Diagnostyka grzybiczego zapalenia rogówki – aspekty kliniczne

(1)

FORUM ZAKAŻEŃ 2020;113:131134 © Evereth Publishing, 2020

KATARZYNA E. NOWIK1_{| KAMIL NOWIK}1_{| BEATA SULIKTYSZKA}2,3_{| MARTA WRÓBLEWSKA}2, 3_{| JUSTYNA IZDEBSKA}1, 4_| JACEK P. SZAFLIK1,4

DIAGNOSTYKA GRZYBICZEGO ZAPALENIA ROGÓWKI  ASPEKTY

KLINICZNE

DIAGNOSTICS OF FUNGAL KERATITIS  A CLINICAL OVERVIEW

PRACA POGLĄDOWA

ORCID*: 0000-0002-4506-0133 | 0000-0002-7209-9498 | 0000-0001-5647-2443 | 0000-0002-6786-9363 | 0000-0002-5289-6860 | 0000-0001-9100-0847

1 Samodzielny Publiczny Kliniczny Szpital Okulistyczny w Warszawie

2 Zakład Mikrobiologii Stomatologicznej Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego 3 Zakład Mikrobiologii Centralnego Szpitala

Klinicznego, Uniwersyteckie Centrum Kliniczne Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego

4 Katedra i Klinika Okulistyki Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego

} KAMIL NOWIK

Samodzielny Publiczny Kliniczny Szpital Okulistyczny w Warszawie,

ul. Sierakowskiego 12, 03-709 Warszawa, e-mail: nowikkamil2@gmail.com Wpłynęło: 02.06.2020

Zaakceptowano: 12.06.2020 DOI: dx.doi.org/10.15374/FZ2020018 *według kolejności na liście Autorów

STRESZCZENIE: Grzybicze zapalenie rogówki jest infekcją o globalnym zasięgu. Etiologia tej choroby różni się w zależności od szerokości geograﬁcznej, społeczno-ekonomicznego rozwo-ju danego krarozwo-ju i warunków klimatycznych. Zakażenia grzybicze rogówki spowodowane ro-dzajem Aspergillus spp. i Fusarium spp. częściej występują w krajach, w których panuje klimat tropikalny i subtropikalny, natomiast zakażenia grzybicze rogówki spowodowane rodzajem

Candida spp. dominują w klimacie umiarkowanym. Obecność patogenów grzybiczych

w ba-daniu mikroskopowym oraz izolacja grzybów w hodowli jest złotym standardem diagnosty-ki laboratoryjnej. Hodowla grzybów pleśniowych oraz drożdżaków jest jednak czasochłonną procedurą. Inne metody diagnostyczne, takie jak mikroskopia konfokalna in vivo oraz optycz-na koherentoptycz-na tomograﬁa przedniego odcinka oka (AS-OCT), umożliwiają obrazowanie tkanki rogówki w czasie rzeczywistym in vivo. Techniki molekularne w czasie rzeczywistym ułatwiają szybką diagnozę grzybiczego zapalenia rogówki. Wiarygodna identyﬁkacja gatunku czynnika etiologicznego za pomocą metod molekularnych może być pomocna we właściwym ukierun-kowaniu terapii. Celem niniejszej pracy jest przedstawienie aktualnej wiedzy na temat etiologii, czynników ryzyka oraz diagnostyki klinicznej i laboratoryjnej grzybiczego zapalenia rogówki. SŁOWA KLUCZOWE: diagnostyka grzybiczego zapalenia rogówki, grzybicze owrzodzenie ro-gówki, grzybicze zapalenie rogówki

ABSTRACT: Fungal keratitis has a worldwide distribution. Dominant aetiology depends on the geographical region, socioeconomical development and climate. Fungal keratitis caused by

Aspergillus spp. and Fusarium spp. occur more frequently in tropical and subtropical regions,

while fungal keratitis caused by Candida spp. predominate in moderate climate zones. The gol-den standard of laboratory diagnostics of fungal keratitis are microscopic examination and cul-ture. However, culture is a time-consuming procedure, therefore in vivo confocal microscopy and eye anterior segment optical coherent tomography (AS-OCT) are used for real-time cor-neal visualization in vivo. Furthermore, real-time molecular techniques contribute to a fast dia-gnosis of fungal keratitis. Reliable species identiﬁcation with molecular methods may be useful in determining proper treatment. The purpose of this article is to present an updated review on aetiology, risk factors, clinical and laboratory diagnostics of fungal keratitis.

