Metody SAR i QSAR w badaniu mechanizmu działania dioksyn

R O C Z N . P Z H , 1 9 9 8 , 4 9 , 4 3 3 - 4 4 5

JADWIGA PISKORSKA-PLISZCZYŃSKA

M E T O D Y SA R I Q S A R W B A D A N IU M E C H A N IZ M U D Z IA Ł A N IA D IO K SY N

SAR AND QSAR IN DIOXIN MECHANISM OF ACTION STUDY Zakład Farmakologii i Toksykologii Państwowego Instytutu Weterynaryjnego

24-100 Puławy, ul. Partyzantów 57 Kierownik: prof. dr hab. J. Żmudzki

W pracy omówiono przykłady zastosowania metod badania zależności między strukturą chemiczną a aktywnością biologiczną dioksyn i ich znaczenie w usta­ laniu mechanizmu działania halogenowych węglowodorów aromatycznych.

WSTĘP

Inform acje o potencjalnie niebezpiecznych dla zdrowia związkach chemicznych obecnych w środow isku naturalnym są bardzo ograniczone. Liczba nowych związków rośnie w tem pie wyższym niż zostają zakończone klasyczne badania toksyczności tych związków. R ów nocześnie dążenie do zm niejszenia liczby zwierząt w badaniach toksy­ kologicznych, rosnące koszty tych testów , niska w artość ekstrapolacyjna wyników badań na zw ierzętach - spowodowały poszukiw anie zwalidowanych m etod alternatyw nych przewidywania zagrożenia toksykologicznego związków chem icznych, a n a ich p o d sta ­ wie oceny n arażen ia populacji na ksenobiotyki [4, 7]. Jednym z przykładów testów alternatyw nych o podobnej w artości przewidywania toksyczności jak klasyczne badania z użyciem zw ierząt doświadczalnych stanow ią m etody b ad an ia zależności aktywności biologicznej związków chem icznych od ich struktury (SA R ) a w ich rozwój istotny wkład wniosły w połow ie lat sześćdziesiątych prace H anscha i wsp. [16, 17].

ZALEŻNOŚCI STRUKTURA CHEMICZNA - AKTYWNOŚĆ BIOLOGICZNA B adania zależności struktura-aktyw ność stanowiły przedm iot zainteresow ania b a d a ­ czy od czasu fu ndam entalnego odkrycia, że aktywność biologiczna związków chem i­ cznych je st uzależniona od ich struktury. T ego typu podejście do obserwowanych zjawisk biologicznych od początkow o prostych analogii jakościowych doprow adziło do opracow ania m eto d ilościowych. B adania relacji między stru k tu rą a aktywnością b io ­ logiczną pierw otnie opracow ano i zastosow ano przy projektow aniu substancji farm a­ kologicznych, herbicydów i pestycydów. Stosunkow o niedaw no m etodologia SA R z n a ­ lazła zastosow anie w badaniach korelacji między cecham i m olekularnym i związków chemicznych a ich działaniem toksycznym dla oszacow ania właściwości toksykologi­ cznych. Ew olucja z typowego projektow ania leków do oceny ryzyka toksykologicznego

postaw iła badaczy przed problem em adaptacji m etodologii zarów no w zakresie d e te r­ m inantów m olekularnych ja k i m atem atycznej oceny danych.

Zależności określane w spółcześnie m ianem SA R (ang. stru ctu re activity ralation- ship) pozw alają ustalić specyficzne cechy cząsteczki b adanego związku wpływające na jego aktywność biologiczną i wywodzą się z danych eksperym entalnych uzyskanych z b ad an ia grupy związków pokrew nych chem icznie. O cena istniejących w spółzależności zależy głównie od podobieństw budowy chem icznej pom iędzy związkam i badanym i a znanym związkiem odniesienia. M etody znane pod nazwą Q S A R (ang. quantitative stru ctu re activity relationship) polegają n a znalezieniu odpow iednich p aram etró w fizy- ko-chem icznych cząsteczki i ilościowym określeniu za ich pom ocą przewidywanej ak ­ tywności biologicznej [16]. A naliza Q S A R stosując najnow sze osiągnięcia m atem atyk jak wielowym iarowa analiza w ariancji oraz szybkie maszyny cyfrowe o dużej pojem ności pam ięci dostarcza inform acji o relacjach między tymi p aram etram i a odpow iedzią biologiczną. Bowiem reakcje biologiczne, ja k na przykład reakcja enzym atyczna czy oddziaływ anie liganda z recep to rem uzależnione są od struktury przestrzennej, w iązań niekowalencyjnych (elektrostatycznych, wodorowych, van der Waalsa) oraz od rów no­ wagi hydrofilowo-hydrofobowej k tóra wpływa na dotarcie toksyny do m iejsca działania [16]. H ansch i L eo stabelaryzowali wartości stałych fizykochemicznych podstaw ników , dla których dośw iadczalnie dow iedziono, że charakteryzują one zależności m iędzy stru k tu rą chem iczną i biologiczną aktywnością związków i są przydatne dla ilościowego opisywania zależności stru k tu ra - aktywność [17]. D o ważniejszych należą stała H am -

meta ( c ) charakteryzująca przepływ elektronów między pierścieniam i a podstaw nikam i,

param etry steryczne (elektronow e oddziaływ anie podstaw ników na reakcję, przyciąga­ nia m iędzycząsteczkow e) i stała n, w prow adzona przez H anscha i Fuj it ę a ch arak tery ­ zującą lipofilny ch arak ter cząsteczki. M odel H anscha jest jednym z wielu sposobów ilościowego b ad an ia zależności między stru k tu rą chem iczną związków a ich właściwoś­ ciami biologicznymi, zaś sukces tzw. podejścia Hanscha jest oczywisty, na co wskazują dziesiątki jego zastosow ań [2, 3, 8, 9, 10, 11, 12].

W zasadzie Q S A R je st m odelem , który uzależnia biologiczna aktywność serii p o ­ dobnych związków do jednej lub kilku właściwości cząsteczki. O pracow any dla serii związków pokrew nych chem icznie (np. kongenerów ), na postaw ie aktywności kilku przedstaw icieli grupy pozw ala przewidzieć aktywność pozostałych.

