Isolering en structuuropheldering van alkaloïden uit Lunasia amara blanco

Inleiding en doelstelling van het onderzoek 7

Enkele botanische gegevens 8

Hoofdstuk I 11 II 11 III / I IV / I V 11 VI 11 VII 11 VIII 11 IX 11 X 11 XI Samenvatting Summary Literatuur Literatuuroverzicht 9

Voorgeschiedenis van het onderzoek 19 De opwerking van het ruwe extract 22 Eigenschappen der verkregen alkaloïden 31 Beschouwing van de resultaten der opwerking 40 De opheldering van de structuur en de synthese

van het alkaloïde Lunasia 1 43

De opheldering van de structuur van het

alkaloïde L unasia 6 62

Synthetische onderzoekingen voortvloeiende uit

de opheldering van de structuur van Lunasia 6 69 De structuur van het alkaloïde Lunasia 2 94 De structuur van eduline, een alkaloïde uit

Casimiroa edulis Llave et Lex 112

Enige opmerkingen over de verkregen resultaten 115 118 120 122

INLEIDING EN DOELSTELLING VAN HET ONDERZOEK

De boom struik L unasia amara Blanco, welke op de Philippijnen en in Indonesië voorkomt, was reeds lang de inboorlingen van de Philippijnen bekend. BLANCO (1837) deelde mede dat de zeer bitter smakende bast onder meer werd gebruikt tegen maagklachten en een aftreksel hiervan als geneesmiddel tegen slangenbeet. Deze en andere mededelingen waren de aanleiding tot het ter hand nemen van de be-studering van de plant in het laatste decennium van de vorige eeuw; sindsdien zijn de resultaten van verschillende onderzoekingen gepu-bliceerd. De voor het begin van ons werk verschenen verhandelingen behelzen de isolering en de karakterisering van enige alkaloïden, van welke in vrijwel alle gevallen pharmacologische bijzonderheden wer-den medegedeeld. Alhoewel enige chemische studies werwer-den verricht,

waren de structuren der alkaloïden nog onbekend.

Bij een bestudering van deze oudere literatuur leek het waar-schijnlijk dat in meer dan één geval verschillende onderzoekers een-zelfde alkaloïde hebben beschreven. Volledige overeenstemming in de opgegeven eigenschappen is er daarbij evenwel niet; er is zelfs enige malen sprake van gegevens die duidelijk met elkaar in strijd

zijn.

Gezien deze verschillen stelden wij ons in de eerste plaats ten doel de alkaloïden te isoleren en zo goed mogelijk te karakteriseren. Daarna wilden wij proberen de structuren van een of meer der alkalo-iden op te helderen .

Tijdens ons werk bleek door het verschijnen van twee publicaties dat men zich op dat ogenblik ook elders bezighield met de alkaloïden uit L unasia species. In deze publicaties en in enige andere welke tijdens het verdere verloop van ons onderzoek verschenen, werd onder-meer de opheldering van de structuren van enige alkaloïden beschre-ven.

Dit alles was natuurlijk van invloed op het verdere verloop van ons werk. Dit werd gericht op de door ons geïsoleerde alkaloïden welke, hetzij niet door de onderzoekers in questie waren verkregen, hetzij niet diepgaand waren bestudeerd. Wij konden hierbij, mede door gebruik te maken van het reeds verkregen inzicht, de structuren van enige alkaloïden ophelderen.

De wijze van weergave van onze onderzoekingen in dit proefschrift houdt vanzelfsprekend hiermede verband. Het accent is gelegd op de structuuropheldering ; de andere onderdelen zijn beknopt weergegeven.

Enkele resultaten zijn eerder medegedeeld in enige voorlopige publi-caties (BEYERMAN en ROODA, 1959, 1960).

ENIGE BOTANISCHE GEGEVENS*)

In de Maleise archipel en op de Philippijnen komen volgens MIQUEL (1859, 1867) vier species voor die behoren tot het geslacht Lunasia, hetwelk behoort tot de Rutaceae. Het zijn L. costulata Miquel, L. parvifolia Miquel, L. grandifolia Miquel en L. amara Blanco. KOORDERS en VALE TON (1896) stellen voor deze te beschouwen als variëteiten van één soort, L unasia amara Blanco, aangezien zij voor zover bekend slechts verschillen in de vorm der bladeren en in bloem en vrucht volkomen overeenkomen. Sindsdien zijn geen gegevens bekend geworden die hiermee in strijd zijn en daarom zullen wij ons, in navolging van deze en latere onderzoekers, bij dit voorstel aan-sluiten.

L unas ia amara Blanco wordt in de oudere literatuur ook aangeduid als Mytilicoccus costulatus Miq. en als Rabelaisia philippinensis Planch. Het is een kleine boomstruik die verspreid groeiend voorkomt. Zij bereikt een hoogte tot ongeveer 12 m en een stamdiameter van on-geveer 15 cm (WIRTH, 1931).

Ook in het noordelijke deel van Australië, onder andere in Noord-Queensland, vindt men een vertegenwoordiger van het geslacht L una-sia. Naar JOHNSTONE, PRICE en TODD (1958) mededelen wordt deze als identiek met het op Nieuw-Guinea voorkomende L unas ia quereifolia (Warb.) Lauterb. et K.Schum. beschouwd. Zij is nauw ver-want met L. amara Blanco, niet alleen morphologisch, maar ook wat betreft de alkaloïden die zij bevat. L unas ia qu e rei fo lia is een kleine boom welke een hoogte tussen 3 en 5 m bereikt.

*) Drs. P.J.Nieuwdorp, Laboratorium voor Algemene en Technische Biolo-gie der Technische Hogeschool te Delft, ben ik zeer erkentelijk voor het nazien en corrigeren van deze gegevens.

INLEIDING

HOOFDSTUK I

LITERATUUROVERZICHT

Hoewel reeds ongeveer 70 jaren zijn verstreken sinds de eerste onderzoekingen naar de alkaloïden van L unasia amara Blanco werden verricht en hoewel in dit tijdperk de resultaten van diverse studies zijn gepubliceerd is toch pas sinds kort een inzicht verkregen in de structuren van de alkaloïden. In het bij zonder de verhandelingen van GOODWIN en medewerkers, verschenen vanaf 1957, waarin de isolatie van niet minder dan 14 alkaloïden wordt beschreven, geven ons een veel duidelijker beeld van de aanwezige alkaloïden. Als gevolg hier-van heeft de oudere literatuur voor een belangrijk gedeelte nog slechts historische waarde. De bij het bestuderen daarvan in het oog vallende, elkaar tegensprekende gegevens kunnen veelal worden teruggebracht op kennelijk onjuiste oP9aven van één of meer onderzoekers.

Wij beperken ons daarom tot een kort overzicht van deze oudere li teratuur, met name tot gegevens betreffende het onderzochte materi-aal en de karakterisering der verkregen alkaloïden. Enige oudere onderzoekingen zijn onvermeld gelaten omdat, naar door BOORSMA (1899) is aangetoond, hierbij naar alle waarschijnlijkheid materiaal van een andere plant, Lophopetalum toxicum, in het spel is geweest, zulks tengevolge van een vergissing bij het verzenden van de bast. Het betreft hier de onderzoekingen van LOHER (1893), ROSENTHAL (1893), GAERTNER (1895), WEIGT (1895) en PL UGGE (1896). Een korte samenvatting en een discussie van het door hen onderzochte materiaal wordt gegeven door DIETERLE en BEYL (1937).

DE OUDERE LITERATUUR

De eerste, van wien mag worden aangenomen dat hij werkelijk Lunasia amara onderzocht, was LEWIN (1897). Deze onderzoeker iso-leerde uit de bast een microkristallijne, verder niet gedefiniëerde stof die in water en in alcohol oplosbaar was en die "1 unas ine" werd ge-noemd.