KEY WORDS: diagnostics of fungal keratitis, fungal corneal ulcer, fungal keratitis

WSTĘP

Grzybicze zapalenie rogówki zostało po raz pierwszy zdiagnozowane w 1879 roku u rolnika, który doznał ura-zu oka. Mykotyczne zapalenie rogówki stanowi jedną z naj-gorzej rokujących infekcji ocznych, może prowadzić do

ślepoty, a nawet utraty gałki ocznej [24]. Pomimo że infek-cje grzybicze występują częściej w krajach, w których panu-je klimat tropikalny oraz subtropikalny (w tych obszarach mogą stanowić nawet 40% wszystkich przypadków infekcji), to zapalenia rogówki o etiologii grzybiczej coraz częściej są spotykane w Polsce [8, 23, 24].

Artykuł jest dostępny na zasadzie dozwolonego użytku osobistego. Dalsze rozpowszechnianie (w tym druk i umieszczanie w sieci) jest zabronione i stanowi poważne naruszenie przepisów prawa autorskiego oraz grozi sankcjami prawnymi.

(2)

FORUM ZAKAŻEŃ 2020;113

132 © Evereth Publishing, 2020

Wiele danych pokazuje, że grzybicze zapalenia rogówki są trudniejsze w leczeniu i mają gorsze rokowanie w porów-naniu do infekcji bakteryjnych [19, 30]. Związane to jest z: trudnościami w zakresie diagnostyki mykologicznej, opóź-nionym rozpoznaniem etiologii zapalnej, wąskim spektrum dostępnych leków przeciwgrzybiczych oraz ich słabą pene-tracją do gałki ocznej. Czasami samo leczenie farmakolo-giczne jest niewystarczające, a istnieje potrzeba wykonania procedur chirurgicznych, takich jak cross-linking czy prze-szczepienie rogówki. Bardzo ważna jest właściwa diagno-styka przyczyny zapalenia, a tym samym włączenie odpo-wiedniego, ukierunkowanego leczenia. Istotną rolę odgrywa współpraca okulisty z mikrobiologiem. Odpowiednie postę-powanie umożliwia wyleczenie zapalenia, ochronę przed ślepotą czy utratą gałki ocznej.

CZYNNIKI ETIOLOGICZNE GRZYBICZEGO

ZAPALENIA ROGÓWKI

Wśród najczęstszych patogenów grzybiczych powodują-cych infekcje rogówki występują morfologicznie różne grzy-by pleśniowe (wśród nich: Fusarium spp., Aspergillus spp., Curvularia spp., Alternaria spp.) oraz drożdżaki z rodza-ju Candida spp. Nowik i wsp., analizując przypadki grzybi-czych owrzodzeń rogówki, podawali grzyby pleśniowe jako główny czynnik wywołujący infekcje [19]. Analiza zapaleń grzybiczych w krajach, w których panuje klimat podobny do polskiego (Niemcy, Szwajcaria, Irlandia), również wykazała, że głównym czynnikiem etiologicznym były grzyby pleśnio-we [9, 13, 22]. Nie jest to jednak regułą. W pracach pocho-dzących z Wielkiej Brytanii czy Danii wykazano, że domi-nującą grupą grzybów odpowiedzialnych za grzybicze zapa-lenia rogówki są drożdżaki [18, 29].