HALOGENOWE WĘGLOWODORY AROMATYCZNE

W ostatnich latach duże zainteresow anie świata naukow ego budzą halogenow e węglow odory arom atyczne (H A H , ang. halogenated arom atic hydrocarbons). O prócz polichlorow anych dibenzo-p-dioksyn (P C D D ) i dibenzofuranów (P C D F ) zalicza się do nich polichlorow ane bifenyle (PC B ), naftaleny (PC N ), trifenyle (PC T ), polibrom ow ane bifenyle (PBB) i inne. Związki te wywołują podobny zespół objawów toksycznych i uważa się, że posiadają identyczny m echanizm działania. B adania genetyczne na zw ierzętach oraz bad an ia zależności stru k tu ra - aktywność biologiczna wykazały, że większość (jeśli nie wszystkie) reakcje biologiczne wywołane przez te związki pow stają poprzez przyłączenie toksyn do cytoplazm atycznego białka zwanego recep to rem A h (A hR , ang. aryl hydrocarbon receptor) [29]. F unkcjonalnie re cep to r A h, jest białkiem wiążącym się z D N A po uprzednim związaniu liganda i translokacji do ją d ra k o m ó rk o ­

wego. W wyniku przyłączeniu do D N A aktywnego kom pleksu ligand-receptor, n a stęp u ­ je transkrypcja odpow iednich genów [25, 27, 44, 48]. W raz z indukcją cytochrom u P-450 n astępuje skoordynow ana indukcja conajm niej 20 m onooksygenaz w tym hydroksylazy arylowej (А Н Н ) oraz O -deetylazy rezorufiny (E R O D ). Pom iary aktywności tych e n ­ zymów m ikrosom alnych są najczęściej stosow aną biochem iczną m etodą oceny działania dioksyn [15, 18, 24, 25, 27, 29, 45].

SAR W BADANIU RECEPTORA DIOKSYN

B adania SA R stanow ią również w ażną m etodę b ad an ia chem icznego recep to ra biologicznego. To nowe podejście badaw cze dostarcza inform acji o praw dopodobnej budow ie m iejsca w iązania na receptorze, określa siły fizykochem iczne uczestniczące w interakcji recep to ra z Ugandami i pozwala ocenić ro lę recep to ra w badanym p ro ce­ sie. Stereoselektyw na interakcja między receptorem a jego agonistam i stanowi silny dowód potw ierdzając udział danego receptora w badanych procesach biologicznych [14].

Z astosow anie do b ad a ń znakow anego trytem radioliganda (2,3,7,8-tetrachlo- rodibenzo-p-dioksyny) doprow adziło do odkrycia w 1976 roli receptora A h zaś badania SA R i Q S A R potw ierdziły jego rolę w m echanizm ie działania dioksyn i związków pokrew nych [14, 29, 44]. C elem szczegółowych badań izom erów i kongenerów dioksyn, dibenzofuranów i PCB było określenie wpływu struktury chem icznej tych związków na interakcje z recep to rem i uzyskiwane efekty biologiczne i toksyczne [1, 13, 20, 21, 22, 34, 35, 37, 38, 39, 40, 46]. W badaniach tych pow inowactwo do A h R określano poprzez kom petycyjne w ypieranie [l,6 -3H]-2,3,7,8-TCD D z kom pleksu z receptorem i o kreśla­ no ECso dla każdego b adanego kongeneru, tj. stężenie redukujące w iązanie swoiste [3H ]-T C D D do 50% . P otencjał indukcyjny testow anych związków badano w hepatocy- tach linii kom órkow ej H 4 IIE dokonując pom iaru aktywności enzymów m ikrosom alnych (А Н Н i E R O D ) i określano E D 50, tj. stężenie in duktora p otrzebne do wywołania 50% odpow iedzi maksym alnej. R ów nolegle b adano toksyczność dioksyn in vivo dla szczurów poprzez p o m iar spadku masy ciała i inwolucję grasicy, dw óch najczęściej występujących syndrom ów działania toksycznego dioksyn u zwierząt m odelow ych [20, 21, 22]. Szukano zależności pom iędzy powinowactwem badanych izom erów i kongenerów do recep to ra A h w ątroby szczura in vitro, a ich aktywnością in vitro oraz toksycznością in vivo. P o n ad to b a d an o wpływ podstaw ników w cząsteczce P C D D na aktywność tych związków

in vivo. P o n ad to b ad an o wpływ podstaw ników w cząsteczce P C D D na aktywność tych

związków in vivo i in vitro oraz potencjalne różnice m iędzygatunkow e cytozolowego A h R w ątroby izolow anego od kilku gatunków zw ierząt laboratoryjnych [13, 34, 35].

Poniżej zostaną om ów ienie na podstaw ie piśm iennictw a n iek tó re przykłady badania zależności stru k tu ra - aktywność (SA R ) wybranych P C D D , P C D F i grupy pochodnych T riC D D , dzięki którym potw ierdzono rolę A h R w m echanizm ie działania dioksyn, a k tóre przeprow adzono dla tej grupy przemysłowych i środowiskowych toksyn [20, 21, 22, 23, 32, 33, 38, 39, 40].

WPŁYW STRUKTURY CHEMICZNEJ DIOKSYN NA AKTYWNOŚĆ BIOLOGICZNĄ N a podstaw ie licznych b ad ań nad charakterystyką w iązania dioksyn i związków pokrew nych do recep to ra A h m ożna stwierdzić, że n ie k tó re cechy budowy takie jak

system pierścieni aromatycznych, obecność podstaw ników i ich sposób rozm ieszczenia w cząsteczce są istotne dla w iązania do receptora.

T a b e l a I . Wpływ struktury PCDD na powinowactwo do receptora Ah i indukcję enzymów

mikrosomalnych in vitro [21]

The effect of structure on the in vitro rat hepatic cytosolic receptor binding and AHH/EROD induction potencies [21]

PCDD. W tab. I przestaw iono przykładowe wyniki b ad ań izom erów i kongenerów P C D D przeprow adzone przez Masona i wsp. [21], a uzyskane przez nich d an e w yraźnie w skazują na istnienie zależności pom iędzy stru k tu rą chem iczną badanych związków a pow inow actw em do receptora Ah.