Bijna gelijktijdig onderzocht BOORSMA (1899, 1900, 1904) deze soort; met zijn veel verder voerende studie kan men eigenlijk eerst met recht spreken van het begin van het onderzoek van L unasia amara Blanco. Uit bast van Javaanse oorsprong (Gunung Kidui) kon BOORS-MA drie alkaloïden isoleren die hij "lunasine", "lunacrine" en "1una-cridine" noemde. Lunasine, smeltpunt 1430, was oplosbaar in water

uit water en smolt daarna bij 87-88 0 ; na drogen bij 1050 was het smeltpunt 1140. Lunacridine tenslotte, smeltpunt 82-840 , was moeilijk tot kristallisatie te brengen en was zeer zwak basisch; uit een op-lossing in 10%-ig zoutzuur kristalliseerde het nog als de vrije base. Naast de bast onderzocht BOORSMA ook de bladeren en vluchtig het hout. Uit de bladeren werd naast de drie genoemde alkaloïden nog een vierde verkregen, "lunine" genaamd, smeltende bij 2190 en zo zwak basisch dat het zich goed uit een oplossing in 10%-ig zoutzuur liet extraheren. Het hout bleek lunasine te bevatten en waarschijnlijk ook lunacrine, verder werd in geringe hoeveelheid een alkaloïde ge-isoleerd dat scherp smaakte, tegen ongeveer 1600 onder bruinkleuring begon te smelten en goed oplosbaar was in verdunde zuren.

BOORSMA gaf geen resultaten van elementairanalyses met uit-zondering van de opgave dat lunacrine en lunacridine stikstof bevat-ten; evenmin vermeldde hij een eventuele optische activiteit. Aangaande de chemische eigenschappen constateerde BOORSMA nog dat lunasine zeer gevoelig was voor behandeling met alkali; daarbij ging het over in lunacridine.

Hierna werd L unasia amara onderzocht door BRILL en WELLS (1917). Door extractie van de bast, naar alle waarschijnlijkheid van Philippijnse oorsprong, met een mengsel van methanol en ethanol werd een bruine, amorfe, hygroscopische stof verkregen, die zeer goed in water oploste en uitzonderlijk bitter was. Ook uit de gedroogde bladeren kon hetzelfde product worden geïsoleerd, ogenschijnlijk in geringere opbrengst. De onderzoekers vermeldden geen smeltpunt of elementairanalyse, wel werd qualitatief stikstof aangetoond. Zij constateerden, dat dit alkaloïde overeenkwam in eigenschappen met het

lunasine van BOORSMA.

In 1931 werden de resultaten gepubliceerd van een studie door WIRTH van materiaal van Javaanse oorsprong (Gunung Kidui). De wijze van opwerking was in principe dezelfde als die gebezigd door BOORSMA. Zowel uit hout en bast tezamen (twijgen en takken, voor-namelijk hout) als uit de bast alleen kon WIR TH twee alkaloïden iso-leren. Het eene alkaloïde had als smeltpunt 188-1890 onder ontleding, was goed oplosbaar in water en in alcohol en smaakte uiterst bitter. Als elementaire samenstelling van deze verbinding, voor welke BOORS-MA's naam lunasine werd overgenomen, vond WIRTH C16H21N20S' Het andere alkaloïde kristalliseerde uit water in de vorm van lange naalden met smeltpunt 115~-1160; gezien de gelijkenis met BOORS-MA' s lunacrine behield WIR TH deze naam. Met dit alkaloïde, waaraan hij de elementairformule C 16H20N03 toekende, werden chemische onderzoekingen uitgevoerd. Bij een destructieve destillatie met zink-stof konden chinoline (microchemische reactie met kaliumferricyanide),

skatooi (reuk) en ammoniak (Nessier' s reagens) worden aangetoond. Ondanks vele pogingen kon bij deze studie het lunacridine van BOORSMA niet worden geïsoleerd. WIRTH meende dat dit goed te verklaren is, indien men aanneemt dat dit alkaloïde een artefact is, dit naar aanleiding van de ontdekking door BOORSMA, dat lunacri-dine ontstaat uit lunasine door de inwerking van alkali.

Enige jaren later onderzochten DIETERLE en BEYL (1937) de bast van L unasia amara, waarschijnlijk van Javaanse oorsprong. Een opwerking op de wijze eerder toegepast door BOORSMA en door WIRTH resulteerde in de isolering van drie alkaloïden, waarvan er twee lijken overeen te komen met alkaloïden geïsoleerd door deze onderzoekers. Het zijn lunasine, smeltpunt 1880, elementairformule C16HzlNOs' met een uiterst bittere smaak, en lunacrine, uit water kristalliserend in de vorm van lange naalden met smeltpunt 95-960 , na drogen 115-1160, elementairformule C16H19N03' Het derde alkaloïde kristalliseerde pas na verloop van tijd uit de alkalische waterige oplossing waaruit reeds lunacrine was gekristalliseerd. Het kon hiervan worden gescheiden doordat het in tegenstelling tot het laatstgenoemde niet oplosbaar was in 0,1 N zoutzuur. Op deze wijze werd het in zeer kleine hoeveelheid verkregen als stevige naalden met smeltpunt 230-2310; de elementairformule bleek ClsHlSN04 te zijn. Hoewel de eigenschappen van dit alkaloïde duidelijk verschillen van die van BOORSMA's lunacridine gaven DIETERLE en BEYL het toch dezelfde naam.

Aangezien de isolering van lunacrine en van het zogenaamde lunacridine langs deze weg tijdrovend en duur was, werkten DIETER-LE en BEYL een andere werkwijze uit, die sneller was en die vrijwel dezelfde opbrengsten aan deze alkaloïden gaf. Het is niet duidelijk of hierbij ook lunasine werd geïsoleerd.

Met lunacrine werd een reeks van proeven gedaan, waarbij het alkaloïde in het algemeen zeer bestendig bleek tegen de inwerking van allerlei reagentia. Met methyleringsmiddelen als methyljodide en dimethylsulfaat trad echter zeer gemakkelijk reactie op, waarbij volgens DIETERLE en BEYL een met lunacrine isomeer product werd verkregen dat geen optische activiteit vertoonde.

Het laatste onderzoek dat was gepubliceerd voordat wij zelf onze studie van L unasia amara Blanco begonnen, was dat verricht door STELDT en CHEN (1943). Uit gedroogde bast van Philippijnse oor-sprong werd door een opwerking welke in principe niet veel verschilde van die gebezigd door vroegere onderzoekers, een viertal alkaloïden verkregen. Twee hiervan lijken overeen te . komen met alkaloïden geïsoleerd door BOORSMA: lunacrine, smeltpunt na omkristalliseren uit 50%-ige ethanol 95~0,na drogen l15°,elementairformule C16H19N03'

en lunacridine, smeltpunt 83~o, elementairformule C17H23N04'

De andere twee alkaloïden sloten zich niet aan bij reeds in de literatuur besproken producten en aan deze werden dan ook de nieuwe namen "lunamarine" en "1unamaridine" gegeven. Lunamarine heeft als smeltpunt 245-2460, elementairformule ClsH15N04 en is optisch inac

-tief. Lunamaridine smelt bij 209-2100 en is, naar STELDT en CHEN vermelden, kennelijk zeer zwak basisch daar het geen hydrochloride geeft met zoutzuur. De resultaten van de elementairanalyse wijzen op de samenstelling C 16 H 1 5NO 2'

STELDT en CHEN merken nog op, dat zij geen spoor vonden van het door anderen gevonden lunasine en constateren dat dit verklaard kan worden door het gebruik van natronloog bij hun opwerking, gezien de vondst van BOORSMA dat dit alkaloïde door behandeling daar-mede overgaat in lunacridine.