DIAGNOSTYKA GRZYBICZEGO ZAPALENIA

ROGÓWKI

Diagnostyka infekcji grzybiczych gałki ocznej opiera się na: dokładnie zebranym wywiadzie z pacjentem odnośnie czynników ryzyka, obrazie klinicznym w lampie szczelino-wej, dodatkowych badaniach okulistycznych (w tym mikro-skopii konfokalnej oraz optycznej tomografii koherentnej przedniego odcinka gałki ocznej), a także na badaniach mi-krobiologicznych i genetycznych.

WYWIAD

Lekarz okulista powinien zebrać dokładny wywiad z pa-cjentem odnośnie potencjalnych czynników ryzyka infekcji. Do głównych czynników ryzyka związanych z infekcją grzybiczą w oku należy uraz materiałem roślinnym. Zwykle

do takich zdarzeń dochodzi podczas pracy w rolnictwie. Drugi najczęstszy czynnik wpływający na rozwój zakażeń grzybiczych gałki ocznej stanowi noszenie soczewek kon-taktowych. Obydwa czynniki predysponują do rozwoju za-paleń grzybiczych wywołanych przez grzyby pleśniowe i do-tyczą raczej młodych osób bez obecnych chorób towarzy-szących oraz wcześniejszych schorzeń oczu. Z kolei prze-wlekła steroido- i antybiotykoterapia, choroby powierzch-ni oka, przebyte zabiegi operacyjne (przeszczepiepowierzch-nie ki, chirurgia refrakcyjna), wcześniejsze zapalenia rogów-ki o etiologii wirusowej wywołane przez wirus opryszczrogów-ki zwykłej (ang. herpes simplex virus – HSV) lub wirus ospy wietrznej – półpaśca (ang. varicella-zoster virus – VZV), a także choroby związane z obniżoną odpornością (cukrzy-ca, nowotwory) predysponują do rozwoju zakażeń o etiolo-gii drożdżakowej [19].

BADANIE MIKROSKOPOWE

Badanie preparatu bezpośredniego z pobranej rogówki lub zeskrobin rogówki jest szybką i dostępną metodą sto-sowaną w diagnostyce zapalenia rogówki. Przygotowanie preparatu z zeskrobin rogówkowych lub z pobranej rogów-ki w 10% wodorotlenku potasu (KOH) i ocena pod mikro-skopem, pod kątem obecności strzępek grzybni lub komó-rek drożdżaków, jest prostą i niedrogą metodą, która ułatwia diagnostykę choroby [26]. Inną techniką wykorzystania pre-paratu bezpośredniego jest barwienie metodą Grama. Czu-łość, swoistość, dodatnia wartość predykcyjna i ujemna wartość predykcyjna zostały określone przez Bharathi i wsp. odpowiednio na: 99,3%; 99,1%; 98,5% i 99,6% [3]. Na czu-łość techniki barwienia preparatu mikroskopowego z uży-ciem 10% KOH negatywny wpływ może mieć niewystar-czająca ilość zeskrobin, mały rozmiar owrzodzenia rogówki oraz brak doświadczenia lekarza lub diagnosty laboratoryj-nego badającego preparat bezpośredni.

Barwienie metodą Grama ma mniejszą czułość niż bar-wienie z użyciem 10% KOH i nie jest techniką zalecaną w mykologii. Nie wszystkie grzyby ulegają wybarwieniu po zastosowaniu opisanej metody, toteż użycie tej techniki bar-wienia może spowodować błędy w diagnostyce. Do innych metod barwienia preparatu bezpośredniego należy barwie-nie hematoksyliną i eozyną, solami srebra według Gomo-riego, bielą fluorowapniową, oranżem akrydyny i innymi barwnikami fluorescencyjnymi [17]. Metody te mają różną czułość i swoistość. Ze względu na duży koszt oraz czaso-chłonność barwienia nie są powszechnie stosowane.