Najaktywniejszy związek (2,3,7,8-TCDD) posiada atom y chloru we wszystkich 4 p o ­ zycjach bocznych, zaś zmniejszenie liczby atom ów chloru w tych pozycjach pow oduje obniżenie powinowactwa pozostałych tetrachlorodibenzo-p-dioksyn do re ce p to ra (2,3,6,7- , 1,3,7,8- i 1,2,3,4-TCDD). Niewielka różnica w strukturze pom iędzy 1,3,7,8- i 2,3,6,7-TC D D (tj. w pozycji 1,3 oraz 1,2 lub 6,7) pow oduje aż pięciokrotnie niższe pow inow actw o do receptora. D odatkow e atom y chloru wyraźnie obniżają w iązanie się związku (1,2,3,7,8-penta, 1,2,3,4,7,8-heksa i oktachloro-dibenzo-p-dioksyna) do A hR .

S tru k tu ra badanych PC D D wyraźnie decyduje również o ich działaniu indukcyjnym p o dobnie jak o wiązaniu do receptora. Z m iana podstaw ników w 1,3,7,8- i 2,3,6,7- tetrachlorodibenzo-p-dioksynach znacząco zmniejszyła ich siłę indukcyjną. D odatkow e atom y chloru (penta-, heksa- i oktachlorodibenzo-p-dioksyna) rów nież zm niejszały aktyw ność indukcyjną w stosunku do 2,3,7,8-TCDD. Porów nując się w iązania rec ep to ra

in vitro z toksycznością in vivo tych samych izom erów i kongenerów P C D D m ożna

stwierdzić, że te sam e cecha budowy decydują o ich toksyczności [21].

S topień powinowactwa do receptora badanych izom erów i kongenerów P C D D potw ierdza znaczenie struktury chemicznej dioksyn zaś wysoka stereoselektyw ność obserw ow anych interakcji receptora A h stanowi dowód przem aw iający za jego udziałem

Metody SAR i QSAR w badaniu dioksyn 437 w m echanizm ie działania dioksyn [14, 27, 44]. Poland i wsp. w swoich pionierskich pracach pierwsi opisywali p o d o b n e korelacje pom iędzy w iązaniem recep to ra in vitro

a siłą indukcyjną in vivo i toksycznością ostrą (D L50) dla serii kongenerów P C D D [29].

P odczas gdy wiązanie re c ep to ra in vitro wyraźnie koreluje z indukcją enzymów i toksycznością in vivo stw ierdzono brak korelacji liniowej pom iędzy dw om a testam i in

vitro (tj. w iązaniem do receptora a indukcją enzymów) [20, 21, 22]. R ów nież Bandiera

i D enom m e obserwowali słabą korelację pom iędzy obydwom a testam i in vitro [1, 13]. Stosując m eto d ę Q SA R dla innej serii dioksyn wykazali oni, że pow inowactwo do re cep to ra zależy głównie od lipofilności podstawników, a indukcyjność p o n a d to od rozm iaru podstaw nika. Ich zdaniem zmiany konform acyjne pow stającego kom pleksu A h R - ligand są przyczyną tych różnic a wskazywałoby na to pojaw ienie się p a ra m etru

Д В5 w m atem atycznym rów naniu Q S A R opisującym ilościowo wpływ struktury na

indukcję enzym atyczną danej serii pochodnych 2,3,-dichlorodibenzo-p-dioksyn [1, 13]. PC D F. P odobnie jak dla dioksyn, dzięki badaniom SA R i Q SA R , wykazano zn a ­ czenie struktury chemicznej polichlorowanych dibenzofuranów w wywoływaniu a k ­ tywności biologicznej. Stosując takie sam e m etody badaw cze wykazano, że rów nież pozycji boczne (2,3,7,8) posiadają istotne znaczenie w wywoływaniu efektów biolo­ gicznych [20]. Powinowactwo ja k i indukcja enzymów zależą od liczby atom ów chloru: obniżanie atom ów chloru pow oduje zarów no obniżenie siły indukcyjnej jak i pow ino­ wactwa do recep to ra. Najaktywniejszymi ligandam i okazały się tetra-, pen ta- i heksa- chlorodibezofurany zawierające chlor w pozycjach 2,3,7,8. Zw iększanie atom ów chloru w pozostałych pozycjach obniża aktywność PC D F. Najsilniej z recep to rem A h wiąże się 2,3,7,8-TCD F, w którym atom y chloru zajm ują również cztery pozycje boczne cząsteczki. O becność dodatkow ego atom u chloru w pozycji 1 lub 4 skutkuje zwiększe­ niem aktywności w porów naniu do związków zawierających tylko 3 atom y w pozycjach bocznych oraz 2 w pozostałych tj. 1,2,3,7,8- 2,3,4,7,8-PCD F były bardziej aktywne niż 1,3,4,7,8-; 2,3,4,7,9-; 1,2,37,9- i 1,2,4,6,8-pentachlorodibenzofurany. Dwie pary b a d a ­ nych izom erów (1,3,4,7,8- i 1,2,4,7,8- oraz 2,3,4,7- i 2,3,4,8-), k tó re różniły się p o d sta ­ w nikam i tylko w pozycjach C-2 (lub C-8) oraz C-3 (lub C-7) znacząco różniły się między sobą potencjałem indukcyjnym.

D ibenzofurany podobnie jak dioksyny pow odują syndrom głodzenia, zanikanie g ra­ sicy, im m unotoksyczność, zmiany rozwojowe płodów. Z ależna od struktury chem icznej jest ich toksyczność in vivo tj. spadek masy ciała i atrofia grasicy u samców szczur, k tóre p o trak to w an o tymi związkami [27]. N ajbardziej toksyczny związek tej grupy in

vivo (2,3,7,8- T C D F ) był również najsilniejszym induktorem enzymów m ikrosom alnych in vivo i wykazywał również najwyższe powinowactwo do recep to ra in vitro [20, 21, 22].

