordt met zeer lage concentratie (5 fig/ml) DNA gewerkt om de befnvloeding van de moleculen onderling zo klein mogelijk te houden. Een gevolg hiervan is dat de banden in de cel al-leen te detecteren zijn door het UV-absorptiebeeld van de oplossing zichtbaar te maken, hetzij met de fotografische plaat of door directe

aftasting van het beeld met een foto-electrisch schrijvend systeem. De dichtheid van een bepaald DNA is te berekenen door een twee-de DNA van bekentwee-de dichtheid mee te centrifugeren. Er ontstaan dan twee banden, waarvoor SCHILDKRAUT e s . ° de volgende vergelijking hebben afgeleid:

p = p^+ 4,2 <y2 (r^ - r^) x 10"^° g / c m l waarbij:

p = zwevingsdichtheid van het standaard-DNA p = zwevingsdichtheid van het te onderzoeken DNA <u = rotatiesnelheid in radialen per seconde

r = afstand monster-DNA tot de rotatie-as r = afstand standaard-DNA tot de rotatie-as. _o

Ook in dit geval blijkt er een verband te bestaan tussen de dicht-heid en de basesamenstelling van een DNA. De volgende empirische relatie is hiervoor afgeleid , gebaseerd op een waarde van 1,710 g/cm voor E.coli DNA:

p = 1,660 + 0,098 (GC)

waarbij p de zwevingsdichtheid en (GC) de raolfractie guanine plus cytosine i s . Naast de basesamenstelling heeft ook de conformatie van DNA invloed op de dichtheid. Bij denaturatie neemt de dichtheid aan-merkelijk toe, wat het mogelijk maakt van eenzelfde DNA de enkel-streng- en dubbelstrengvorm te onderscheiden. Dit heeft o.a. toepas-sing gehad bij de nog te bespreken DNA-DNA hybridisatie.

Naast de besproken fysische methodes voor base-analyse zijn er ook een aantal chemische bepaling swij zen. Deze bepalingen hebben in het algemeen het nadeel dat ze tijdrovend en bewerkelijk zijn, ter-wijl ook de benodigde hoeveelheid DNA groter is dan bij de fysische methodes. In enkele gevallen is bij ons onderzoek de methode van W Y A T T ' * ' gebruikt. Hierbij wordt het DNA met 88% mierenzuur gehy-drolyseerd bij 175° C, waarna de basen chromatografisch worden ge-scheiden. Andere methodes maken gebruik van bromeren met N-broom-aceetamide of hydrolyse met verdund HCl en bepaling van de ver-houding adenine/guanine . Baseanalyse van RNA vraagt minder destructieve condities. Hydrolyse met verdunde loog bij 37° C levert reeds de vrije basen, waarna deze chroraatografisch kunnen worden bepaald^°.

3. Functie van nuclefnezuren en de invloed van bepaalde antibiotica Beknopt zal de genetische functie van de verschillende nuclefne-zuren en het werkingsmechanisme van enige bij dit onderzoek gebruikte

antibiotica worden behandeld. Hierbij zal niet worden ingegaan op pro-blemen, die verband houden met de regulatie van processen op gene-tisch niveau.

a. Replicatie

De erfelijke eigenschappen worden van generatie op generatie doorgegeven. Dit houdt in, dat voor elke celdeling de genetische in-formatie gecopiëerd moet worden. Het DN A-model van WATSON en CRICK levert een elegante oplossing van dit probleem. Elk DNA-mole-cuul draagt de informatie dubbel, eenmaal in iedere keten. De isolatie van het enzym dat nieuw DNA synthetiseert is gelukt aan de groep van KORNBERG. Hierdoor is veel Inzicht verkregen in het mechanisme der DNA-replicatie. Het enzym, DNA-polymerase, geïsoleerd uit E.coli i s in staat DNA te synthetiseren uit de vier nucleotiden in de vorm van trifosfaten (dATP, dGTP, dCTP en T T P ) . Het blijkt hiervoor een DNA als matrijs (primer) nodig te hebben. Onafhankelijk van de herkomst van het "prlmer"-DNA heeft het nieuw gevormde DNA een basesamen-stelling welke precies gelijk is aan die van de primer . Vastgesteld is verder dat niet alleen de samenstelling maar ook de nucleotidevolg-orde in het nieuwe DNA identiek is met die van de primer . Deze ontdekkingen houden in dat de dubbelhelix van DNA zich voor de repli-catie moet ontrollen. Tegenover de basen van de enkelstreng kan het enzym dan de door baseparing vastgelegde raononucleotiden aan elkaar knopen.

Onderzoekingen van M E S E L S O N en S T A H L ^ ^ over de DNA-repli-catie bij E.coli hebben een antwoord gegeven op de vraag hoe tijdens de replicatie de oorspronkelijke en nieuw gevormde dubbelhelices ver-deeld worden tussen de twee cellen van het nageslacht. Door inge-nieuze proeven hebben ze aangetoond dat de DNA-replicatie semi-conservatief i s . Dat wil zeggen dat beide ketens van de DNA dubbel-helix zich scheiden waarna op elk van deze twee ketens een nieuwe DNA-streng wordt gesynthetiseerd waarbij dan twee dubbelhelices ont-staan. ledere dochtercel heeft op deze wijze de helft van het ouderlijke erfdeel in haar bezit gekregen. Een moeilijkheid is dat DNA een

spi-raalvormige structuur bezit. Om beide ketens te scheiden i s het nodig deze spiraal te ontwinden. Hiervoor zijn vele mechanismen voorgesteld waarbij ontwinden al dan niet gekoppeld is met de enzymatische repli-c a t i e . Vast staat in leder geval dat enkelstrengig DNA als intermediair bij de replicatie in bacteriën is aangetoond ' °. Nieuw licht op het mechanisme kan de ontdekking werpen dat de replicatie van faag T4 DNA en E.coli DNA discontinu verloopt^^"'^^'^^. Naast DNA-poly-merase speelt een ander reeds bekend enzym, het polynucleotide-ligase , hierbij een functionele rol. Het polymerase synthetiseert

korte ketens van dubbelstrengig DNA. Met behulp van het ligase worden deze fragmenten aaneengevoegd tot een groot DNA-molecuul van de oorspronkelijke lengte. Mechanismen zoals voorgesteld door O K A Z A K I c . s . ^ ^ ° en KORNBERG vormen wel de meest recente voorstelling van de replicatie.