HODOWLA

Wszystkie próbki należy posiać na odpowiednie pod-łoża hodowlane. Do hodowli grzybów stosuje się podłoże Sabourauda [25, 27]. Wyniki hodowli są wysoce swoiste,

(3)

natomiast czułość jest mała. Hodowla na podłożach wraz z oceną preparatu bezpośredniego pozostają nadal złotym standardem w diagnostyce zakażeń grzybiczych rogów-ki i stanowią potwierdzenie grzybiczej etiologii zakażenia. Ze względu na małą objętość materiału w diagnostyce zaka-żenia grzybiczego rogówki należy uwzględnić zastosowanie płynnych podłoży hodowlanych [25, 27].

Wyniki hodowli trzeba interpretować z ostrożnością ze względu na powszechne występowanie grzybów pleśnio-wych w naturze. W związku z tym za istotne należy uznać wyniki hodowli, w których spełnione jest co najmniej jedno z następujących kryteriów:

t X[SPTUUFHPTBNFHPHBUVOLVHS[ZCBHS[ZCØXXڀXJʒDFK niż jednym podłożu hodowlanym;

t [MFXOZ X[SPTU Xڀ NJFKTDV [BT[D[FQJFOJB Xڀ KFEOZN podłożu;

t J[PMBDKBUFHPTBNFHPHBUVOLVHS[ZCBHS[ZCØXXڀQP-wtarzanych hodowlach;

t XZOJLIPEPXMJLPSFTQPOEVKʇDZ[ڀPCSB[FNLMJOJD[OZN [4, 25].

Oprócz zastosowania hodowli jako narzędzia diagno-stycznego może ono również być wykorzystane do oznacze-nia lekowrażliwości wyhodowanego szczepu oraz przewidy-wania wyniku leczenia. U pacjentów z potwierdzonym grzy-biczym zapaleniem rogówki dodatni wynik hodowli (mimo stosowania terapii) może mieć charakter informacyjny co do rokowania, ponieważ zaobserwowano, że pacjenci z utrzy-mującym się po sześciu dniach leczenia pozytywnym wyni-kiem hodowli mieli: znacznie gorszy wynik najlepszej sko-rygowanej ostrości wzroku, większy rozmiar blizny, większe prawdopodobieństwo perforacji rogówki oraz większe ryzy-ko ryzy-konieczności wyryzy-konania leczniczego przeszczepu drążą-cego rogówki [20]. Dalsze badania w tym zakresie wydają się jednak konieczne.

METODY GENETYCZNE

Testy wykrywające genom grzybów, stosowane w dia-gnostyce grzybiczego zapalenia rogówki, mają dużą czułość, są mniej czasochłonne niż hodowle i idealnie nadają się do badania skąpej objętości próbek pobranych z powierzchni oka. Należy jednak pamiętać, że obecnie stanowią one me-todę stosowaną dodatkowo do wyżej opisanych testów dia-gnostycznych, a interpretacja wyników testów molekular-nych w mykologii jest niepewna.

Metoda PCR (ang. polymerase chain reaction) z wyko-rzystaniem elektroforezy w żelu agarozowym jest obecnie powszechnie stosowaną techniką molekularną i może być wykonywana przez coraz więcej klinicznych laboratoriów diagnostycznych. Wykorzystanie metody gniazdowej PCR (ang. nested PCR) może zwiększyć czułość przeprowadzo-nego testu [1]. Technika PCR z odczytem w czasie rzeczywi-stym (ang. real-time PCR) jest metodą molekularną wysoce

skuteczną w diagnozowaniu zapalenia grzybiczego rogów-ki [14]. Technika real-time PCR z analizą krzywych topnie-nia wysokiej rozdzielczości (ang. high resolution melting – PCR-HRM) umożliwia nie tylko wykrycie grzybów w próbce, lecz także odróżnienie drożdżaków od grzybów pleśniowych i jednocześnie odróżnienie różnych gatunków drożdżaków [11]. Zhao i wsp. wskazują na potencjalne za-stosowanie metody PCR bez etapu ekstrakcji DNA do bez-pośredniej amplifikacji grzybiczego DNA z próbek zeskro-bin rogówkowych [16].