DE RECENTE LITERATUUR

De in de laatste jaren bekend geworden resultaten van het onder-zoek door GOODWIN en medewerkers over de alkaloïden uit de blade-ren van L unas ia amara van Philippijnse oorsprong en het onderzoek door PRICE en medewerkers van de bast van L unasia quercifolia uit Queensland (Australië) vullen elkaar grotendeels aan, zodat zij samen een goed beeld geven van de alkaloïden in questie. Terwijl men zou kunnen zeggen dat de eerstgenoemde onderzoekingen in wezen zijn opgezet op dezelfde wijze als de oudere studies, zij het dan dat gebruik werd gemaakt van moderne technieken, is er bij de studie van PRICE en medewerkers sprake van een nieuwe aanpak. Hierbij werden namelijk niet alleen door allerlei physische en chemische bewerkingen de alkaloïden geïsoleerd, maar werd tevens de aanwezig-heid van alkaloïden, uitgaande van het gedroogde plantenmateriaal, tijdens de opwerking steeds gevolgd met behulp van papierchromato-grafie. JOHNSTONE, PRICE en TODD (1958) vonden dat zowel in de gedroogde bast als in de bladeren van L. quercifolia twee groepen van alkaloïden aanwezig ·zijn, namelijk een groep zwakke basen, welke zich goed uit een zwak alkalische oplossing met organische oplosmiddelen laten extraheren en een groep van veel sterker basische verbindingen, welke onder deze omstandigheden zeer moeilijk te extraheren zijn.

De het laatst genoemde onderzoekers bestudeerden eveneens monsters van de bast vc;m L. amaTa op dezelfde wijze en constateer-den dat deze nagenoeg hetzelfde beeld vertonen; de meeste vlekken in de chromatogrammen corresponderen met v lekken in de chromato-grammen van extracten van L. quercifolia. Het lijkt hierdoor wel zeker dat de

hierna te vermelden resultaten van PRICE en medewerkers met L. q ue rèifolia, althans qualitatief ook voor L. am ara zullen gelden. JOHNSTONE, PRICE en TODD vonden, dat de sterke, in water oplosbare basen zeer gevoelig zijn voor behandeling met alkali: zij ontleden dan snel in zeer zwak basische, in water onoplosbare ver-bindingen. In zekere zin zou men hier kunnen spreken van een her-ontdekking, immers reeds BOORSMA (1904) had geconstateerd dat het door hem uit L. am ara geïsoleerde, in water oplosbare lunasine onder invloed van alkali overgaat in een ander eveneens door hem geïsoleerd alkaloïde, het vrijwel niet basische, in water onoplosbare lunacridine. Het is merkwaardig te constateren dat terwijl bij de onderzoekingen van WIRTH en vun DIETERLE en BEYL op grond van genoemde vondst het gebruik van sterke anorganische basen bij de opwerking werd vermeden, bij de studie van STELDT en CHEN en ook bij de recente isolering van de alkaloïden uit L.amara door GOOD-WIN en medewerkers, met het door BOORSMA gevondene geen rekening meer werd gehouden.

In dit verband lijkt het nuttig om iets te zeggen over het gebruik van de benaming alkaloide. Alhoewel de meeste definities van dit begrip een aan-wezigheid van de verbinding in questie als zodanig in een plant inhouden, zullen wij in dit proefschrift deze term eenvoudigheidshalve gebruiken voor alle ter sprake komende, uit natuurlijk materiaal verkregen stikstofhoudende verbindingen, welke dus eventueel artefacten kunnen zijn. Het is namelijk niet wel na te gaan in hoeverre verschillende van de door diverse onder-zoekers verkregen praeparaten aan het genoemde criterium voldoen, aange-zien in vrijwel alle gevallen in zeker stadium van de opwerking een basisch milieu werd gebruikt. Uit het zojuist genoemde werk van BOORSMA en van JOHNSTONE, PRICE en TODD is immers gebleken dat verschillende van de in L unas ia species aanwezige verbindingen gevoelig voor alkali zijn.

Uit de groep van de zwakke basen, welke voor omtrent 1% in de bast aanwezig zijn, konden JOHNSTONE, PRICE en TODD drie alkaloïden isoleren, hoofdzakelijk een alkaloïde met smeltpunt 117-118°,[aJ~= -510 en elementairformule C16H19N03' hetwelk het lunacrine van de oudere onderzoekingen zal zijn. Het tweede alkaloïde, smeltende bij 222-223Y20, [aJ~O=-38° en metelementairformuleC16H17N04 werd lunine genaamd, omdat het volgens de genoemde onderzoekers kennelijk identiek is met het gelijknamige alkuloïde, geïsoleerd door BOORSMA. Van de derde verkregen base kon de structuur worden opgehelderd; het bleek 7-methoxy-l-methyl-4-oxo-2-phenyl-l, 4-dihydrochinoline te zijn. Sterke aanwijzingen hiervoor werden verkregen door afbraak,

het bewijs werd geleverd door vergelijking met een door synthese verkregen praeparaat.

In de groep van de in water oplosbare sterke basen is tot op heden nog slechts de isolering en karakterisering van één hiervan beschre

-ven (PRICE, 1958, 1959) en wel in de vorm van een picraat. De quaternaire base heeft als samenstelling C 17H2203N~ en bevat twee methoxy 19roepen en één methy limidegroep. Door behandeling met loog gaat zij over in een zeer zwak basische verbinding, smeltpunt 85-860, welke volgens de genoemde onderzoeker identiek zal zijn met het lunacridine dat eerder is geïsoleerd door BOORSMA en door S TELDT en CHEN. Bij verdere chemische onderzoekingen kon PRICE de quaternaire base, het lunacridine en de tertiaire base lunacrine in el-kaar overvoeren; hierop zullen wij later nog nader ingaan.

De door GOODWIN, SMITH en HORNING (1957) gebruikte methode voor de bereiding van een gezuiverd extract uit de bladeren van L unas ia amara van Philippijnse oorsprong verschilde 'niet veel van die gebezigd door de meeste eerdere onderzoekers. Een door behande-ling van de gedroogde bladeren met ethanol verkregen extract werd in eerste instantie gezuiverd door extracties van zure en alkalische oplossingen hiervan met enige organische, niet met water mengbare v loeistoffen. De verkregen olie werd onderworpen aan chromatografie over neutraal aluminiumoxyde, waarbij een scheiding in verschillende fracties optrad. Uit deze fracties konden. door omkristalliseren en zo nodig opnieuw chromatograferen, naar GOODWIN, SMITH, VELAS-QUEZ en HORNING (1959) mededelen, niet minder dan 14 alkaloïden worden verkregen.

Een hiervan is het 4-methoxy-2-phenylchinoline, waarvan de op-heldering van de structuur en de synthese reeds door GOODWIN, SMITH en HORNING werd beschreven. Daarnaast werd een alkaloïde verkregen dat nauw verwant in structuur bleek te zijn met het voor-gaande; ook dit, 4-methoxy- 2-( 3' ,4'-methy leendioxypheny l}chinoline,

werd gesynthetiseerd.

Een derde alkaloïde, dat slechts in kleine hoeveelheid werd ver-kregen, bleek identiek te zijn met het door JOHNSTONE, PRICE en TODD uit L unasia quercifolia geïsoleerde 7-methoxy-l-methyl-4-oxo-2-phenyl-1,4-dihydrochinoline. Ook de twee andere door de laatst-genoemde onderzoekers uit L. quercifolia geïsoleerde alkaloïden, lunacrine en lunine werden verkregen en verder tevens nog een ver-binding welke overeenkomt met het eerder door STELDT en CHEN uit L. amara geïsoleerde lunamarine; voor deze drie verbindingen werden dan ook deze namen overgenomen.

In kleine hoeveelheid konden twee alkaloïden worden geïsoleerd, welke identiek bleken te zijn met de furanochinoline-alkaloïden

kokus-agine en skimmianine, die reeds eerder uit andere, eveneens tot de Rutaceae behorende planten waren geïsoleerd.

De namen die zijn gekozen voor vier andere alkaloïden brengen de verwantschap tot uiting welke bestaat tussen hun structuur en die van reeds eerder genoemde verbindingen. Tenslotte zijn er dan nog twee alkaloïden, beide geïsoleerd in zeer kleine hoeveelheid, aan welke geheel oorspronkelijke namen, "lunacrinol'i _{en "lunolone"}

werden gegeven.

In TABEL I zijn de verschillende alkaloïden met hun smeltpunt en elementaire samenstelling vermeld.