b. Transcriptie

Naast gerepliceerd worden, het doorgeven van het genotype aan het nageslacht, bestaat de functie van het DNA uit de expressie van de informatie tot een bepaald fenotype. Hierbij moeten wij er van uit-gaan dat de enzymen, die bepaalde omzettingen en s y n t h e s e s kataly-seren, tezamen met structurele eiwitten de uiteindelijke verschijnings-vorm van de cel bepalen. Het sturen van bepaalde biochemische reac-ties door genen berust daarop dat deze genen aanleiding geven tot de productie van de overeenkomstige specifieke enzymen. Deze werkings-wijze wordt wel de " e e n gen — een enzym" hypothese genoemd. Om-dat gebleken is Om-dat enzymen vaak opgebouwd zijn uit meerdere poly-pe ptideketens is het beter te spreken over een " e e n cistron — een polypeptide" hypothese. De volgorde der nucleotiden in een cistron bepaalt de volgorde der aminozuren in een polypeptide. De genetische informatie in het DNA bevindt zich bij hogere organismen in de celkern terwijl de eiwitsynthese plaats vindt in het cytoplasma. In dit plasma komt een complex membraannetwerk voor, het "endoplasmatisch reti-c u l u m " . Aan deze membranen bevinden zireti-ch de ribosomen, partikels opgebouwd uit RNA en eiwit, die het vermogen bezitten polypeptiden te synthetiseren. Voor de overdracht van de Informatie van het DNA naar het ribosoom maakt de cel gebruik van een macromoleculaire bood-schapper. Het is een RNA, dat men de naam "messenger"-RNA (m-RNA) heeft gegeven.

Het m-RNA wordt gesynthetiseerd door een enzym, RNA-polyme-rase , uit de vier ribonucleoside-trifosfaten en heeft daarbij DNA als primer nodig. Een bepaalde eiwitcomponent geassocieerd met het en-zym schijnt verantwoordelijk te zijn voor de interactie met DNA . De lengte van een m-RNA molecuul hangt af van het aantal cistrons dat van het DNA wordt overgeschreven en ligt in de orde van 200 tot 3000 nucleotiden. Het juiste mechanisme van de DNA afhankelijke RN A-syn-these, transcriptie genaamd, is nog niet opgehelderd. Vast s t a a t in ieder geval dat s l e c h t s één keten van de DNA-dubbelhelix als matrijs dienst doet (zinvolle of " s e n s e " - k e t e n ) . Deze keten wordt in de rich-ting 3 ' • S ' overgeschreven waarbij een RN A-molecuul ontstaat, dat dezelfde nucleotide-volgorde bezit als de " a n t i - s e n s e " DN A-keten^ ^ met dien verstande dat in het RNA uracil de plaats van thymine heeft

ingenomen. Het RNA kan met de DNA-keten een hybride-molecuul vor-men met een dubbelhelix-structuur en als zodanig zelfs worden gefso-l e e r d ^ ^ ' ^ ^

Van het nieuw gesynthetiseerde RNA is ongeveer 1/3 deel m-RNA. In bacteriën is de levensduur van m-RNA betrekkelijk kort (half-waarde tijd van 1,5 minuut), bij andere organismen moet ook m-RNA met een langere bestaanstijd aanwezig zijn. Het resterende 2/3 deel wordt in ribosomen ingebouwd. Dit ribosomaal-RNA (r-RNA) wordt op dezelf-de wijze ais m-RNA van het DNA overgeschreven, dezelf-de levensduur is door de structurele functie echter veel langer. Onderzoek aan verschil-lende organlsm.en toont aan dat ongeveer 0,3% van het DNA gereser-veerd is voor de specificatie van ribosomaal-RNA

Antibiotica. Van bepaalde antibiotica en remstoffen, in dit onderzoek gebruikt, is bekend dat ze invloed uitoefenen op de DNA-replicatie en de transcriptie.

De bacteriostatische werking van acridine-derivaten, zoals acri-dinegeel en trypaflavine (= acriflavine), berust op interactie met nuclef-nezuren . Het belangrijkst is hierbij de binding aan DNA door-inter-c a l a t i e . Door de vlakke strudoor-inter-ctuur der drie aromatisdoor-inter-che ringen is het mogelijk dat het acrldlne bindt aan de nucleotidebasen. Het molecuul ligt hierbij tussen twee opeenvolgende basen van dezelfde polynucleo-tideketen, in een vlak ongeveer parallel met de vlakken der b a s e n . Door deze structuurverandering worden de DNA afhankelijke DNA- en RNA-polymerases geremd. De remming van RNA-polymerase blijkt hier-naast ook nog veroorzaakt te worden door directe interactie van het enzym met acridines.

De actlnomycines vormen ook stabiele complexen met DNA en remmen de DNA afhankelijke RNA-synthese. De juiste aard van het complex is nog niet bekend; intercalatie speelt hierbij geen rol^^. De natieve vorm wordt gestabiliseerd tegen thermische denaturatie wat een verklaring kan zijn dat de transcriptie wordt bemoeilijkt. De remming van de RNA-synthese kan ook worden veroorzaakt doordat interactie van actinomycine met DNA aanleiding geeft tot vorming van dimeren .

De werkingswijze van mitomycine C i s totaal verschillend. Deze verbinding remt bij bacteriën selectief de DNA-replicatie, terwijl RNA-en eiwitsynthese normaal doorgaan . Mitomycine, eRNA-en clkylerRNA-ende stof, veroorzaakt in vivo cross links tussen de beide complementaire ketens van het DNA-molecuul . Hierdoor kan de dubbelhelix zich niet meer ontwinden en dus ook niet meer volledig worden gerepliceerd.

De rifamycines remmen selectief de RNA-synthese door directe

7 1

interactie met het enzym RNA-polymerase . Het antibioticum vormt een zeer stabiel complex met het enzym, wat leidt tot inactivering van

enzym wordt geblokkeerd kan het polymerase dusdanig worden gemodi-ficeerd dat het niet meer in staat is een initiatiecomplex met DNA te

73

vormen c. Translatie

Onder translatie verstaat men de wijze waarop de ribosomen met behulp van het m-RNA en de aminozuren een polypeptide synthetiseren. Dit is de volgende stap in het proces der fenotypische expressie van de genotypische informatie.