Test hybrydyzacji z sondami molekularnymi (ang. dot hybridization assay – DHA) jest wysoce czułą i swoistą tech-niką, która może mieć zastosowanie w diagnostyce grzybi-czego zapalenia rogówki [10].

Obecnie dzięki ogromnemu rozwojowi wysokoprzepu-stowych platform i technologii sekwencjonowania nowej generacji (ang. next generation sequencing – NGS) prze-prowadzenie sekwencjonowania DNA może być zastosowa-ne w wielu dziedzinach medycyny, w tym w okulistyce [2]. Coraz częściej publikowane są prace o zastosowaniu badań metagenomowych do określenia składu mikroflory (w tym grzybów) obecnej w próbkach pobranych z oka [5, 21].

W niedawno opublikowanej pracy Tian i wsp. wskazy-wali na możliwość określenia genów (ang. differentially expressed genes – DEGs), które mogłyby być wykorzystane w przyszłości do diagnostyki różnicowej zapalenia rogówki o etiologii bakteryjnej lub grzybiczej, wymaga to jednak dal-szych badań [28].

MIKROSKOPIA KONFOKALNA

Zakażenia grzybicze są głęboko osadzone w zrębie ro-gówki, co prowadzi do niskiej wykrywalności w hodow-li z zeskrobin rogówkowych. Natomiast mikroskopia kon-fokalna in vivo (ang. in vivo reflectance confocal microsco-py – IVCM) umożliwia obrazowanie mikrostruktur rogów-ki w czasie rzeczywistym oraz uwidocznienie ewentualnych komórek grzybów, zapewniając tym samym szybką diagno-zę grzybiczego zapalenia rogówki [6, 15].

Dostępne są trzy typy mikroskopów konfokalnych: mikro-skop konfokalny in vivo z podwójnym skanowaniem (ang. tandem scanning in vivo confocal microscope – TS-IVCM), mikroskop konfokalny ze skanowaniem szczelinowym in vivo (ang. slit scanning in vivo confocal microscope – SS-IVCM) i skaningowa laserowa mikroskopia konfokalna in vivo (ang. laser scanning in vivo confocal microscope – LS-IVCM), któ-ra zapewnia rozdzielczość boczną o wielkości 1 μm. W licz-nych badaniach podkreślano przydatność zastosowania mi-kroskopii konfokalnej w celu wczesnego rozpoznania grzybi-czego zapalenia rogówki, która uwidacznia charakterystycz-ny dychotomiczcharakterystycz-ny wzór rozgałęziania strzępek grzybiczych lub pseudostrzępek wytwarzanych przez komórki drożdża-ków [7, 12, 15]. Metoda ta jednak nie pozwala różnicować

(4)

gatunków grzybów powodujących wrzód rogówki, umożli-wia natomiast odróżnienie grzybów pleśniowych od drożdża-ków. Oprócz diagnozy grzybiczego zapalenia rogówki, mikro-skopia konfokalna może być użyta jako obiektywne narzędzie do monitorowania skuteczności leczenia przeciwgrzybiczego [17]. W literaturze podaje się, że czułość mikroskopii konfo-kalnej w diagnostyce grzybiczego zapalenia rogówki wynosi 79,1–86,8%, a swoistość – 73,7–85,7% [7].

OPTYCZNA TOMOGRAFIA KOHERENTNA

PRZEDNIEGO ODCINKA GAŁKI OCZNEJ

Optyczna tomografia koherentna przedniego odcinka gałki ocznej (ang. anterior segment optical coherent tomo-graphy – AS-OCT) jest nieinwazyjnym badaniem dodatko-wym, pomagającym w ocenie głębokości nacieku zapalnego w obrębie poszczególnych warstw rogówki, komory przed-niej czy tęczówki oka. Służy również do monitorowania efektów leczenia stanu zapalnego. Ognisko zapalne widocz-ne jest w AS-OCT jako hiperrefleksyjna struktura w obrę-bie poszczególnych warstw rogówki, komory przedniej czy tęczówki. Badanie to jest wykorzystywane również po za-biegach cross-linking wykonywanych w infekcjach rogów-ki. Dzięki niemu można ocenić rozmiary nacieku zapalnego, który może być wykorzystany jako punkt odniesienia w sto-sunku do podjęcia decyzji dotyczącej zastosowania leczenia chirurgicznego (witrektomii, przeszczepu terapeutycznego, usunięcia soczewki własnej z torbą soczewki).