Pom im o bardzo podobnej budowy chem icznej dioksyn i dibenzofuranów wpływ pozycji chloru na aktywność biologiczną P C D F jest nieco odm ienny a spow odow any jest asym etryczną budową cząsteczki (jedna oś symetrii przez atom tlenu w pierścieniu dibenzofuranu). N a podstawie analizy ich budowy a aktywności in vivo i in vitro ustalono, że poszczególne pozycje w pierścieniu dibenzofuranu w różnym stopniu wpły­ wają na aktywność biologiczną P C D F, tj. C-3 (lub C07) > C-2 (lub C-8) je st > C-4 (lub C-6) > C -l (lub C-9) (ryc. 1.), podczas gdy w cząsteczce dioksyn wszystkie pozycje są rów now ażne [44].

i

i

i

Ryc. 1. Wpływ atomów chloru w różnych pozycjach cząsteczki kongenerów PCDD i PCDF na powinowactwo do receptora Ah [37].

The different effects of chlorine substituents at different position in the dibenzo-p-dioxin and dibenzofuran rings on relative receptor binding affinities od PCDD and PCDF congeners [37].

7x-2,3,8TriCDD.

ocenie ilościowej poprzez pom iar korelacji między efektem biologicznym (np. pow ino­ wactwo rec ep to ra) a znanym i fizykochemicznymi cecham i podstaw ników takim i jak lipofilność (л), elektoujem ność (o ), pojem ność w iązań wodorow ych (H B ) i p aram etry steryczne (ABs, AVw) [15, 16, 19, 30]. Z astosow anie do b ad ań Q S A R m. in. serii pochodnych 7x-2,3,8-trichlorodibenzo-p-dioksyny (7x-2,3,8-TriCD D ) pozwoliło n a u sta ­ lenie relacji pom iędzy stru k tu rą chem iczną, powinowactwem do re cep to ra i biologiczną siłą działania tych związków oraz określenia, k tó re p aram etry fizykochem iczne p o d sta ­ wników są istotne dla powinowactw a dioksyn do A hR , a w rezultacie wpływają na biologiczną siłę działania tych związków [14, 44]. Bowiem nie tylko obecność atom ów

Metody SAR i QSAR w badaniu dioksyn 439 chloru i ich sposób rozm ieszczenia w cząsteczce ale rów nież inne podstaw niki są istotnym i strukturalnym i d etem inantam i dla interakcji R -L [13, 22, 23, 26, 38]. W k o ­

lejnych dośw iadczeniach b ad an e pochodne zawierały w pozycji C-7 je d en

z następujących podstaw ników : - O H , -N C h - F , - C H 3, - O C H 3, - C F 3, -B r , - I , -C L , -C N , - H . N p. zastąpienie atom u chloru w odorem w pozycji C-7 2,3,7-trichlorodibenzo- p-dioksyny (pow staje 2,3-dichlorodibenzo-p-dioksyna) pow oduje redukcję jej pow ino­ wactwa do A h R kilkaset razy a ta różnica wynika z odm iennych właściwości fizykoche­ micznych obu kongenerów [14].

W wyniku przeprow adzonej analizy wielowymiarowej regresji liniowej dla 11 p o ­ chodnych 7x-2,3,8-TriCD D [32, 38] na podstaw ie wiązania do re c ep to ra A h w ątroby szczura, myszy, chom ika i świnki m orskiej otrzym ano następujące rów nania m a tem a­ tyczne, k tó re ilościowo charakteryzują proces wiązania ligandów do re c ep to ra A h izolow anego od czterech gatunków zwierząt [32]:

gdzie л określa lipofilność podstaw ników , AES efekt steryczny, o ° - elektoujem ność, H B - pojem ność wiązań wodorowych, AVw - pojem ność van der Waalsa.

Zależności występujące pom iędzy wiązaniem do cytozolowego recep to ra w ątroby szczura a indukcją enzymu А Н Н w hodowli H 4 IIE wywołaną badanym i pochodnym i opisuje kolejne rów nanie Q S A R w publikacji R om kes i wsp.:

p E D 50 = 3,208 + 0,950 p E C 5o (recep to ra szczura) - 0,955 ДВ5,

gdzie ДВ5 jest p aram etrem sterycznym [32]. Z tego rów nania, opisującego ilościowo

zależności m iędzy stru k tu rą 1 1 badanych pochodnych, a pow inow actw em do recep to ra

dioksyn oraz odpow iedzią biologiczną wynika, że indukcja А Н Н uzleżniona jest od pow inowactwa związku do A h R cytozolu w ątroby szczura oraz od p a ram etru sferyczne­ go (rozm iaru podstaw nika). Sugeruje to również, że w dalszych etap ach m echanizm u działania dioksyn podstaw niki m ogą odgrywać w ażną rolę (np. w aktywacji recep to ra) przed o stateczną ekspresją genu CYP1A1 [31].

W pracach R om kes i wsp. [33, 34] dla scharakteryzow ania ilościowego zależności stru k tu ra - pow inowactwo (Q S A R ) określono znaczenie w iązań elektronow ych, w odo­

rowych oraz ch arak teru hydrofobow ego w stosunku do E C50 tj. wielkości obliczonej na

podstaw ie kom petycyjnego w iązania grupy pochodnych T riC D D . U zyskane rów nania korelacyjne (A -D ) pokazują, że zarów no zwiększone przyjm ow anie elektronów przez podstaw niki (o ma w artość d o d atn ią) jak również ch arak ter hydrofobowy, podwyższają właściwości wiążące liganda do recep to ra. Także podstaw niki akceptujące wiązania w odorow e sprzyjają powinowactwu do recep to ra Ah. A nalizując wszystkie cztery wzory m atem atyczne m ożna stwierdzić, że dla tej sam ej grupy związków chem icznych (p o ­ chodnych 2,3,8-T riC D D ) różne p aram etry rządzą przyłączeniem ligandów czyli recep ­ tory pochodzące z od różnych zwierząt (szczur, mysz, świnka m orska, chom ik) wykazują różne właściwości. R ów nania Q S A R (A -D ) interakcji pochodnych T riC D D z re c e p to ­ rem A h dla czterech gatunków zwierząt m odelowych potw ierdzają h etero g en n ą n a tu rę

recep to ra [26, 28, 32] a najistotniejsze czynniki dla efektywnej interakcji w m iejscu w iązania, to siły hydrofobow e, elektronow e i wiązania w odorow e. P ostuluje się, że m iejsce wiązania [3H ]T C D D stanowi niewielką hydrofobow ą kieszeń zaw ierającą je d n ą lub więcej grup polaryzacyjnych [1, 44]. Skoro więc wiązanie do re c e p to ra A h i w ynikająca stąd indukcja m onooksygenaz m oże być podwyższona lub obniżona przez różne podstaw niki cząsteczkowe, różnice w aktywności tej klasy związków m uszą zale­ żeć od właściwości podstawników.