Om aminozuren te polymeriseren tot een eiwit moeten ze voor het ribosoom beschikbaar zijn in een geactiveerde vorm. Deze vorm bestaat uit een complex met een molecuul transporteur- of transfer-RN A (t-RN A). Elk aminozuur heeft hiervoor zijn eigen t-RN.^. De koppelingsreactie tussen beide wordt door een daarvoor specifiek enzym, een s y n t h e t a s e , uitgevoerd. Er bestaan 20 aminozuren, dus ook tenminste 20 verschil-lende s y n t h e t a s e s , maar er zijn meer dan 20 verschilverschil-lende t-RNA's. Bij iedere t-RNA soort hoort echter slechts één soort aminozuur. Alle tRNA moleculen bezitten aan het 3' uiteinde der keten dezelfde b a s e -volgorde ACC De vorming van een aminoacyl-t-RNA complex vindt plaats doof koppeling van de carboxylgroep van het aminozuur aan een OH-groep van het eindstandige adenosine^^.

synth«tKB«a ^ / \ " " \ / poly««r«»« RlIA-poly««rBae « ^ DHA PLICATIB

t t

DIA < DHA » «-RIIA • polypeptide

REPLICATIE TRAflSCRIFTIK TRAHSLATIE

•ItoajelQ* acridInca rlfaayclne atreptoayclna,

actlDOsyclnaa tatracycliaa, aaonyclna,

chlooraaphaDlcol.

K

Fiq, 7 Expressie der genetische informatie en de invloed van enige antibiotica,

Het probleem hoe s l e c h t s vier basen in een m-RNA coderen voor 20 aminozuren leidde tot de ontdekking dat een volgorde van drie ba-sen, een codon, bepaalt welk aminozuur wordt ingebouwd. Door te werken met synthetische m-RN A's waarvan de base volgorde bekend was hebben de groepen van NIRENBERG, OCHOA en KHORANA de gehele genetische code kunnen ontraadselen. Met een geheel andere, de z.g. ribosomale bindingstechniek, zijn deze code-tripletten

beves-t i g d ' ^ . Overlapping van beves-triplebeves-tbeves-ten beves-treedbeves-t niebeves-t op. Bovendien zijn er twee tripletten (UAG en UAA) gevonden waarbij geen aminozuur hoort. Men neemt aan dat deze codons (amber en ocher) te maken hebben met de ketenterminatle en dus een rol van komma of punt in de boodschap spelen. Gebleken is ook dat, daar er 64 tripletten en slechts 20 amino-zuren zijn, de code gedegenereerd i s . Bepaalde aminoamino-zuren worden door meerdere tripletten gecodeerd, waarbij de variatie meestal in de derde letter zit. Ook is uit experimenten gebleken, dat de genetische code universeel i s , d.w.z. een bepaald triplet codeert voor hetzelfde amino-zuur in alle soorten van cellen. Een onderstaand m-RNA kan aanleiding geven tot een er bij weergegeven polypeptide:

5—C — U - C — A — A — G - A — U - U — U — U — U - A - A - A - U - A - A - 3 '

I I I I I I ' ' I I I I

Leu Lys l i e Phe Lys COOH

Door gebruik te maken van zeer bepaalde synthetische polynucleo-tiden en de eindstandige aminozuren van het gevormde polypeptide te bepalen^^ is vastgesteld dat het m-RNA afgelezen wordt in de richting 5' »• 3 ' . Een deel van de keten van een t-RNA past op een bepaald triplet. Doordat dit specifieke deel van het molecuul wat basevolgorde betreft complementair is aan het codon heeft men het de naam anti-codon gegegen. Zo is het antianti-codon van leucine-t-RNA dus G-A-G en dat van lysine-t-RNA is U-U-C.

Zoals reeds aangeduid vindt de eiwitsynthese plaats aan de ribo-somen. In het electronenmlcroscoop zien ze er uit als ruwe bolvormige deeltjes met een diameter van ongeveer 200 A. Ze bestaan uit twee subeenheden die bij stijgende Mg -concentratie combineren tot een ribosoom waarvan de grootte meestal gekarakteriseerd wordt door de sedimentatieconstante S. Afhankelijk van de soort organismen kent men 70 en 80 S ribosomen'^. Bacteriën bevatten 70 S ribosomen mét subdeeltjes van 30 en 50 S. Bij deze microorganismen blijken de ribo-somen zich reeds te hechten aan het m-RNA voordat de transcriptie is beëindigd . Meerdere ribosomen kunnen zich hechten aan één m-RNA molecuul, een dergelijke structuur heeft de naam polysoom gekregen. Er zijn aanwijzingen, dat ribosomen het m-RNA dissociëren van het DNA-polymerase-DNA-RNA complex^^, of mogelijk de 30 S ribosomale subeenheid hiervoor verantwoordelijk is . Uit kinetisch onderzoek is gebleken dat de ribosomen zich als een dichtopeengepakte groep langs het m-RNA bewegen, onmiddellijk achter het RNA-polymerase molecuul . Ieder ribosoom synthetiseert hierbij het polypeptide dat door het m-RNA molecuul wordt gecodeerd.

Het juiste mechanisme der aminozuurpolymerisatie is nog niet bekend; feit is echter dat naast het ribosoom ook andere eiwitten hier-bij een rol vervullen. Men neemt aan dat het aminoacyl-t-RNA wordt gedecoreerd aan het 30 S deeltje. Het e e r s t e complex, dot wordt aan-gehecht, wordt gedacht N-formyl-methionyl-t-RNA te zijn. Na aanhech-ten van een tweede aminozuur-t-RNA complex, waarbij steeds codon en anticodon voor de juiste combinatie zorgen, worden de twee aange-hechte aminozuuruiteinden aan elkaar verbonden terwijl de aminoacyl-binding met het e e r s t e t-RNA wordt verbroken. Dit t-RNA kan dan op-nieuw worden gebruikt. De groeiende peptideketen blijft s t e e d s via het

laatst aangehechte t-RNA aan het ribosoom verbonden. Het bestaan van zo'n peptidyl-t-RNA complex als Intermediair in de eiwitsynthese is aangetoond . Ketenterminatle vindt plaats door één van de non-sense-codons, waarna een bepaalde eiwitcomponent ( " r e l e a s e factor") zorgt voor het afstoten van de complete polypeptideketen . Hiertoe wordt de esterbinding met het l a a t s t e t-RNA bij gebruik van een natuur-lijk m-RNA reeds op het ribosoom gesplitst . De juiste wijze van op-vouwen van het natieve polypeptide wordt grotendeels bepaald door de aminozuurvolgorde. De vorming van de driedimensionale structuur wordt gedreven door de energiewinst wanneer een polypeptideketen, die een relatief instabiele conformatie heeft, wordt omgezet in het na-tieve eiwit. Volgens enige auteurs zou een enzym, gelocaliseerd op het endoplasmatisch reticulum, deze vouwreactie van de polypeptide-ketens van een groot aantal verschillende eiwitten katalyseren^^. Antibiotica

Een groot aantal antibiotica remt de groei van bacteriën door remming of verstoring van de eiwitsynthese aan ribosomen. Van vele is reeds bekend waar ze aangrijpen, maar het juiste mechanisme moet meestal nog worden opgehelderd. Daarom zal hier worden volstaan met een korte opsomming van wat bekend is over de werking van enige in dit onderzoek gebruikte remmers der eiwitsynthese.