TABEL I

Alkalorden uit L unasia A m ara Blanco, gersoleerd door GOODWIN, SMITH, VELASQUEZ en HORNING (1959)

4-Methox y-2-phe n y Ic hinoline I . smpt 66- 670 C

16H13NO

4-Methoxy-2-(3',4'-methy1een- II

diox yphen yl)-chinoline 11 _116-117

C17H13N03

7-Met hox y-1-met h yl-4-oxo-2-phen yl-

m

l,4-dihydrochinoline 11 _198-200 C17H15N02 Lunamarine IV 11 _245-247 C18H15N04 Kokusagine V 11 _{195-197 C} 13H9 N04 Skimmianine VI 11 _179-180 C 1:iH13N04 Lunacrine VII 11 _117-118 C16H19N03 Lunine VIII 11 _228-229 C16H17N04 Hydroxy1unacrine IX 11 _201-203 ClSH19N04 H ydroxy lunine X 11 _228-230 C16H17N05 H ydrox y lunacridine XI 11 _100-10Z C17H23N05

H ydrox y 1 unid ine XII 11 _124-125

C17H21N06

Lunacrinol XIII 11 _187-188

C 16 H 19 NO 4

Lunolone XIV 11 _100-103

-De romeinse cijfers verwijzen naar de structuurformules op volgende pagina.

FIGUUR

Alkalorden uit Lunasia Amara Blanco, gersoleerd door GOODWIN, SMITH, VELASQUEZ en HO~NING (1959)

1 o _I HaC-O V o o o I HaC-O CH3 XII

Met uitzondering van de laatste twee konden de structuren van alle alkaloïden opgehelderd worden. Het lunamarine bleek nauw ver-want te zijn met de eerder genoemde, door JOHNSTONE, PRICE en TODD geïdentificeerde verbinding III. Het is 7-methoxy-l-methyl-2-(3' ,4'-methyleendioxypheny 1)-4-oxo-l,4-dihydrochinoline; door verge-lijking met door synthese verkregen materiaal kon dit worden be-wezen.

Op basis van de resultaten van enige chemische reacties die met lunacrine werden uitgevoerd, omzettingen die deels overeenkomen met diegene welke PRICE (1958) met door hem gewonnen lunacrine had uitgevoerd, en in het bijzonder ook in verband met de ultraviQlet-spectra van de verschillende producten konden GOODWIN en HOR-NING (1959) aantonen dat dit alkaloïde een lineair geanelleerde dihydrofuranochinolon-4- structuur bezit, met een methoxysubstituent in ring A en een alkylgroep gesubstitueerd aan het a-standige C-atoom van de furanring. Een protonmagnetisch resonantiespectrum was hier-mede in overeenstemming; tevens bleek hieruit dat de methoxygroep zich bevindt op de 8-plaats en dat de alkylgroep een isopropy 19roep is.

Gebaseerd op de structuur van lunacrine kon weer met behulp van protonmagnetische resonantiespectrografie een overeenkomstige structuur voor het alkaloïde lunine worden afgeleid met een methyleen-dioxygroep in plaats van de methylgroep aan ring A (VIII).

Twee andere alkaloïden, hydroxylunacrine en hydroxylunine, zijn, naar uit de infrarood- en ultraviolet-spectra bleek, verwant met lunacrine, respectievelijk lunine. De elementairanalyse toont in beide gevallen de aanwezigheid van een extra O-atoom, hetwelk kan worden ver-klaard door de aanwezigheid van een hydroxylgroep. De protonmag-netische resonantiespectra zijn geheel in overeenstemming met de genoemde verwantschap; de plaats van de hydroxylgroep bleek in beide gevallen het centrale atoom van de isopropylsubstituent te zijn (IX respectievelijk X).

Hierboven is vermeld, dat zowel PRICE als GOODWIN en HOR-NING chemische omzettingen hebben uitgevoerd met lunacrine. Beide

groepen konden door inwerking van methy leringsmiddelen en alkali een verbinding Cl 7H23NO 4 met smeltpunt 85-860 verkrijgen die

ken-nelijk het lunacridine van vroegere onderzoekers is. Uitgaande van de structuur van lunacrine (VII) laat zich hiervoor de structuur XV afleiden. Het hydroxylunacridine toont een zo grote mate van over-eenkomst in infrarood- en vooral ultraviolet-spectrum met lunacri-dine dat een grote overeenkomst in structuur voor de hand ligt; de elementairformule duidt op een extra hydroxylgroep ten opzichte van lunacridine. De structuur XI kon worden bewezen door een oxydatie met perjoodzuur , waarbij naast aceton een aldehyde ontstond, dat gereduceerd kon worden tot de corresponderende alcohol; deze bleek

identiek met authentiek, door synthese verkregen materiaal.

Het hydroxylunidine tenslotte vertoonde ook een duidelijke ge-lijkenis met de twee voorgaande alkaloïden; in plaats van een methox-ylgroep bevat het een methyleendioxygroep. De structuur XII volgt

volgens GOODWIN, SMITH, VELASQUEZ en HORNING uit de analogie met hydroxylunacridine (XI).

Uitgaande van de nu bekende structuren van lunacrine en luna-cridine kon nu ook die van de door PRICE geïsoleerde wateroplos-bare sterke base worden afgeleid (XVI).

Kort geleden zijn resultaten bekend geworden van onderzoekinqen van RUEGGER en ST AUFF ACHER (1963) over alkaloïden uit L uTiasia amara Blanco var. repaTida (Lauterb. et K.Schum.) Lauterb., welke variëteit op Nieuw Guinea voorkomt. Naast de reeds bekende alka-loïden hydroxy lunidine, hydroxy lunacridine, lunacrine en lunacridine werden nog twee kristallijne verbindingen geïsoleerd.

Een hiervan bleek structuur XVII te hebben en deze verbinding werd daarom, gezien de verwantschap in structuur met reeds eerder geïdentificeerde alkaloïden, lunidine genoemd. De andere verbinding bleek een hieraan nauw verwante structuur te bezitten waarin de hydroxylgroep van lunidine is geoxydeerd tot een k~togroep; om deze reden werd de naam lunidonine gekozen (XVIII).

o

_,

H2C-O XVII

9

H2C-O XVIII

HOOFDSTUK II

VOO R GES C H lED E NIS V A NON S 0 N DER Z 0 E K. INLEIDING

Ons onderzoek van Lunasia am ara is te beschouwen als een voortzetting van een Or. H.C.BEYERMAN in het Laboratorium voor Organische Scheikunde van de Gemeentelijke Universiteit te Amster-dam begonnen en in het Laboratorium voor Organische Scheikunde der Technische Hogeschool te Delft voortgezet onderzoek.

Na een daartoe op instigatie van Dr. BEYERMAN via het Konink-lijk instituut voor de Tropen te Amsterdam aan het Bosbouwproef-station te Bogor (Indonesië) gedaan verzoek, werd in maart 1952 onder auspiciën van de Heer Bosbeheerder van Jogjakarta in Gunung Kidui, ten zuiden van de genoemde stad, bast van Lunasia amara ingezameld. In juli 1952 kwam 1,3 kg bast te Amsterdam aan; deze was volgens een mededeling van het Bosbouwproefstation inderdaad van L unas ia amara afkomstig. De opwerking hiervan door Or .BEYERMAN en de Heer J .S. BONTEKOE resulteerde in de isolering van enige kristal-lijne alkaloïden.

Teneinde een verdergaand onderzoek mogelijk te maken werd, wederom door bemiddeling van het Koninklijk Instituut voor de Tropen, gevraagd om meer materiaal. Het resultaat was dat een tweede zen-ding aankwam, welke eveneens omstreeks februari-maart in de omge-ving van Jogjakarta was verzameld, in totaal17kg.*)Uit deze grotere hoeveelheid werd een ruw extract bereid.

Op dit punt begon ons onderzoek; tot onze beschikking kwamen de praeparaten verkregen uit de eerste, kleine zending bast en het uit de tweede zending bereide ruwe extract.

Om te beginnen wilden wij uit dit extract de alkaloïden isoleren. Bij de uitwerking van de hiervoor te volgen werkwij ze werd, behalve met de in de literatuur vermelde resultaten der -eerdere onderzoekers ook rekening gehouden met de door BEYERMAN en BONTEKOE bij de opwerking van de eerste zending bast opgedane ervaringen. Over deze opwerking is evenwel niets gepubliceerd en aangezien er een zeer nauwe band bestaat met het onderhavige onderzoek, waarbij immers ook de preaparaten zijn gebruikt, welke tijdens de eerste opwerking van bast waren verkregen, zullen wij eerst deze opwerking *) Het Bosbouwproefstation te Bogor en de Heer Bosbeheerder te Jogjakarta ben ik dankbaar voor de ter beschikkingstelling en de identificatie van het plantenmateriaal.