Z licznych bad ań nad toksycznością dioksyn i związków pokrew nych wynika, że wrażliwość zwierząt na toksyczne działanie H A H jest m ocno zróżnicow ana. D aw ka toksyczna (DLso) wynosi od 1-5000 /tg/kg (odpow iednio świnka m orska i chom ik). Co leży u podstaw tak dużych różnic - tru d n o określić. Chociaż istnieją znaczne różnice m iędzygatunkow e w toksyczności, poziom recep to ra w w ątrobie szczura, myszy, świnki m orskiej i chom ika jest podobny (40-80 fmoli/m g białka cytozolu). W obec tego ilość recep to ra nie m oże decydować o wrażliwości tych zwierząt na działanie dioksyn a stopień wrażliwości m oże wynikać z bliżej nieokreślonych cech i właściwości re cep ­ tora.

R óżnice w ystępujące we w zorach m atem atycznych opisujących istniejące zależności (A -D ) wyraźnie wskazują, że przyłączanie tej sam ej grupy związków (ligandów ) do re cep to ra zależy od źródła jego pochodzenia (szczur, mysz, świnka m orska, chom ik). W obrębie jed n eg o gatunku (np. szczur) lipofilność była głównym czynnikiem reg u ­ lującym w iązanie do receptora. Jed n ak tej zależności między lipofilnym ch ara k terem podstaw ników a powinowactwem do recep to ra A h nie m ożna uogólniać na inne gatunki zwierząt. Bowiem badania porów naw cze przeprow adzone dla pozostałych gatunków zwierząt wykazały, że dom inujący fizykochemiczny czynnik decydujący o w ią­ zaniu Uganda do rece p to ra je st różny dla poszczególnych gatunków zwierząt. Pow ino­ wactwo do recep to ra świnki morskiej zależy tylko od lipofilności, do re cep to ra myszy od lipofilności i ch arak teru elektroujem nego podstaw ników a dla re c ep to ra chom ika obok lipofilności i elektroujem ności dodatkow e znaczenie m ają efekty steryczne (AV„). M ożna więc sądzić, że u podstaw różnej wrażliwości zwierząt n a dioksyny n ajpraw do­ podobniej leży h etero g en n a n a tu ra ich receptora, na co wskazują przedstaw ione wynik b ad an ia Q SA R .

Bazując rów nież na dostępnych danych m ożna stwierdzić, że toksyczność in vivo koreluje silnie z w iązaniem liganda [20, 22]. T ak jak odpow iedź na toksyczne działanie występuje w różnym nasileniu u poszczególnych gatunków zwierząt tak i różne pow i­ nowactwo kongenerów H A H do recep to ra uzależnione jest od gatunku zw ierzęcia [32].

R elacje między stru k tu rą chem iczną rodziny H A H , a właściwościami indukcyjnym i są wyraźne. Toksyczne efekty takie jak atrofia grasicy, spadek masy ciała, im m unotok- syczność, śm iertelność o stra a także indukcja CYP1A1 koreluje z względnym pow ino­ wactwem H A H do recep to ra A h [27, 28]. D latego ważnym krokiem w przewidywaniu efektów wywoływanych przez te związki było określenie ich pow inow actw a do re cep to ra A h i wszystkie te bad an ia potw ierdzają, że wiązanie liganda do rece p to ra je st z asad n i­ czym elem entem w m echanizm ie działania dioksyn. O bserw uje się n ato m iast brak korelacji liniowej dla obydwu testów in vitro (powinowactwo do A h R i indukcja enzymów). R óżna więc siła odpow iedzi biologicznej na działanie dioksyn i związków pokrew nych m ierzona aktywnością enzymów А Н Н i E R O D wskazuje, że nie sam o

Metody SAR i QSAR w badaniu dioksyn 441 przyłączenie liganda do recep to ra ale jego stru k tu ra chem iczna decyduje, że utw orzony kom pleks R -L jest mniej lub bardziej aktywnym biologicznie [32, 37]. A utorzy powyż­ szych b ad ań konkludują, że po związaniu liganda przez recep to r w ostatecznej ekspresji genów znaczące m ogą być procesy aktywacyjne kom pleksu, k tó re opisywano dla re c e p ­ tora A h [26, 27, 28, 44].

ZNACZENIE PRAKTYCZNE BADAŃ SAR

A naliza Q S A R okazała się użyteczną w opisywaniu fizykochemicznych d e te rm i­ nantów rządzących działaniem dioksyn. M etoda m oże być pom ocną w przewidywaniu powinowactwa i potencjału indukcyjnego innych związków chemicznych, podobnie jak okazała się użyteczną dla bad an ia PCB [1, 14, 44, 48]. N ie jest bowiem tru d n o sobie wyobrazić, że fizykochem iczne oddziaływania, k tóre pełnią zasadniczą rolę w m odelu

Hanscha (tj. efekty hydrofobow e, elektronow e i przestrzenne), są tymi samymi d e te r­

m inantam i, k tó re decydują o działaniu m utagenów czy kancerogenów na D N A , i k tóre determ inują procesy m etabolicznego transform ow ania początkow o nieaktywnych na poziom ie kom órki związków chem icznych do związków agresywnych.