Tetracycline hecht zich aan het 30 S ribosomaal deeltje op de plaats waar alle aminoacyl-t-RNA worden gedecodeerd^^. Hierdoor bindt geen der t-RNA complexen zich meer aan het ribosoom waardoor de eiwitsynthese stopt. Daarnaast is ook binding aan Mg"*""*" door tetra-cycline aangetoond . De gevolgen hiervan kunnen zijn dat verschil-lende enzymsystemen van hun co-factor worden beroofd.

De antibiotica streptomycine en neomycine, beide geproduceerd door Streptomyces s p e c i e s , hebben eenzelfde, nogal complexe, wer-kingswijze. Beide hechten zich aan de 30 S-ribosomale subeenheid, waardoor de binding van aminoacyl-t-RNA wordt gehinderd^^'^^. In

overeenstemming hiermee is dat resistente bacteriën een veranderd eiwit in het 30 S deeltje b e z i t t e n ^ ° . Afgezien van een groot aantal andere metabolische effecten neemt men aan dat de lethale werking van deze antibiotica in de eerste plaats toegeschreven moet worden aan initiatie-remming of miscodering. Zowel in vivo als in vitro is aan-getoond dat in aanwezigheid van neomycine of streptomycine het ribo-soom fouten maakt bij het aflezen van het m-RNA . Hierdoor worden eiwitten gesynthetiseerd met verkeerde aminozuren, waardoor ze niet meer functioneel kunnen zijn. De chemische structuur, verantwoorde-lijk voor de afleesfouten, is nog niet vastgesteld. TANAKA c . s . ^ ^ ° suggereren dat dit het streptamine of desoxystreptamine in het mole-cuul van deze antibiotica kan zijn. In tegenstelling met de

miscoderings-hypothese zijn de resultaten van MODOLELL en DAVIS . Deze onderzoekers toonden met een verbeterd eiwitsynthetiserend systeem aan dat de lethale werking van streptomycine zijn oorzaak vindt in een complete remming van de groei van de polypeptideketen.

De antibiotica chlooramphenicol, lincomycine en staphylomycine M hebben met elkaar gemeen dat ze zich alle hechten aan de 50 S ribo-somale subeenheid van gevoelige bacteriën '^'''^^. Omdat gebleken is dat ze competitie met elkaar leveren bij binding en als remmer van de eiwitsynthese antagonistisch werken, lijkt het waarschijnlijk dat

ze op nagenoeg dezelfde plaats op het 50 S deeltje aanhechten. Zo wordt de binding van chlooramphenicol door lincomycine of staphylo-mycine M verhinderd . In feite is het werkingsmechanisme van deze stoffen nog niet goed bekend. Men neemt aan dat door hun aanhechting conformatieveranderingen aan het ribosoom ontstaan. Er zijn aanwij-zingen dat chlooramphenicol inwerkt op de vorming van de peptidebin-ding ^ . Alhoewel is aangetoond dat lincomycine en staphylomycine M de binding van phenylalanyl-t-RNA aan 70 S ribosomen remmen^^'^^, lijkt het vooralsnog niet uitgesloten dat zij de vorming van de peptide-binding verhinderen. De werking van Staphylomycine S, dat naast eiwit-synthese ook DNA- en RNA-eiwit-synthese remt, is nog niet duidelijk. Het bindt in ieder geval op een andere plaats aan het ribosoom dan de drie voorgaande antibiotica .

De werkingswijze van puromycine als remmer van de eiwitsynthe-se i s geheel opgehelderd als gevolg van onderzoekingen naar het me-chanisme van de eiwitbiosynthese. Het is een structureel analogon van het acyladenosine-elnde van aminoacyl-t-RNA. Puromycine bindt de groeiende polypeptideketens, die door een transferase naar het volgen-de amino-acyl-t-RNA gebracht hadvolgen-den moeten worvolgen-den. Er zijn aanwij-zingen dat het wordt gehecht aan de acceptorzijde van het peptide-binding vormend enzym ^. Op deze wijze ontstaan zowel in vivo als in vitro (met synthetisch m-RNA) onafgemaakte polypeptideketens^®'^^'^""^

Puromycine is hierbij via een peptidebinding verbonden aan het car-boxyleinde van de polypeptides ,

Door het feit dat deze stof bij dierlijke systemen even werkzaam is als bij bacteriën, en ook in hoge mate toxisch i s , is deze verbinding als klinisch antibioticum onbruikbaar.

4. Mutatie

a. Mechanismen van mutatie

Door mutatie kan de structuur van een gen worden veranderd. De chemische achtergrond hiervan is dat de nucleotide-samenstelling en volgorde van een gen is veranderd, wat uiteindelijk leidt tot een veranderde aminozuursamenstelling van het corresponderend eiwit. Deze genotypische verandering kan leiden tot een ander fenotype, doordat b.v. er een inactief enzym of in het geheel geen enzym wordt geproduceerd. Hierbij dient te worden opgemerkt dat het verlies van een enzym niet altijd lethaal behoeft te zijn.

Er zijn verschillende soorten structurele veranderingen van een gen. Bij deleties zijn één of meerdere nucleotiden verloren gegaan. De gevolgen hiervan zijn, als één nucleotide verdwenen i s , dat alle volgende code-tripletten zijn veranderd. Een dergelijke verandering heeft dus polariteit (fig. 8). Indien een aantal nucleotiden is verdwe-nen wordt öf geen polypeptide gevormd óf s l e c h t s een deel der polypep-tideketen.

Lys Ser Pro Ser Leu Asn Ala

A A G A G U C C A U C A C U U A A U G C C parent type

l i l ' / / / / / / / / / / * / / i i i ' ^ i " ^ I I I f f t i ' f f * f * f f * * i i i I

A A G G' U c' C A' U' C' A ' C' U U A' A' U G G C C dubbelmutant

I 1 I 1 I ' I 1 I 1 I I ' •

Lys t Val His Hls Leu Met t Ala

A G Deletie Insertsie Fiq. 8 Invloed van deletie en insertie op de aminozuurvolgorde

van een polypeptide.