Het Koninklijk Instituut voor de Tropen te Amsterdam ben ik erkentelijk voor de verleende hulp.

in het kort beschrijven. In aansluiting hierop zullen wij beschrijven, op welke wij ze uit de grote hoeveelheid bast het extract was verkre-gen dat wij ter beschikking kreverkre-gen.

OPWERKING VAN DE EERSTE HOEVEELHEID BAST.

Gemalen luchtdroge bast, 1,16 kg, werd zes maal geëxtraheerd met absolute ethanol, in totaal 3,3 1; het residu werd niet verder onderzocht. Het ingedampte extract, omstreeks 200 g, werd geëxtra-heerd met petroleumether , kooktraject 40-600, ter verwijdering van

vetten, waarbij 14 g oploste, en vervolgens behandeld met warm 3N zoutzuur; hierbij bleef een residu van enkele grammen over. De op-lossing werd met natronloog alkalisch gemaakt en achtereenvolgens met ether en met chloroform uitgetrokken; de overblijvende waterlaag werd niet verder onder zoch t.

Het chloroform-extract, 1,3 g, werd over aluminiumoxyde gechro-matografeerd; dit leverde evenwel geen kristallijne producten op. U itgaande van het ether-extract werd dezelfde cyclus van bewerkingen, extractie met zoutzuur, alkalisch maken en uittrekken van de v loei-stof met ether, nog driemaal herhaald. Op deze wij ze werd een split-sing tot stand gebracht in een in zoutzuur onoplosbaar deel, fractie A en een in zoutzuur oplosbaar deel, fractie B.

Van fractie A, 13,S· g, werd 11.8 g gechromatografeerd over een kolom van aluminiumoxyde (basisch, activiteit IV volgens BROCK-MANN en SCHODDER, 1941). Het grootste deel wf;;'rd als één fractie geëlueerd, als een olie die na enige maanden kristalliseerde, smelt-punt 68-700• Na omkristalliseren uit petroleumether-aceton werd 3,0 g

kleurloze kristallen verkregen met smeltpunt 77-780• Deze verbinding zal verder worden aangeduid als Lunasia S. De andere geëlueerde fracties, oliën met een vetachtige karakter, werden niet verder onder-zocht.

Fractie B, 7,S g, werd opgelost in 3N zoutzuur en de oplossing werd geëxtraheerd met ether, waarbij een extract C werd verkregen. Uit de zoutzure oplossing werd na staan en gedeeltelijk indampen O,6S g vaste stof verkregen; een moederloog D bleef over. Door om-kristalliseren uit methanol-water 1 :2, na neutralisatie met iets natron-loog, werd een kristallijne stof verkregen met smeltpunt 219-220°, welke verder zal worden aangeduid als Lunasia 1..

De moederloog D werd verder ingedampt en daarna behandeld met aceton-ether. Bij bewaren bij _170 scheidde zich 0.,4 g kristallijne stof af, smeltende tussen 180 en 1830; een moederloog Eresteerde. Na vijfmaal omkristalliseren uit methanol-ethylacetaat veranderde

het smeltpunt, 197-1980, niet meer. Het betreft hier het hydrochloride van een alkaloïde dat verder aangeduid zal worden als L unasia 2. De moederloog E werd gecombineerd met het eerder verkregen extract C en het geheel werd ingedampt. De aldus verkregen 5,,5 g olie werd gechromatografeerd over aluminiumoxyde (basisch, activi-teit lIl-IV). Eerst werd in totaal 1,7 g kristallijne stof, smeltende tussen 70 en 1100 geëlueerd. Na enige malen omkristalliseren werd het verder als Lunasia 3 aan te duiden praeparaat verkregen als korte witte naalden met smeltpunt 107-109°.

Bij verdere elutie werd 1,1 g kristallen met smelttraject 65-70° verkregen. Na zevenmaal omkristalliseren uit benzeen-petroleumether resteerden lange naalden met smeltpunt 1130• Bepaald onder het smeltpuntmicroscoop volgens Kofler was het smeltpunt 142-148°. Deze verbinding zal verder worden aangeduid als Lunasia 4.

OPWERKING VAN DE TWEEDE HOEVEELHEID BAST

De gemalen, luchtdroge bast, 15,2 kg, werd driemaal geëxtraheerd met 50 1 kokende alkohol; het residu woog 12 kg en werd niet verder onderzocht. Deze extractie en het indampen van het extract had plaats bij de N.V. Organon te Oss*).

Het in vacuum ingedampte extract, 2,0 kg, werd driemaal met 2 1 petroleumether , kooktraject 40-60°, geëxtraheerd. Hierbij loste onge-veer 100 g op, welke niet verder is onderzocht. Het residu werd bij 60° zevenmaal uitgetrokken met 5 1 3N zoutzuur; de overblijvende olie werd vernietigd.

Het zoutzure extract werd alkalisch gemaakt met 40 %-ige natron-loog en gedurende 32 h con tin u met ether geëxtraheerd. De waterige phase werd vervolgens met chloroform geëxtraheerd, dit gaf nog 13 g extract. De hierna resterende waterige phase werd niet verder onder-zocht. Door indampen van het etherextract werd 360 g olie verkregen, deze vormde het ons ter beschikking gestelde extract. De genoemde bewerkingen werden uitgevoerd in Delft door de heer H.' s-G RA V EN-MADE.

HOOFDSTUK III

DE OPWERKING VAN HET RUWE EXTRACT INLEIDING

Indien wij de onderzoekingen van LEWIN (1897) en van BRILL en WELLS (1917) buiten beschouwing laten, geeft een bestudering van de door de vroegere onderzoekers toegepaste wij zen van opwer-king het volgende beeld:

Voor de eerste stappen werd steeds gebruik gemaakt van twee bewerkingen. T en eerste een extractie van het plantenmateriaal met alkohol, eventueel na een behandeling met loodhydroxyde. Hierbij ging het om het extract, het residu werd niet verder onderzocht. Ten tweede een e:l{tractie met petroleumether of (in één geval) ether. Hier-bij ging het om het residu, in deze vloeistoffen oplosbare stoffen, voornamelijk vetten, werden aldus verwijderd. Ook een kleine hoe-veelheid alkaloïde zal hierbij zijn meegenomen, maar volgens opgaven van BOORSMA (1904) en WIRTH (1931) waren althans de verliezen aan alkaloïde bij de extractie met petroleumether niet groot.

De volgorde der bewerkingen verschilde; soms werd tweemaal met alkohol geëxtraheerd. De door de verschillende onderzoekers toege-paste bewerkingen zijn in volgorde in tabelvorm samengevat.

Hierna extraheerden allen het overgebleven residu met warm zout-zuur, meestal 10 %-ig. In enkele gevallen gingen extracties met water en met Y2%-ig -zoutzuur hieraan vooraf. Het deel dat uiteindelijk on-opgelost bleef werd niet verder onderzocht; het zal het merendeel van de niet basische, niet alkaloïdische bestanddelen van het

oor-spronkelijke materiaal hebben bevat.

De verkregen extracten werden, voor zover nodig, alkalisch ge-maakt met natriumcarbonaat of met natronloog en dan geëxtraheerd met ether en daarna met chloroform. De overblijvende waterige oplos-singen werden niet verder onderzocht. Zij bevatten waarschijnlijk vrijwel geen alkaloïden meer, zulks is door DIETERLE en BEYL (1937) aangetoond.

Was de procedure tot nu toe in grote lijnen bij allen dezelfde, de verdere opwerking toont grotere verschillen. Het eerder beschrevene had voornamelijk tot doel een afscheiding der niet alkaloïdische be-standdelen, voortgaande trad naast een verdere zuivering de scheiding van de verschillende alkaloïden naar voren. In het algemeen betrof het een scheiding naar de oplosbaarheid in verdund zoutzuur, waar nodig aangevuld met een scheiding naar de oplosbaarheden in di verse oplosmiddelen.