PODSUMOWANIE

Grzybicze zapalenie rogówki stanowi wyzwanie klinicz-ne, diagnostyczne i terapeutyczne. Opóźniony czas diagno-zy, a tym samym późniejsze włączenie odpowiedniego le-czenia, może skutkować gorszym rokowaniem. Odpowied-nia współpraca i doświadczenie lekarzy okulistów oraz mi-krobiologów są niezwykle istotne w leczeniu infekcji grzy-biczych, gdyż daje to lepsze wyniki terapeutyczne, zapew-nia ciągłość gałki ocznej oraz użyteczną ostrość wzroku pa-cjentom [19].

KONFLIKT INTERESÓW: nie zgłoszono.

PIŚMIENNICTWO

1. Ahmed A. Analysis of metagenomics next generation sequence data for fun-gal ITS barcoding: do you need advance bioinformatics experience? Front Mi-crobiol 2016;7:1061.

2. Bagyalakshmi R, Therese KL, Prasanna S, Madhavan HN. Newer emerging pathogens of ocular non-sporulating molds (NSM) identiﬁed by polymera-se chain reaction (PCR)-bapolymera-sed DNA polymera-sequencing technique targeting internal transcribed spacer (ITS) region. Curr Eye Res 2008;33(2):139–147.

3. Bharathi MJ, Ramakrishnan R, Meenakshi R, Mittal S, Shivakumar C, Srinivasan M. Microbiological diagnosis of infective keratitis: comparative evaluation of di-rect microscopy and culture results. Br J Ophthalmol 2006;90(10):1271–1276.

4. Bharathi MJ, Ramakrishnan R, Vasu S, Meenakshi R, Palaniappan R. Epidemio-logical characteristics and laboratory diagnosis of fungal keratitis. A three-year study. Indian J Ophthalmol 2003;51(4):315–321.

5. Borroni D, Romano V, Kaye SB et al. Metagenomics in ophthalmolo-gy: current ﬁndings and future prospectives. BMJ Open Ophthalmology 2019;4(1):e000248.

6. Chew SJ, Beuerman RW, Assouline M, Kaufman HE, Barron BA, Hill JM. Ear-ly diagnosis of infectious keratitis with in vivo real time confocal microscopy. CLAO J 1992;18(3):197–201.

7. Chidambaram JD, Prajna NV, Larke NL et al. Prospective study of the diagnostic accuracy of the in vivo laser scanning confocal microscope for severe microbial keratitis. Ophthalmology 2016;123(11):2285–2293.

8. Dave TV, Dave VP, Sharma S et al. Infectious endophthalmitis leading to evisce-ration: spectrum of bacterial and fungal pathogens and antibacterial suscep-tibility proﬁle. J Ophthalmic Inﬂamm Infect 2019;9(1):9.

9. Farrell S, McElnea E, Moran S, Knowles S, Murphy CC. Fungal keratitis in the Re-public of Ireland. Eye (Lond) 2017;31(10):1427–1434.

10. Gaudio PA, Gopinathan U, Sangwan V, Hughes TE. Polymerase chain reaction ba-sed detection of fungi in infected corneas. Br J Ophthalmol 2002;86(7):755–760. 11. Goldschmidt P, Degorge S, Benallaoua D et al. New strategy for rapid diagnosis and characterization of keratomycosis. Ophthalmology 2012;119(5):945–950. 12. He D, Hao J, Gao S et al. Etiological analysis of fungal keratitis and rapid identiﬁca-tion of predominant fungal pathogens. Mycopathologia 2016;181(1–2):75–82. 13. Iselin KC, Baenninger PB, Schmittinger-Zirm A, Thiel MA, Kaufmann C. Fungal

keratitis: a six-year review at a tertiary referral centre. Klin Monbl Augenheilkd 2017;234(4):419–425.