Bij inserties worden één of meerdere nucleotiden in de volgorde ingevoegd. Grote inserties komen tot stand door virussen. Insertie van één nucleotide heeft voor de tripletvolgorde dezelfde konsekwenties als deletie van één nucleotide; zo'n mutatie bezit dus ook polariteit. Fig. 8 laat zien hoe door deletie de boodschap is verstoord en deze door insertie weer kan worden hersteld.

derge-lijk geval is slechts één triplet veranderd. Hierdoor is in een enzym één aminozuur door een ander vervangen, wat soms resulteert in de vorming van een inactief enzym ( " m i s s e n s e " - m u t a t i e ) ^°^. Als het veranderde triplet niet codeert voor een aminozuur (UAA, UAG of UGA) leidt dit tot voortijdige beëindiging van de polypeptidesynthese tijdens de t r a n s l a t i e . In dit geval spreekt men van een nonsense-mutatie.

Mutaties kunnen spontaan optreden. De frekwentie waarmee dit plaats vindt varieert sterk in afhankelijkheid van de soort mutatie. Zo is de mutatiefrekwentie per bacterie per generatie tot s t r a l i n g s r e s i s -tentie bij E.coli 1.10~ , terwijl deze voor mutatie tot streptomycine-r e s i s t e n t i e bij vestreptomycine-rschillende bactestreptomycine-riën 1 tot 4.10"" bedstreptomycine-raagt. Voostreptomycine-r de meeste spontane mutaties mag men aannemen dat de frekwentie 10~® tot 1 0 - 1 ° is ^°2^

Er zijn echter agentia die de mutatiefrekwentie met een factor 10 tot 100 000 verhogen. Mutaties veroorzaakt door dergelijke muta-gene agentia of mutagentia worden gefnduceerde mutaties genoemd, in tegenstelling tot de eerder genoemde spontane mutaties. De meest be-studeerde mutagentia zijn: base-analoga ° (5-broomurqcil, 2-amino-purine), röntgenstralen 1°'*, ultraviolet licht^^^ (UV), salpeterig zuur, hydroxylamine en alkylerende stoffen waaronder het veel gebruikte N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine 1°^ (MNNG). Daarnaast zijn ook vele andere mutagentia ontdekt bij onderzoek aan microorganismen; zoals acridinekleurstoffen , die reeds genoemd zijn bij de replicatie-remmers, en eenvoudige chemische verbindingen waaronder mangaan en koperionen . Alhoewel de werking van de diverse mutagentia ver-schilt, zijn er een aantal voorbeelden van agentia die, doordat hun chemische affiniteit en mogelijke reacties bekend zijn, in verband ge-bracht kunnen worden met directe of indirecte effecten op DNA en DNA-replicatie. Aan de hand hiervan is het mogelijk een tamelijk algemeen en sterk vereenvoudigd beeld te geven van de reacties die kunnen lei-den tot een veranderd genotype door wijziging van de nucleotidevolg-orde.

De eerste fase is het ontstaan van een veranderd DNA doordat bepaalde basen, hetzij door rechtstreekse incorporatie of door modifi-catie onder invloed van het mutagens, chemisch verschillen van de nor-male. Zo verklaart men mutaties met base-analoga door aan te nemen dat door het optreden van tautomere structuren er een foute baseparing optreedt tijdens of na de inbouw van het analogon °^. Een dergelijke baseparing neemt men ook aan bij mutagentia die reageren met de DNA-basen. Zo reageren ethylerende mutagentia, zoals diethylsulfaat, hoofd-zakelijk met N-7 van guanine. De ontstane base zou dan ook kunnen paren met thymine daarbij een transitie van een basepaar GC in AT be-werkend. Hydroxylamine reageert specifiek met cytosine . De

ont-stone hydroxyamino-derivaten vormen overwegend baseparen met ade-nine, zodat het basepaar GC door AT wordt vervangen. Verwijdering van een b a s e uit DNA met behulp van een mutagens kan het optreden van transversies verklaren (d.w.z. dat een purinebase die verwijderd

i s , vervangen kan worden door een pyrimldinebase).

Uit vele onderzoekingen is gebleken dat gefnduceerde mutanten zich gewoonlijk pas na twee of meer generaties na de behandeling met een mutagens manifesteren. Verschillende factoren zijn hiervoor aan te wijzen. In het geval van replicatiefouten, na incorporatie van een base-analogon, zal er een tijd verlopen tussen de inbouw van zo'n base en de permanente verandering in basevolgorde ("copy error l a g " ) . Een andere reden voor vertraagde manifestatie van gefnduceerde mutaties is een uitstel van de celdeling, die kan optreden na zware doses van sommige mutagentia (b.v. UV). Mutaties schijnen het meest frekwent op te treden in cellen die zwaar beschadigd zijn door het mutagens.

Een belangrijke reden voor het uitstel van celdeling kan ook zijn het herstel van de door het mutagens aangerichte s c h a d e . Vele muta-gentia hebben n a a s t hun muterende ook een gelijktijdige lethale wer-king. De aangerichte schade kan zo groot zijn dat het organisme niet meer in s t a a t is e s s e n t i ë l e reacties te voltrekken of het eigen genoom te repliceren. Vele microorganisraen zijn echter in het bezit van enzym-systemen die schade aan het DNA aangebracht kunnen repareren. Zo is aangetoond dat beschadigingen aangericht door een grote verschei-denheid aan mutagentia zoals MNNG^^^, ethyl methaansulfonaat'1'^, a c r i d i n e s ' 1 ^ , en s t r a l i n g l ° ^ ' l ° ^ ' ^ ^^ (UV en ioniserend) in E.coli enzy-matisch kunnen worden gerepareerd. Het is waarschijnlijk dat voor deze verschillende beschadigingen eenzelfde, of nauw verwante, en-zymsystemen, waartoe ook behoort het systeem waarvan genetische recombinatie een deel uitmaakt, werkzaam zijn. B R I D G E S C . S . hebben zelfs aangetoond dat bij stralingsschade de enzymatische

DNA-repara-tie zelf mutageen is . Alhoewel dit mechanisme waarschijnlijk niet werkzaam is voor andere mutagentia, is blijkbaar in dit geval (naast het replicase) een ander enzym betrokken bij de fixatie van mutagene veranderingen in DNA.

b. Werking van gebruikte mutagentia

Koper

Koperionen zijn geen algemeen gebruikt mutagens in de trant van de eerder beschreven agentia. Incidentele gevallen zijn vermeld waar-bij door behandeling met Cu"*~'"-ionen waar-bij E.coli varianten ontstaan met een kleine kolonievorm 1 " ' ' ° . Mutaties naar auxotrofe cellen is niet

geconstateerd. Aangezien deze kleine kolonievorm in bepaalde geval-len erfelijk i s moet men aannemen dat het een genotypische verande-ring b e t r e f t ^ ' " . Hoe Cu'*'"'' als mutagens werkzaam is, is niet erg duide-lijk. Cu''"''-ionen geven interacties met vele componenten in de levende cel . Koper geeft ook complexen met DNA waarvan geconstateerd is dat ze de T van het DNA verlagen bij stijgende Cu''~'"-concentra-^.jgll8,ll9_ gjj kamertemperatuur binden de Cu"'""''-ion en alleen aan de fosfaatgroepen van DNA . Bij verhoging van de temperatuur dringen de ionen ook de helix binnen en vormen een complex met de purineba-s e n . Aangenomen wordt dat het Cu'*"'" hoofdzakelijk bindt aan de N7 van guanine. Men zou zich kunnen voorstellen dat zo'n complex, dat ook optreedt met dGTP, tijdens replicatie aanleiding kan geven tot fouten bij baseparing.