Wyniki b ad ań właściwości toksycznych halogenowych w ęglow odorów arom atycznych z zastosow aniem m etod badania zależności SA R i Q S A R znalazły praktyczny aspekt aplikacyjny. O pracow ane na ich podstaw ie współczynniki toksyczności stosuje się do wyrażenia toksyczności względnej m ieszanin P C D D /PC D F/P C B . O bserw acje wyni­ kające z b ad ań SA R i Q SA R stanow ią m echanistyczną bazę dla pow stania i rozwoju koncepcji T E F (ang. toxicity equivalent factor) dla indywidualnych związków tej grupy. Toksyczność m ieszanin P C D D i P C D F określa się za pom ocą T E F w stosunku do najbardziej toksycznego związku tj. 2,3,7,8-TCDD [40, 41, 42].

T ę w zględną toksyczność chlorow anych kongenerów dioksyn obliczono na podstaw ie efektów biologicznych uzyskanych w badaniach na zwierzętach (D L 50, kancerogenność, wpływ na reprodukcję) oraz na wynikach testów in vitro jak powinowactwo do recep ­ tora, indukcja enzymów m ikrosom alnych i im m unotoksyczność.

Jednym z głównych zastosow ań współczynników T E F je st przekształcanie danych analitycznych uzyskanych w wyniku analizy chem icznej badanej próbki do tzw. rów no­ ważników toksyczności T C D D (ang. T C D D T E Q ). Pozwala to na oszacow anie całko­ witej toksyczności m ieszaniny kongenerów występujących w badanej próbce. T E Q stanowi sum ę iloczynów stężenia poszczególnych kongenerów i współczynników T E F tych kongenerów . O becnie istnieje tylko jedna m etodologia oceny ryzyka narażenia na działanie m ieszaniny halogenow ych w ęglowodorów arom atycznych. Addytywność zasto­ sow ana w tej koncepcji została potw ierdzona w ielom a badaniam i zależności SA R i Q SA R in vivo oraz in vitro [14, 39, 43].

PODSUMOWANIE

D ział toksykologii określany ja k o „Q SA R w toksykologii” ogrom nie rozw inął się w czasie ostatnich kilkunastu lat o czym świadczy ciągle w zrastająca liczba publikacji i konferencji naukowych oraz specjalistyczne czasopism o naukow e „SA R and Q S A R in E nvironm ental R esearch ”. B adania Q SA R znalazły zastosow anie w określaniu k o ­ relacji bioaktywności wszystkich rodzajów związków organicznych ze wszystkimi ro d za­ jam i efektów biologicznych.

Hansch w przedstaw ionej w połowie lat 90-tych publikacji o ekspansji m eto d Q S A R

w toksykologii ocenia, że pom im o opublikow ania dotąd około 20 tys. wyników zasto­ sowań w chem ii i p o n ad 6 tys. wyników badań korelacji biologicznych, m eto d a ta wciąż jest we wczesnym etapie rozwoju i będzie podlegała dalszej ewolucji. Jed n ak że uzys­ kane d o tąd ko n k retn e wyniki badania zależności między stru k tu rą chem iczną, a biolo­ giczną aktywnością związków chemicznych będą trwałe, a ich w artość będzie rosła wraz ze w zrostem bazy danych dla m etod alternatyw nych [17].

Należy oczekiwać, że strategia rozwoju alternatyw nych m eto d oznaczania to k ­ syczności będzie wielokierunkow a; opracow ane zostaną m etody kom puterow ego m o ­ delow ania procesu toksycznego przy wykorzystaniu ilościowych zależności m iędzy stru k ­ turą, a aktywnością związków chemicznych (Q S A R ), przy jednoczesnej symulacji p ro ­ cesów fizjologicznych organizm u ludzkiego.

Id ea opracow ania skom puteryzow anego m odelu określania toksyczności bazującego na danych z piśm iennictw a oraz poprzedzanie eksperym entów sym ulacjam i k o m p u te ­ rowymi do niedaw na wydawała się niemożliwa. O becne techniki inform acyjne pozys­ kiw ania i m agazynow ania baz danych znacznie obniżają koszty takich działań. Szybki i tani dostęp do baz danych zapew nia system inform acji w istniejących właściwości fizycznych związków to ustalenie właściwości toksycznych jest możliwe poprzez p ro ste obliczenia m atem atyczne bazujące na strukturach związków pokrew nych. P oprzez u- stalone w ten sposób param etry, w połączeniu z innymi deskryptoram i m ożna o d ­ różniać związki kancerogenne od niekancerogennych. N aw et m ając do czynienia ze związkami różniącym i się budow ą chem iczną istnieje możliwość opracow ania efekty­ wnego bad an ia SA R bazującego na fizykochemicznych deskryptorach [2]. Symulacja poprzez m odel SA R znacznie zredukuje ilość zwierząt eksperym entalnych, zwiększy inform acje otrzym ywane z doświadczeń toksykologicznych. T akie podejście zwiększy rów nież zaufanie do teoretycznych przewidywań i zintegruje toksykologów ze światem m echanistycznym nowoczesnej biologii, która rozwija się z biologii m olekularnej.

Oczywiście stosow anie m etod Q SA R w toksykologii nie je st tak pow szechne jak w chem ii leków; najczęściej stosuje się je w ekotoksykologii. D obrym przykładem są podejm ow ane wysiłki am erykańskiej Agencji O chrony Środow iska (U S Е Р А ) w celu ustalenia Q S A R jako jed n eg o z podstawowych narzędzi w polityce regulacji prawnych i w podejm ow aniu decyzji adm inistracyjnych. E P A grom adzi zarów no dan e z piśm ien­ nictwa ja k i wyniki własnych badań Q S A R dla różnych klas związków chem icznych i dla różnych organizm ów . D la nowych związków chemicznych, przed ich dopuszcze­ niem do stosow ania, wymaga się wyników badań ekotoksykologicznych z użyciem odpow iedniego m odelu Q S A R [47, 49].

O prócz znaczenia praktycznego, m etody Q S A R są przedm iotem zainteresow ania świata naukow ego również dlatego, że rep rezen tu ją jed en z niewielu obszarów , w których zjawiska biologiczne podlegają systematycznej ocenie ilościowej.