TABEL II

Overzicht van de bij het eerste stadium der opwerking toegepaste bewerkingen

BOORSMA WIRTH DIETERLE STELDT BEYERMAN Bast-Bladeren en BEYL en CHEN en BONTEKOE

Extractie met ethanol

-

+ + +

-

+ Extractie met petroleumether + + + + +(ether) + Behandeling met Pb(OH)2 + + + +

-

-Extractie met ethanol + + + + +

-Extractie met water + + +

-

-

-Extractie met \1,% HCl + + +

-

-

-Extractie met 10% HCl +

-

+ +(sterk + + HC1) Alkalisch ge-maakt met Na 2C03 + + + + (NaOH) (NaOH)

Bij een beschouwing der uiteindelijk geïsoleerde alkaloïden valt het op dat enige hiervan vrijwel niet basisch zijn. Het doet enigzins vreemd aan dat deze alkaloïden tijdens de opwerking toch goed op-losbaar waren in zoutzuur en zelfs daarmee werden geëxtraheerd. Een verklaring kan zijn dat zij in eerste instantie niet als zodanig aanwezig waren, doch tijdens de verschillende bewerkingen werden vrijgemaakt of zijn ontstaan door ontleding, zodat wij dus te maken zouden hebben met artefacten. De in het literatuuroverzicht genoemde resultaten van BOORSMA en van JOHNSTONE, PRICE en TODD vormen een sterke aanwijzing in deze richting.

In ieder geval lijkt het waarschijnlijk dat de fracties die wegens hun onoplosbaarheid in zuur bij de opwerking ter zijde werden gelaten, nog hoeveelheden van deze alkaloïden zullen bevatten. Het moet dus gewenst worden geacht zulke fracties verder te onderzoeken; er zullen dan echter andere scheidingsmethoden moeten worden gebruikt als gevolg van de aanwezigheid van grote hoeveelheden eveneens niet basische, niet alkaloïdische bestanddelen.

De zojuist beschreven wij ze van opwerking zou kunnen worden gekenschetst als klassiek. Tegenwoordig staan nog enige andere

werkwij zen ter beschikking, welke zich in principe goed lenen voor dO'eleinden als de onderhavige, met name de kolomchromatografie en

de methode van verdeling in tegenstroom.

EIGEN ONDERZOEK

Bij de beantwoording van de vraag hoe de verdere verwerking van het ons ter beschikking staande residu aan te vatten, op de klassieke wijze of langs meer moderne weg, werd om twee redenen de eerstge-noemde werkwijze gekozen. In de eerste plaats zouden wij dan kunnen profiteren van de resultaten der eerdere onderzoekingen, terwij I met de andere methoden voor L unas ia am ara nog weinig of geen ervaringen bekend waren. Verder was de hoeveelheid ter beschikking staand extract, 360 g, zo groot dat zij bij de moderne methoden een wat moeilijk hanteerbare apparatuur zou vereisen. Verwerking in enige kleinere en dus meer handelbare porties leek niet aantrekkelijk, onder meer in verband met de daarvoor benodigde tijd.

Het lag niet in de bedoeling alleen de oudere werkwij ze toe te passen; na verwijdering van het grootste deel der verontreinigingen en een scheiding in enige fracties wilden wij bij de verdere zuivering en scheiding gebruik maken van kolom chromatografie. Ervaringen van STELDT en CHEN en van BEYERMAN en BONTEKOE hadden reeds getoond dat hiermee in deze gevallen goede resultaten waren te be-reiken.

Tijdens de opwerking hebben wij met de uit de eerste charge ver-kregen praeparaten een papierchrom atografische scheidingsmethode uitgewerkt, waardoor wij in staat waren de opwerking te volgen.

PAPIERCHROMATOGRAFIE

In eerste· instantie werd nagegaan op welke wij ze de ter beschik-king staande alkaloïden zichtbaar konden worden gemaakt. Alle ble-ken, op papier gebracht, te fluoresceren in ·ultraviolet licht, Lunasia

1 uitermate sterk blauw, Lunasia 2 en 4 sterk violet en Lunasia 3 en 5 zwak violet. De fluorescentie van de laatste twee was alleen zicht-baar, indien de vlek klein, dat wil zeggen de concentratie relatief hoog was; de andere alkalorden konden zeer goed worden herkend. Alle verbindingen bleken een kleurreactie te geven met kaliumbis-muthjodide, het reagens van DRAGENDORFF, samengesteld volgens MUNIER en MACHE BOEUF (1949). Met jodiumdamp in zeer kleine concentratie ontstonden zeer duidelijke vlekken. Bij alle alkaloïden

waren deze geel gekleurd, behalve bij Lunasia 2, in welk geval een lichtbruine kleur ontstond, ook in kleine concentraties. Na deze be-handeling met jodium bleek, dat bij Lunasia 1 de kleur van de fluor-escentie in ultraviolet licht was verandered tot uitermate sterk groen; bij L unasia 2 was de kleur veranderd van violet in blauw.

Bij het zichtbaar maken werden de drie hierboven genoemde m· e-thoden meestal gecombineerd. Eerst werd het chromatogram bekeken in ultraviolet licht, daarna behandeld met jodium en tenslotte eventu-eel bespoten met het reagens van DRAGENDORFF.

Diverse vloeistoffen werden als loopmiddel geprobeerd. Door de geringe oplosbaarheid der alkaloïden in water hadden slecht hiermee mengbare oplosmiddelen geen succes. Ook het werken in zuur milieu had geen gunstig gevolg omdat de meeste verbindingen slechts zeer zwakke basische eigenschappen bezitten·. Wij slaagden er niet in één loopmiddel te vinden waarmee alle alkaloïden goed van elkaar waren te onderscheiden.

Relatief de beste resultaten werden verkregen met water-methanol in de verhoudingen 9:1 en 1:10. TABEL III Alkaloi"de Rf in Rf in Water-methanol 9:1 Water-methanol 1 : 1 0 Lunasia 1 0,26 0,68 Lunasia 2 O,S 6 0,82 Lunasia 3 - 0,88 Lunasia 4 0,38 0,82 Lunasia 5 - 0,88 Lunasia 6 - 0,82

Met het eerstgenoemde systeem trad een complicatie op door de slech te oplo sbaarheid van de alkaloïden in de loopv loei stof. Al s gevolg hiervan ontstonden langgerekte vlekken, bij Lunasia 1 zelfs reikende tot de oorsprong. Ongunstig was ook dat Lunasia 3, 5 en 6 hiermee in het geheel geen duidelijke vlekken gaven, zodat deze niet konden worden herkend. Gezien deze complicaties vereiste het inter-preteren van de chromatogrammen ervaring; door een combinatie van de resultaten met de twee loopmiddelen waren toch conclusies te trekken. Met water-methanol 1: 10 onderscheidt men Lunasia I,

Luna-sia 2

+

4, Lunasia 3

+

5 en Lunasia 6. Met water-methanol 9: 1 is verder onderscheid te maken tussen Lunasia 1, Lunasia 2 en

Luna-sia 4.

Later is gebleken dat ook JOHNSTONE, PRICE en TODD (1958) zich met papierchromatografie van alkaloïden uit Luna s ia species hebben bezig gehouden. Evenmin als wij slaagden zij er in voor de tertiaire basen een in alle opzichten voldoend systeem te vinden.

DE OPWERKING

Voorafgaande aan de eigenlijke opwerking werden enkele proeven gedaan met 5-10 g van het op te werken extract, waarvan de bereiding in het vorige hoofdstuk werd beschreven. Aan de hand van de resul-taten hiervan werd de verwerking van de grote hoeveelheid van het extract ter hand genomen. Deze geschiedde in duplo, uitgaande van respectievelijk 106 g en 224 g, aangezien er daarbij geen sprake was van wezenlijke verschillen zal zij slechts éénmaal worden beschreven, waarbij de hoeveelheden der fracties en der alkaloïden betrokken worden op het totaalgewicht van het extract.