14. Itahashi M, Higaki S, Fukuda M, Shimomura Y. Detection and quantiﬁca-tion of pathogenic bacteria and fungi using real-time polymerase chain re-action by cycling probe in patients with corneal ulcer. Arch Ophthalmol 2010;128(5):535–540.

15. Kumar RL, Cruzat A, Hamrah P. Current state of in vivo confocal microscopy in management of microbial keratitis. Semin Ophthalmol 2010;25(5–6):166–170. 16. Kuo MT, Chang H, Cheng CK, Chien CC, Fang PC, Chang TC. A highly sensitive

method for molecular diagnosis of fungal keratitis: a dot hybridization assay. Ophthalmology 2012;119(12):2434–2442.

17. Mahmoudi S, Masoomi A, Ahmadikia K et al. Fungal keratitis: an overview of clinical and laboratory aspects. Mycoses 2018;61(12):916–930.

18. Nielsen SE, Nielsen E, Julian HO et al. Incidence and clinical characteristics of fungal keratitis in a Danish population from 2000 to 2013. Acta Ophthalmol 2015;93(1):54–58.

19. Nowik KE, Wylęgała A, Nowik K, Wylęgała E. A single-centre retrospective ob-servational study of fungal keratitis in Poland with a review of ﬁndings in Eu-rope. Ann Agric Environ Med 2019.

20. Ray KJ, Lalitha P, Prajna NV et al. The utility of repeat culture in fungal corne-al ulcer management: a secondary ancorne-alysis of the MUTT-I randomized cliniccorne-al trial. Am J Ophthalmol 2017;178:157–162.

21. Ren Z, Liu Q, Wang Y, Dong Y, Huang Y. Diagnostic information proﬁling and evaluation of causative fungi of fungal keratitis using high-throughput inter-nal transcribed spacer sequencing. Sci Rep 2020;10:1640.

22. Roth M, Daas L, Renner-Wilde A et al. The German keratomycosis registry: in-itial results of a multicentre survey. Ophthalmologe 2019;116(10):957–966. 23. Rymgayłło-Jankowska B. Grzybicze zapalenie rogówki. Ophthatherapy

2015;2(6):123–127.

24. Shah A, Sachdev A, Coggon D, Hossain P. Geographic variations in micro-bial keratitis: an analysis of the peer-reviewed literature. Br J Ophthalmol 2011;95(6):762–776.

25. Sharma S, Athmanathan S. Diagnostic Procedures in Infectious Keratitis. Dia-gnostic Procedures in Ophthalmology. Jaypee Brothers Medical Publishers, New Delhi, 2002, pp. 232–253.

26. Sharma S, Kunimoto DY, Gopinathan U, Athmanathan S, Garg P, Rao GN. Evalu-ation of corneal scraping smear examinEvalu-ation methods in the diagnosis of bacte-rial and fungal keratitis: a survey of eight years of laboratory experience. Cornea 2002;21(7):643–647.

27. Thomas PA, Kaliamurthy J. Mycotic keratitis: epidemiology, diagnosis and ma-nagement. Clin Microbiol Infect 2013;19(3):210–220.

28. Tian R, Zou H, Wang L, Liu L, Song M, Zhang H. Analysis of diﬀerential-ly expressed genes in bacterial and fungal keratitis. Indian J Ophthalmol 2020;68(1):39–46.

29. Tuft SJ, Tullo AB. Fungal keratitis in the United Kingdom 2003–2005. Eye (Lond) 2009;23(6):1308–1313.

30. Wong TY, Ng TP, Fong KS, Tan DT. Risk factors and clinical outcomes between fungal and bacterial keratitis: a comparative study. CLAO J 1997;23(4):275–281.