5-Fiuoruracii

5-Fluoruracil (FU) is een antagonist van uracil. In aanwezigheid van FU wordt de groei en DNA-synthese sterk geremd. Eiwit- en RNA-synthese gaan normaal door . Het ongebalanceerde metabolisme uit zich vaak in kleine kolonievormen. FU kan tot een hoog percentage uracil vervangen in m-RNA^^^ t-RNA ^^^ en r-RNA 1^^. Het gesubsti-tueerde systeem is nog steeds in s t a a t functionele eiwitten te produ-ceren. Ook wordt FU in de cel gemetabollseerd tot 5-fluoruracil-desoxy-rlbosefosfaat (FUdRP) dat een sterke remmer is van het enzym thymi-dylaat-synthetase, waardoor de DNA-synthese wordt gestopt .

Muta-l o r

geen werkt FU bij RNA-virussen zoals tabakmozaïk virus , bij bac-teriën i s echter alleen melding gemaakt van enzymen met veranderde eigenschappen ^. BUJARD en H E I D E L B E R G E R nemen aan dat FU zich soms als cytosine voordoet tijdens transcriptie, virus RNA-repli-c a t i e of translatie .

Ultraviolet licht

Aan het effect van straling op bacteriën en hun DNA is en wordt door zeer veel onderzoekers gewerkt. Cver de werking van UV en mu-tatie zijn een aantal overzichtsartikelen verschenen 1° ^'1^^'1^^'l""*, zodat hier volstaan zal worden met een korte samenvatting en enige recente ontdekkingen.

Uit actiespectra werden aanwijzingen verkregen dat de lethale en mutagene effecten van UV-bestraling een gevolg zijn van de absorp-tie van fotonen door nuclefnezuren. Gedurende de afgelopen 10 jaar is het gelukt bepaalde biologische effecten van UV te verklaren a l s s p e -cifieke veranderingen in DNA. Inmiddels zijn een groot aantal

foto-producten in bestraald DNA aangetoond en schattingen verkregen over hun bijdrage tot de lethale werking van UV °. Het belangrijkst zijn de pyrimidine-dimeren. Het eerst i s door B E U K E R S en B E R E N D S I ' ^ I ontdekt dat twee moleculen thymine een cyclobutaan-type dimeer kun-nen vormen (Fig. 9). In mindere mate ontstaan in DNA ook thymine-cytosine en thymine-cytosine-thymine-cytosine dimeren. Hydratatle speelt een veel

O O NH' CHo HoC

H JL

F i g . 9 Fotoproducten van pyrimidines. I Di-thymine.

II 6-Hydroxy-5-hydro-cytosine.

geringere rol. Cytosine wordt gehydrateerd aan de 5-6 dubbele bind-ding waardoor het 6-hydroxy-5-hydroderivaat ontstaat (fig. 9). Alhoewel eerder aangenomen werd dat cytosinehydraat alleen in de enkelstreng-gedeelten van DNA ontstaat lijkt dit niet waarschijnlijk. Betere che-mische bepalingen hebben aangetoond dat op elke tien thymine-dlmeren drie cytosinehydraten ontstaan , aanmerkelijk meer dan men eerder dacht. Voorts zijn er een aantal fotoproducten waarvan de bijdrage tot lethallteit wordt geschat op een factor 1000 lager dan die van de dime-ren. Zo treedt ook ketenbreuk op, meestal in één keten. Tussen de twee ketens kunnen " c r o s s - l i n k s " optreden. Alhoewel men aanvankelijk dacht dat hierbij thymine-dlmeren een rol spelen moet de conclusie thans zijn dat de chemische aard van de " c r o s s l i n k s " in feite nog onbekend is. Ook worden " c r o s s l i n k s " gevormd tussen DNA en eiwit. Er zijn aanwijzingen dat cytosine en thymine in DNA kunnen reageren

T O O

met de aminozuren cysteine, tyrosine en serine . Partiële denatura-tie van het DNA, een effect dat tijdens bestraling met UV ook optreedt, kan de vorming van beide soorten " c r o s s l i n k s " bevorderen.

Vele van deze fotoproducten vormen voor het enzym DNA-poly-merase een onneembare hindernis, wat leidt tot lethallteit. Bacteriën bezitten doorgaans mechanismen om UV-beschadlgd-DNA te repareren. Twee zijn er aangetoond die onder genetische controle staan : (1) monomerisatie van pyrimidine-dimeren door de werking van een enzym en licht^^^ (fotoreactivering), en (2) enzymatische excisie van

pyrimidine-dimeren van het DNA in afwezigheid van licht, gevolgd door herstel van de gapingen, door excisie ontstaan . Het laatste mecha-nisme is een meerstapsproces waarbij verschillende enzymen zijn be-trokken. De reparatieprocessen bepalen op hun beurt ook de mutatie-inductie.

Er zijn aanwijzingen dat voor mutatiefixatie DNA-synthese ver-eist i s . Deze fixatie kan optreden gedurende replicatieve synthese (replicatiefouten) of gedurende h e r s t e l s y n t h e s e (reparatiefouten).

BRIDGES en M U N S O N ' ' ^ ^ hebben aangetoond met een stam van E.coli, deficiënt in excisie-reparatie, dat pyrimidine-dimeren mutageen zijn doordat een verkeerde base Ingebouwd wordt tegenover het dimeer. Deze fixatie treedt alleen op tijdens DNA-replicatie. B R I D G E S C S . ^ ^ ^ hebben ook argumenten gegeven dat het excisie-herstelproces mutaties veroorzaakt. Er zijn aanwijzingen dat het opvullen van de gapingen in DNA door fouten mutaties fixeert. Het cytosinehydraat wordt in het RNA-polymerasesysteem herkend als uracil of thymine. G R O S S M A N neemt aan dat het meest waarschijnlijke fotoproduct verantwoordelijk voor mutagenese van DNA het cytosinehydraat i s ^ ' ' ^ . Ook hier zouden dan replicatiefouten transities van basenparen GC in AT veroorzaken. Wegens het ontbreken van een enzymatisch reparatiemechanisme en het frekwente ontstaan van cytosinehydraat wint deze hypothese aan aantrekkelijkheid.