In het onderste deel van het nevenstaande schema is het eerste stadium van de opwerking, de scheiding in een aantal fracties weer-gegeven. In het schema is verder aangegeven welke alkaloïden bij de verdere verwerking en zuivering in hoofdzaak uit deze fracties werden verkregen.

Bij een vergelijking van deze alkaloïden met die welke waren verkregen door BEYERMAN en BONTEKOE, voor zover het smeltpun-ten, elementaire samenstellingen en infrarood- en ultraviolet-spectra betreft, bleek in verschillende gevallen sprake te zijn van één en hetzelfde product. Waar dit het geval is zullen wij dit in het onder-staande vermelden; voor deze alkaloïden zal verder de door de ge-noemde onderzoekers gebezigde nummering worden gebruikt. Voor twee van onze praeparaten welke niet overeenkwamen, werden aansluitende nummers gekozen. In de hierna te geven beschrijving zal niet nader worden ingegaan op de eigenschappen van de verschillende alk alo-iden; deze komen in het volgende hoofdstuk ter sprake.

Allereerst werd het ruwe extract, 330 g groenbruine, zeer visceuze olie geëxtraheerd met 3N zoutzuur. Hiertoe werd het onder roeren ver-hit met omstreeks 200 mI zuur, zodanig dat dit kookte. Het zuur werd telkens gedecanteerd en vervangen door een nieuwe hoeveelheid; in totaal werden omtrent 10 van dergelijke behandelingen uitgevoerd. De eerste extracten, na

Y2h,

lh en 2h koken, bevatten het grootste

27

FIGUUR 2

SCHEMA VAN DE OPWERKING I LUCHTDROGE BAST I

IRESIDUI

IEXTRACTI

Extractie met ethanol Indampen

IEXTRACTI

Extractie met petroleumether

IRESIDU 1

.. ~ ___ --1! Extractie met 3 N zoutzuur (60°) IRESIDUI 11

-I WATERLAAG I

IEXTRACTI

Alkalisch gemaakt met natronloog Extractie met ether

Extractie met chloroform

IWATERLAAG! _ Indampen

Indampen '-I E"""'X=T =-RA7"""C=T=->!

- - - IEXTRACTI - - -

-Extractie met kokend 3 N zoutzuur Lun6 -IRESIDU!

-

Bewaren

Lun 1 -IKRISTALLEN!

-

Extractie met chloroform

IZOUTZUURLAAG I IEXTRACTI

Alkalisch IVASTE STOF! gemaakt met I ng e da m pt. ut ra c tie met kokend 3 N zoutzuur lEXTRACT! ....:-I -+ Lun2.4,7 I lEXTRACT! -Na₂C0₃

+

Lun 2 Extractie met -chloroform Natronloog toe-ge voe gd. extra c tie met chloroform IRESIDU!

-+

Lun 6

-

IEXTRACTI lEXTRACT!

....-+

Extractie met chloroform

deel van de oplosbare stoffen, het laatste, waarbij de bewerking in totaal omstreeks 60h had geduurd, zeer weinig. Als residu bleef 125 g donkerbruine, na drogen door verhitten onder verminderde druk half-vaste olie over, welke na enige weken tekenen van kristallisatie vertoonde. Er werden verschillende pogingen ondernomen om deze olie te zuiveren met behulp van di verse oplosmiddelen. Het meest doeltreffende bleek een continu uitgevoerde extractie met warme petroleumether in een vloeistof-vloeistof extractor te zijn. Hierbij resteerde ongeveer 40 g zeer donkerbruine, taaie olie welke blijkens een papierchromatogram nog een hoeveelheid van het later nog nader te noemen alkaloïde Lunasia 1 bevatte. Bij bewaren van de olie scheidde dit zich geleidelijk af als een vaste stof, die door behande-ling met aceton, waarbij de rest oploste, kon worden geïsoleerd. Op deze wij ze werd 2,2 g gele vaste stof verkregen met smeltpunt-traject 200-2200• Verder ·konden uit deze olie geen kristallijne pro-ducten meer worden geïsoleerd. Het lichtoranje gekleurde petroleum-etherische extract werd gedeeltelijk ingedampt en gedecanteerd van een kleine hoeveelheid olie, die zich hierbij had afgescheiden. De overblijvende oplossing werd geënt; hierdoor trad langzaam, in de loop van enige dagen, kristallisatie op.

De aldus verkregen zwak-gele kristallen werden enige malen omgekristalliseerd uit petroleumether, kooktraject 60-80°, met als resultaat enige fracties met onderling verschillende, enige graden lange smelttrajecten, bij voorbeeld 81-870, 87-91°. De moederlogen,

welke na indampen lichtrode, slechts gedeeltelijk kristalliserende oliën gaven, werden gechromatografeerd over aluminiumoxyde waarbij geen scheiding optrad; er werden kristallijne fracties verkregen welke eveneens lange smelttrajecten hadden, bij voorbeeld 77-80°. Aange-zien echter de infrarood-spectra van alle fracties vrijwel gelijk waren werd, gez-ien ook een verschil in optische draaiing dezer fracties, aangenomen dat de smelttrajecten niet in de eerste plaats worden veroorzaakt door verontreinigingen, doch dat sprake is van een enkele stof in variërende mate van optische zuiverheid. Aan gezuiverde verbinding werd 9 g verkregen, daarnaast is nog omstreeks 80 g in gedeeltelijk gezuiverde toestand aanwezig. Dit praeparaat bleek niet overeen te komen met één van de vijf door BEYERMAN en BONTEKOE geïsoleerde alkaloïden; het zal daarom. verder worden aangeduid als Lunasia 6.

Uit de gedecanteerde zoutzure extracten scheidden zich bij be-waren na enkele dagen tot weken gele, tamelijk zware kristallen af. Na enige maanden werd afgefiltreerd; aldus werd in totaal 13 g hier-van verkregen. Ter zuivering werd om gekristalliseerd uit methanol en water en uit chloroform en methyleenchloride. De laatstgenoemde

oplosmiddelen voldeden beter dan de eerstgenoemde. Uiteindelijk werden witte kristallen verkregen met smeltpunt 228-2300• Deze

ver-binding bleek identiek te zijn met Lunasia 1 van BEYERMAN en BONTEKOE. Enige van de porties ongezuiverde kristallen bleken bovendien niet onbelangrijk hoeveelheden van het hydrochloride van Lunasia 2 dat hierna nog ter sprake komt te bevatten.

De bij de afscheiding van de hierboven genoemde kristallen over-blijvende zoutzure filtraten werden elk enige malen uitgetrokken met omstreeks 50 mI chloroform. Bij de van de eerste extracties met zout-zuur afkomstige filtraten trad bij de derde of vierde extractie met chloroform langzaam een afscheiding van vaste stof op, voornamelijk in de zoutzure laag. Na enige uren werd het geheel gefiltreerd; dit leverde in totaal 12 g lichtgele stof. De filtraten werden gescheiden in een zoutzure laag' A' en een chloroformische laag 'B'.

De vaste stof kon gemakkelijk worden gezuiverd door kristallisatie uit methanol-ethylacetaat en methanol-water. Het bleek dat voor het oplossen van de stof in methanol de toevoeging van een kleine hoe-veelheid water noodzakelijk was, was dit afwezig dan loste de ver-binding niet op. Op deze wij ze werd 8 g witte kristallen verkregen met smeltpunt 201-2020, welke identiek bleken te zijn met hèt door

BEYERMAN en BONTEKOE verkregen hydrochloride van Lunasia 2. Met loog kon hieruit de base worden vrijgemaakt; deze heeft als smelt-punt 203Y:i-204Y:i°.

De zoutzure oplossingen' A' werden verenigd, geneutraliseerd met vast natriumcarbonaat en daarna enige malen geëxtraheerd met chloro-form. De extracten werden na wassen met water en drogen over water-vrij magnesiumsulfaat ingedampt onder verminderde druk; dit gaf 31 g donkergroen tot bruin gekleurde olie,die na enige weken kristalliseerde. De overgebleven waterlaag werd met 2N kaliloog sterk alkalisch ge-maakt en opnieuw uitgetrokken met chloroform; dit leverde 4 g donker-groene, taaie olie. De daarna resterende waterlaag bevatte, naar uit een papierchromatografische analyse bleek, nog slechts sporen alka-loïden en zij werd dan ook niet verder onderzocht.