Metody SAR i QSAR w badaniu dioksyn 443 J . P i s k o r s k a - P l i s z c z y ń s k a

SAR AND QSAR IN DIOXIN MECHANISM OF ACTION STUDY Summary

Thousand chemicals are present within our environment, and for many of them, there is a little reliable information detailing their relative hazard. Added to that increasing concern over the use of animals in toxicity testing, high costs of these tests has made the search for and validation of alternative methods to predict the hazard and the relative risk of xenobiotics. QSAR (quantitative structure activity relationship) attempt to relate statistically the biological activity of compound with its physicochemical and structural properties. QSAR methods are often seen as the first step for valid toxicological prediction.

Halogenated aromatic hydrocarbons typified by polychlorinated dibenzo-p-dioxins (PCDD), dibenzofurans (PCDF) and biphenyls (PCBs) have been identified as residues in almost every component of the ecosystem. Some chemicals in this class cause adverse biological effects after binding to an intracellular cytosolic protein called the Ah receptor (AhR). Because of importance of the Ah receptor in determining toxicity, there have been a number of attempts to model the relationship between receptor binding and structure of xenobiotics. QSAR have found wide use in correlating the bioactivity of dioxins and related compounds with many kinds of bilogical entities. This paper will briefly summarise some SAR and QSAR study for halogenated aromatics as ligand for Ah receptor and the characteristic biological and toxic responses elicit by this class of chemicals. These study strongly support the role of AhR in dioxin toxicity.

PIŚMIENNICTWO

1. Bandiera S., Sawyer Т., Campbell M.A., Fujita Т., Safe S.: Competitive binding to the cytosolic 2,3,7,8-TCDD receptor: effects of structure on the affinities of substituted halogenated biphenyls-a QSAR approach. Biochem. Pharmacol. 1983, 32, 3801.

2. Benigni R., Underlie C., Giuliani R.: Structure - activity studies of chemical carcinogenesis: use of an electrophilic reactivity parameter in a new QSAR model. Carcinogenesis 1989, 10, 55.

3. Benigni R., Giuliani A.: Quantitative structure - activity relationship (QSAR) studies of mutagens and carcinogens. Med. Res. Rev. 1996, 16, 267.

4. Benson R.: Structure - activity relationships in the threshold assessment. Drug Met. Rev. 1987, 18, 331.

5. Bigelow S.A., Nebert D.W.: The Ah regulatory gene products. Survey of nineteen polycyclic aromatic hydrocarbons and fifteen benz[a]pyrene metabolites capacity to bind the cytosolic receptor. Toxicol. Lett. 1982, 10, 109.

6. Bondi A.: Van der Waals volumes and radii. J. Phys. Chem. 1964, 12, 441. 7. Chu /.: Alternative methods to animal testing. ATLA. 1995, 23, 257.

8. Clements R.G., Nabholtz J.V., Zeeman M.G., Auer C.M.: The application of structure - activity relationships (SARs) in the aquatic toxicity evaluation of discrete organic chemicals. Sar and QSAR in Environm. Res. 1995, 3, 203.

9. Cronin M.T.D., Dearden J.C.: QSAR in toxicology. 1. Prediction of aquatic toxicity. Quant. Struct. - Act. Relat. 1995, 14, 1.

10. Cronin M.T.D., Dearden J.C.: QSAR in toxicology. 2. Prediction of acute mammalian toxicity and interspecies correlations. Quant. Struct. - Act. Relat. 1995, 14, 117.

U. Cronin M.T.D., Dearden J.C.: QSAR in toxicology. 3. Prediction of chronic toxicities. Quant. Struct. - Act. Ralat. 1995,14, 329.

12. Cronin M.T.D. and Dearden J.C.: QSAR in toxicology. 4. Prediction of non-lethal mammalian toxicological endpoints and expert systems for toxicity prediction. Quant. Struct. - Act. Relat. 1995, 14, 518.

13. Denomme M A., Homonko K , Fujita Т., Sawyer Т., Safe S.: The effects of substituents on the cytosolic receptor binding affinities and АНН induction potencies of 7-substituted-2,3- dichlorodibenzo-p-dioxin. QSAR analysis. Mol. Pharmacol. 1985, 27, 656.

14. Goldstein JA ., Safe S.\ Mechanism od action and structure - activity relationships for the chlorinated dibenzo-p-dioxins and related compounds. Halogenated biphenyls, terphenyls, naphthalenes, dibenzodioxin and related products, wyd. Kimbrough and Jensen. Elsevier Sci. Publ. 1989, 239.

15. Hansch C.: A quantitative approach to biochemical structure - activity relationships. Acc. Chem. Res. 1969, 2, 232.

16. Hansch C., Leo A.: Substituent constants for correlation analysis in chemistry and biology. A Willey Interscience Publication, wyd. John Willey & Sons, Toronto, 1969.

17. Hansch C., Hoekman D., Leo A., Zhang L., Li P:. The expanding role of quantitative structure - activity relationships (QSAR) in toxicology. Toxicol. Lett. 1995, 79, 45.

18. Jones P.C., Galeazzi D.R., Fisher J.M., Whitlock J.P.: Control of cytochrome Pl-450 gene expression by dioxin. Science 1985, 227, 1499.

19. Kutter E., Hansch C.: Steric parameters in drug design: monoamine oxidase inhibitors and antihistamines. J. Med. Chem. 1969, 12, 647.

20. Mason G., Sawyer Т., Keys B., Bandiera S., Romkes М., Piskorska-Pliszczyńska J., Żmudzka

В., Safe S. : Polychlorinated dibenzofurans (PCDFs): correlation between in vivo and in vitro

structure - activity relationships. Toxicol. 1985, 37, 1.

21. Mason G., Farrell K , Keys B., f4skorska-Pliszczyńska J., Safe L., Safe S.: Polychlorinated dibenzo-p-dioxins: quantitative in vitro and in vivo structure - activity relationships. Toxico­ logy 1986, 41, 21.

22. Mason G., Farrell K , Keys B., Piskorska-Pliszczyńska J., Safe L., Safe S.: Polychlorinated dibenzo-dioxins: quantitative in vitro and in vivo structure - activity relationships. Toxicology 1986, 41, 21.

23. Mekenyan O., Veith G., Call D.J., Ankley G.T:. A QSAR evaluation of Ah receptor binding of halogenated aromatic xenobiotics. Environm. Health Perspect. 1996, 12, 1302.