Röntgenstraling

De lethale werking van ioniserende straling wordt evenals bij UV veroorzaakt door beschadigingen van DNA ^. De effecten zijn echter gecompliceerder omdat naast directe energie-absorptie ook in waterig milieu radicalen ontstaan, die op hun beurt het DNA beschadi-gen 1°^. Er zijn drie categorieën waarbeschadi-genomen: (1) ketenbreuk door splitsing van de fosfaat-esterbindingen, zowel door directe energieab-sorptie als door radicalen, waarvan de vorming niet afhangt van stof; (2) chemische veranderingen of destructie van basen; een zuur-stof afhankelijke reactie ook middels radicalen; (3) " c r o s s l i n k s " binnen een keten of tussen de twee ketens of aan eiwit. De ketenbreuk

1 o Q I T O kan enkel-of dubbelstrengig zijn. Zowel met fagen ° als met E.coii

is bewezen dat dubbelstrengige breuken lethaal zijn, enkelstrengige breuken daarentegen niet. Evenals bij UV-bestraling treedt partiële denaturatie van DNA op, echter niet door de vorming van enkelstrengige breuken . De baseveranderingen door ioniserende straling betreffen hoofdzakelijk de pyrimidines. F R E I F E L D E R neemt aan dat het thymine hierbij het belangrijkste i s . Deze veronderstelling wordt steund door het feit dat bij bestraling van verschillende DNA's de

ge-voeligheid afneemt met een afname in het AT-gehalte van het natieve DNA 1^1°. Deze bevindingen spreken eerdere analyses van K A P L A N en ZAVARINE^^I tegen. Hieruit blijkt dat een afname van het GC-gehalte samengaat met toenemende s t r a l i n g s r e s i s t e n t i e .

Schade aangericht door ioniserende straling kan worden hersteld door hetzelfde excisie-herstelmechanisme dat ook werkzaam is bij UV-schade^ 1^. Er zijn eveneens aanwijzingen dat het herstel van en-kelstrengige breuken onder genetische controle staat 1°^. Of de che-mische verandering van thymine leidt tot replicatiefouten is nog niet bekend. Vast staat dat het excisiemechanisme op dezelfde wijze als bij UV-schade betrokken is in het mutatieproces. Hierbij ontstaan AT •GC transities 11^.

c. Mutanten met veranderde DNA-samenstelling

In wezen betekent iedere puntmutatie, deletie of insertie een verandering van de basesamenstelling. Men moet echtereen onderscheid maken tussen meetbare en niet-meetbare veranderingen. De meeste baseanalysemethoden hebben geen grotere nauwkeurigheid dan ±0,5%GC. In het geval van b.v. E.coli, waar het DNA ongeveer 5.10^ baseparen bevat, die zo'n 3000 cistrons vormen, zal één of enige puntmutaties, of zelfs deletie van een heel cistron, de DNA-samenstelling niet meet-baar veranderen.

Toch zijn in de literatuur in toenemende mate mutaties vermeld, die vergezeld gingen van een zeer grote verandering in de DNA base-samenstelling. Het eerste geval is beschreven door SPIRIN c . s . in 1958. Deze onderzoekers beweren mutanten te hebben verkregen met een GC-gehalte van 67 of 43% uit darmbacteriën met een GC-percen-tage van 52, door ze eenvoudig in gedestilleerd water gedurende lange tijd aan te houden of door langdurig door te kweken, W E E D ver-meldt de isolatie van een koper-gefnduceerde mutant van Bacillus sub-tilis met 65% GC in plaats van de 42% in de uitgangsstam. D E L E Y , een onderzoek verrichtend naar de invloed van mutatie op de DNA-sa-menstelling bij enige bacteriën, maakte melding van een UV-gefndu-ceerde mutatie bij Agrobacterium tumeiaciens met een verandering van 3,7% GC. Deze publikatie is de directe aanleiding geweest tot het hier vermelde onderzoek, mede vanwege onze i n t e r e s s e in de werking van UV op DNA. In de loop van ons onderzoek aan A.fumefaciens zijn der-gelijke mutaties voor vele andere microorganismen beschreven door de groep van G A U S E en recent samengevatl"*^. Met FU of UV als belang-rijkste mutagentia werden grote veranderingen in base-samenstelling vermeld, e.g. Staphyiococcus aureus 38% GC, Bacterium paracoli 15%, B.subtilis 21%. Voor bepaalde gevallen als B.subtilis 168^"'® en

B.pa-racoli 50991"*^ zouden de mutatie-frekwenties dermate hoog zijn dat men de mutanten volgens een routineprocedure moet kunnen isoleren. Tot slot hebben M U L L E R en K E R N ' ^ ^ melding gemaakt van röntgen-mutanten van Azotobacfer cbroococcum; de verschillen in DNA-samen-stelling waren hier niet zo groot, in een enkel geval maximaal 5% GC.

Op DE LEY na heeft geen der onderzoekers zich er aan gewaagd een verklaring te geven van het mechanisme der veranderingen. Een logisch gevolg is dat vele microbiologen zeer sceptisch staan tegen-over deze soort mutaties, sterker nog velen zijn er van tegen-overtuigd dat het hier gaat om contaminaties. Er zijn echter een aantal gevallen be-kend van mutaties met veranderde DNA-samenstelling, die wel alge-meen geaccepteerd worden. Zo zijn er mutaties die het mitochondriaal-DNA (M-mitochondriaal-DNA) van gist betreffen. De genetische functie van M-mitochondriaal-DNA i s op dit moment nog open voor d i s c u s s i e . Bekend is dat met acridine-kleurstoffen uit Saccharomyces cerevisiae " p e t i t e " - m u t a n t e n geïso-leerd kunnen worden. Dergelijke mutanten zijn ademhalingsdeficiënt. Van een bepaalde k l a s s e , de suppressieve, "petite"-mutanten blijkt het .M-DNA sterk in samenstelling te zijn veranderd . Het mutant M-DNAheeft een samenstelling van 96% AT tegen het wilde type 83% AT. Het is niet voorstelbaar dat een dergelijk DNA, dat nagenoeg uit al-leen A en T i s opgebouwd, nog zinvolle genetische informatie bevat. Ook een geval van zeer grote deletie is bekend. Een bepaalde mutant, b2b5, van de lambda faag is uit het wilde type ontstaan doordat maar liefst 22% van het DNA verdwenen i s ' ^ ^ . De invloed hiervan op de DNA-samenstelling is niet onderzocht.

Een andere k l a s s e mutanten met veranderde DNA-samenstelling, die wat ontstaan betreft wezenlijk verschillen van de eerder genoemde, is die der mutator-mutanten, zowel bij faag als bij bacteriën. In zo'n geval is een mutator-gen aanwezig dat er voor verantwoordelijk i s dat er een ongewoon groot aantal puntmutaties tijdens de replicatie ont-staan. Zo is waargenomen dat bij een mutatorstam, mut T, van E.coli na 1500 generaties het percentage GC van het DNA 0,5% gestegen was . De mutatorgefnduceerde mutaties gaan in één richting en blijken transversies AT »• CG te zijn. Ook van bacteriofagen zijn mutatorstammen geïsoleerd. Er zijn mutator-mytanten van faag fd ge-ïsoleerd die een hoger percentage GC bezitten dan het wilde type. Ook hier zijn uitsluitend mutaties in één richting gevonden . De waarge-nomen verschillen zijn groter dan bij E.coli mut T, tot een maximum van 5% GC.

De eerder beschreven mutanten verschillen wezenlijk hiermee. Veel grotere veranderingen zouden tot stand gekomen zijn in één mu-tagene behandeling. Door de veelheid aan publikaties i s in ons onder-zoek ook een groter aantal bacteriën betrokken, t.w. A.tumeiaciens,

B.subtilis, S.aureus en B.paracoli. Hierdoor kon de probleemstelling algemener worden. Zij valt uiteen in twee delen:

1. Hebben wij te maken met mutanten of contaminanten? Ter beantwoor-ding van deze vraag is het noodzakelijk dat de beschreven mutatie-experimenten reproduceerbaar zijn.

2. Bestaat er genetische verwantschap tussen de zogenaamde mutanten en hun ouderlijk type? Cm dit na te gaan hebben wij de homologie van de respectievelijke DNA's bepaald met behulp van DNA-DNA hybridi-s a t i e .

d. DNA-DNA hybridisatie

Worden oplossingen van thermisch gedenatureerd DNA snel afge-koeld dan vormen zich toevallige waterstofbruggen binnen één of tus-sen twee verschillende ketens, maar de ongeordende kluwen-configu-ratie blijft bestaan. Wordt zo'n oplossing echter langere tijd op een temperatuur van 60 tot 70° C gehouden (MARMUR en D O T Y ' ^ ' ' geven hiervoor 25° beneden de T op) dan treedt een renaturatie op. Er ont-staan dan weer complementair gepaarde stukken DNA met een dubbel-helix-structuur. Door de heterogeniteit van de meeste DN A-preparaten blijven aan een of beide einden van de nieuwe dubbelspiraal kluwens van enkelstreng DNA uitsteken. Deze renaturatie (Engels " a n n e a l i n g " ^ uitgloeien) kan b.v. door meting van het hypochroom effect worden ver-volgd. De vorming van dubbelstrengig DNA laat zich ook aantonen in dichtheidsgradiënten . Overeenkomst tussen twee soorten DN A-mole-culen i s voor het eerst met deze methode' aangetoond. Er ontstaan dan dubbelhelices waarvan de beide ketens afkomstig zijn van verschillen-de, maar genetisch verwante organismen. Door zijn tekortkomingen is deze methode nooit gebruikt voor kwantitatieve routinebepaling van DNA-homologie.

Het gevolg van het bovenstaande i s wel geweest dat er een aan-tal zeer bruikbare methoden voor hybridevorming tussen DNA's van ver-schillend origine zijn ontwikkeld. Alle volgen min of meer dezelfde werkwijze. Hoogmoleculair enkelstrengig DNA van een bepaald orga-nisme wordt gefmmobiliseerd door het op te sluiten in een agar gel , of door het te hechten aan een nitrocellulosemembraan . Het i s dan niet meer in s t a a t te renatureren, maar de mogelijkheid tot het vormen van complementaire interacties met andere vrije nuclefnezuren blijft b e s t a a n . Het vastgelegde DNA wordt daarom gefncubeerd met een op-lossing van gedenatureerd DNA van hetzelfde of een verwant organis-me. Cm de duplexvormiing te kunnen vervolgen is dit DNA radioactief gemerkt. Bovendien is het raoleculairgewicht van het gemerkte DNA kunstmatig (door ultrasonische behandeling of hoge schuifspanning)

verlaagd om de beweeglijkheid der moleculen te vergroten. Hierdoor i s de kans vergroot dat zo'n molecuul het complementaire stuk op het vastgelegde DNA kan vinden. De op deze wijze gevormde dubbelstren-gige moleculen kunnen van de rest van het gemerkte DNA worden ge-scheiden door na incubatie de gel of het filter te wassen.

Enkelstrengig (gemerkt) DNA geeft geen interactie met agar, het heeft echter wel een hoge affiniteit voor nitrocellulose. Om dit niet specifiek gebonden DNA te verwijderen wordt het nltrocellulosefilter bij de methode van WARN AAR en COHEN gewassen met een buffer van lage ionensterkte en hoge pH. Bij de andere methodes wordt deze onspecifieke hechting door toevoegen van bepaalde chemicaliën voor-komen. In de veelgebruikte methode van D E N H A R D T wordt het fil-ter daarom geprefncubeerd met een oplossing van albumine, ficoll en polyvinylpyrrolidon. L E G A U L T - D E M A R E C . S . ^ ° hybridiseren in aan-wezigheid van dimethylsulfoxyde. Na wegwassen van het incubatie-mengsel kan, doordat het ingebrachte DNA radioactief gemerkt i s , het percentage der moleculen worden bepaald dat een specifieke duplex gevormd heeft.

Het gebruik van DNA-homologie bij taxonomisch onderzoek heeft voordelen boven de klassieke werkwijzen. Taxonomische analyse, al-hoewel gebaseerd op honderd of meer fenotypische eigenschappen, be-perkt zich tot een klein deel van het gehele bacteriegenoom. De werke-lijke hoeveelheid gemeenschappewerke-lijke genetische informatie bij twee organismen kan hiervan verschillen. DNA-homologie als hulpmiddel bij taxonomisch onderzoek in de genera Agrobacterium, Rhizobium, Chromobacterium, Pseudomonas en Xanthomonas door DE LEY en me-dewerkers ^^ 1'1^^'^^^ toont overduidelijk de bruikbaarheid aan van deze methode voor het vaststellen van genetische verwantschap bij bacteriën.