24. Nebert D.W., Gelboin H.V.: Substrate-inducible microsomal aryl hydroxylase in mammalian cell culture. I. Assay and properties of induced enzyme. J. Biol. Chem. 1968, 243, 6242. 25. Nebert D.W., Gelboin H.V.: The in vitro and in vivo induction of aryl hydrocarbon hydroxylase

in mammalian cells of different species, tissue, strains and developmental and hormonal states. Arch. Biochem. Biophys. 1969, 134, 76.

26. Piskorska-Pliszczyńska J., Safe S.H. : Radioligand - dependent properties of the Ah receptor from rat and mouse hepatic cytosol. Chemosphere 1988, 119, 963.

27. Piskorska-Pliszczyńska J:. Toksyczność i mechanizm działania dioksyn. Medycyna Wet. 1996, 52, 94.

28. Poellinger L., Lund J., Gillner М., Hansson L A ., Gustafsson A A :. Physicochemical characte­ rization od specific and nonspecific polyaromatic hydrocarbon binders in rat and mouse liver cytosol. J. Biol. Chem. 1983, 258, 13535.

29. Poland A., Glover E., Kende /4.5.: Stereospecific, high affinity binding of 2,3,7,8-tetrachlo- rodibenzo-p-dioxingy hepatic cytosol. Evidence that the binding species is receptor for induction of aryl hydrocarbon hydroxylase. J. Biol. Chem. 1976, 251, 4936.

30. Purdy R.: A hierarchical QSAR model for predicting carcinogenicity. Intern Lab News. 1997, 6, 16.

Metody SAR i QSAR w badaniu dioksyn 445 31. Reddick D.S., Huang Y., Harper PA., Okey A.B.: 2,3,7,8-tetrachIorodibenzo-p-dioxin versus

3-methylcholantrene: comparative studies of Ah receptor binding, transformation, and induction of CYP1A1. J. Biol. Chem. 1994, 269, 12118.

32. Romkes М., Piskorska-Pliszczyńska J., Keys B., Safe S., Fujita Т.: Quantitative structure - activity relationships: analysis of interaction of 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin and 2- substituted analogues with rat, mouse, quinea pig and hamster cytosolic receptor. Cancer Res. 1987, 47, 5108.

33. Romkes М., Safe S., Mason G., Piskorska-Pliszczyńska J., Fujita Т.: Binding of substituted aryl hydrocarbons to the Ah receptor-a QSAR analysis. Chemosphere 1987, 16, 1719. 34. Romkes М., Piskorska-Pliszczyńska J., Safe S.: Effect of 2,3,7,8-tetrachIorodibenzo-p-dioxin

on hepatic and uterine estrogen receptor levels in rats. Toxicol. Appl. Pharmacol. 1987, 87, 306.

35. Safe S., Sawyer Т., Mason G., Bandiera S., Keys B., Romkes B., Piskorska-Pliszczyńska J.,

Żmudzka В., Safe L:. Polychlorinated dibenzofurans: quantitative structure - activity rela­

tionships. Chemosphere 1985, 14, 675.

36. Safe S.: Comparative toxicology and mechanism of action of polychlorinated dibenzo-p-di- oxins and dibenzofurans. Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 1986, 26, 371.

37. Safe S., Fujita Т., Romkes М., Piskorska-Pliszczyńska J., Homonko K , Denome M A.: Proper­ ties of 2,3,7,8-TCDD receptor a QSAR approach. Chemosphere 1986, 15, 1657.

38. Safe S., Piskorska-Pliszczyńska J., Denome MA., Leece B.A., Towner R , Li S.M A .: Modula­ tion of 2,3,7,8-TCDD hepatic cyosolic receptor levels by PCB and organochlorine pollutants. Chemosphere 1986, 15, 2085.

39. Safe S., Mason G., Keys B., Farrell K , Żmudzka В., Sawayer Т., Piskorska-Pliszczyńska J., Safe

L., Romkes М., Bandiera S.: Polychlorinated dibenzo-p-dioxins and dibenzofurans correlation

between in vitro and in vivo structure - activity relationships. (SARs). Chemosphere 1986, 15, 1725.

40. Safe S.: Determination of 2,3,7,8-TCDD equivalent factors (TEFs): support for the use of the in vitro АНН induction bioassay. Chemosphere 1987, 16, 791.

41. Safe S., Mason G., Ferell K , Keys B., Piskorska-Pliszczyńska J., Madge J.A., Chittim В Validation of the in vitro bioassays for 2,3,7,8-TCDD equivalents. Chemosphere 1987, 16, 1723.

42. Safe S., Mason G., Sawayer Т., Zacharewski Т., Harris М., Keys B., Farell K , Holcomb М.,

David D., Safe L., Piskorska-Pliszczyńska J., Leece B., Denome M.A., Hutzinger O., Thoma H., Chittim B., Madge J.: Development and validation of in vitro induction assays for toxic

halogenated aromatic mixtures: a review. Toxic. Idustr. Health. 1989, 5, 757.

43. Safe S.H.: The aryl hydrocarbon (Ah) receptor. ISI Atlas of Science. Pharmacology 1988, 78.

44. Sawayer Т., Safe S.: PCB isomers and congeners: induction of aryl hydrocarbon hydroxylase and ethoxyresorufin o-deethylase enzyme activities in rat hepatoma cells. Toxicol. Lett. 1982, 13, 87.

45. Sawayer Т., Jones D., Rosanoff K , Mason G., Piskorska-Pliszczyńska J., Safe S.: The biological and toxin effect of 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin in chickens. Toxicol. 1986, 39, 197. 46. Sokołowski М.: Dioksyny. Ocena zagrożenia środowiska naturalnego oraz metody ich wykry­

wania. Biblioteka Monitoringu Środowiska, Warszawa 1994.

47. Starek A.: Toksykologia związków chloroorganicznych w zarysie. Roczn. PZH. 1996, 47, 1. 48. Zeeman М., Auer С.М., Clements R.G., Nabholz J.V., Boethling R.S.: U.S. ЕРА regulatory

perspective on the use od QSAR for new and existing chemical evaluations. SAR and QSAR Environ. Res. 1995, 3, 179.