De beide extracten hadden qualitatief ongeveer dezelfde samen-stelling, naar uit een papierchromatografische analyse bleek. Zij werden daarom verenigd en gechromatografeerd over aluminiumoxyde, waarbij het geheel uiteenviel in twee delen, afgezien van harsen. De fracties verkregen door elutie met benzeen en daarna met ether, kristalliseerden met uitzondering van de eerste en de laatste tot een rood-bruine stof met smelttrajecten tussen 130-140°. Door omkristal-liseren uit benzeen en ben zeen-petroleumether werd een witte kristal-lijne stof verkregen met als smeltpunt 144-145Y:i°. Het infrarood-spec-trum en het gedrag bij papierchromatografie hiervan waren geheel

gelijk aan die van het Lunasia 4 geïsoleerd door BEYE RMAN en BONTEKOE.

Bij voortgezette elutie werd met ether welke 5% methanol bevatte opnieuw materiaal geëlueerd, voornamelijk lichtgele tot bruine, hars-achtige vaste stof met smelttrajecten tussen 90 en 1100• Door omkris-talliseren uit ethanol en uit ethylacetaat werd Lunasia 2 verkregen, een alkaloïde waarvan eerder reeds de isolering in de vorm van het zoutzure zout is beschreven. De moederlogen van de kristallisaties gaven. bij indampen harsen, waaruit geen kristallijn product meer kon worden geïsoleerd.

Bij het omkristalliseren van enkele der eerste met het genoemde eluens verkregen fracties werd tevens nog een geringe hoeveelheid, 0,1 g, van een ander praeparaat, smeltende bij 188-1900, verkregen. Dit kwam niet overeen met één der door BEYERMAN en BONTEKOE geïsoleerde alkaloïden, het zal verder worden aangeduid als Lunasia

7.

De eerder genoemde chloroformische extracten 'B' werden gecom-bineerd, gewassen met water en ingedampt. De aldus verkregen 135 g bruine olie werd met omstreeks 500 mI 3N zoutzuur gekookt; hierbij bleek 65 g onoplosbaar. Uit het ultraviolet-spectrum en een papier-chromatogram van dit residu bleek dat het hoofdzakelijk uit Lunasia 6 bestond. Aangezien dit alkaloïde reeds in een aanzienlijke

hoe-veelheid was geïsoleerd, werd dit residu niet verder opgewerkt. Het bij deze bewerking verkregen zoutzure extract werd uitgetrok-ken met chloroform. De overblijvende zoutzure laag werd niet verder onderzocht, aangezien uit een papierchromatogram hiervan was ge-bleken dat deze nog slechts zeer weinig alkaloïde bevatte. Door indampen van het chloroformische extract werd omstreeks 65 g vis-ceuze bruine olie verkregen die na verloop van enige weken begon te kri s talli seren.

Een deel hiervan, 14,5 g, werd opgelost in aceton. Door inleiden van zoutzuurgas in deze oplossing scheidde zich 4,5 g hydrochloride af. Aangezien omkristalli seren hiervan geen bevredigend resultaat gaf, werd met natronloog de base weer vrijgemaakt. Door omkristal-liseren hiervan uit benzeen-petroleumether werden kristallen ver-kregen met SlTleltpunt 145-1460; gezien het infrarood-spectrum betreft het hier Lunasia 4, waarvan de isolatie reeds eerder ter sprake is gekomen. De moederloog van de hydrochloride-bereiding werd inge-dampt en met natronloog behandeld. De zich daarbij afscheidende olie, 10,5 g, kon door chromatografie over aluminiumoxyde worden gescheiden in enige bestanddelen waarvan de meest belangrijke Lunasia 6 en Lunasia 4 bleken te zijn, respectievelijk in een hoe-veelheid van 4,4 g en 3,8 g.

HOOFDSTUK IV

EIGENSCHAPPEN DER ALKALOIDEN INLEIDING

Voor het verdere onderzoek stonden op dit ogenblik zeven ver-schillende alkaloïden ter beschikking, waarvan drie geïsoleerd zowel door BEYERMAN en BONTEKOE als door on.s, twee alleen geïsoleerd door de genoemde onderzoekers en twee alleen verkregen door ons. Achtereenvolgens zullen wij de eigenschappen dezer stoffen vermel-den. In het geval van de het eerst genoemde groep zullen wij de gegevens vermelden welke de door ons verkregen praeparaten be-treffen; deze waren steeds in overeenstemming met die verkregen door BEYERMAN en BONTEKOE. Aan het einde van dit hoofdstuk worden in twee tabellen de voornaamste absorpties in de uI traviolet- en in-frarood-spectra opgegeven.

De smeltpunten zijn bepaald met geijkte Anschütz-thermometers, zonder correctie voor de uitstekende kwik draad. De optische draai-ingen werden gemeten in absolute ethanol in buizen van 1 dm lengte met een Zeiss-Lippich "Kreispolarimeter 0,010" .

De elemen tairanal y se en de bepalingen der functionele groepen werden voor het grootste deel uitgevoerd door de heer M. van Leeuwen van de A nalytische afdeling van het Laboratorium voor Organische

*

Scheikunde der Technische Hogeschool te Delft ). De overige analy-ses werden uitgevoerd door de Microanalytische afdeling van het Laboratorium voor Organische Scheikunde van de Gemeentelijke Uni-versiteit van Amsterdam *).

De ultraviolet-spectra werden gemeten in 95 %-ige ethanol met een Beckman DU spectrofotometer en later met een Beckman DK-2 spectrograaf. De infrarood-spectra werden opgenomen op een

Perkin-**

Elmer spectrograaf type 21 met dubbele lichtweg en NaCl optiek. ) Tenzij anders vermeld werd chloroform gebruikt als oplosmiddel. Het bovenstC!ande geldl eveneens voor de in de verdere hoofd-stukken te vermelden experimentele gegevens.

LUNASIA 1

Smeltpunt 228-2300; het praeparaat is optisch inactief. Het schijnt

*) Ik ben de Heren M. van Leeuwen, Delft e~ P.l. Hubers, Amsterdam zeer erkentelijk voor deze analyses. .

**) Drs.A. van. Veen ben ik veel dank verschuldigd voor het opnemen en het interpreteren van deze spectra.

dat het smeltpunt aanzienlijk daalt bij aanwezigheid van kleine hoe-veelheden verontreinigingen. Voor het bereiken van het opgegeven smeltpunt moest vele malen worden omgekristalliseerd en in materiaal met een iets lager smeltpunt, bij voorbeeld 220-2230, konden door middel van het infrarood-spectrum en papierchromatografie geen ver-ontreinigingen worden aangetoond. Ook bij het later synthetisch · be-reide Lunasia 1 doet zich hetzelfde verschijnsel voor. Vermeld dient nog te worden dat eenmaal een smelttraject van 230-2330 werd ge-vonden; dit kon echter niet worden gereproduceerd.

De elementairanalyse wijst op de formule ClsHlSN04. De ver-binding bevat één methoxy 19roep en één methy limidegroep. Verder is nog een methyleendioxygroep aanwezig; de reacties op deze groep met een alkoholische galluszuur-oplossing volgens LABA T (1909) en met een oplossing van phloroglucinol in zwavelzuur volgens WE-BER en TOLLENS (1898), uitgevoerd zoals beschreven door ROTH en MEERWEIN (1953) waren positief.

Gevonden C69,9 ; H5,0 ; N4,4 ; OCH 310,7 ; (N)CH35,1 Berekend voor ClsHlSN04(309,3): 1/69,89; "4,89; 1/4,53; 1/ 10,03; 11 _4,85 LUNASlA 2 Smeltpunt 203Y2-204Y20 ;

[a]~O

=

-14 ± 10 (c

=

1,5). Omkristalliseren uit ethylacetaat gaf stevige kristallen met het genoemde smeltpunt; werd echter omgekristalliseerd uit ethanol-water dan werden bij 201-2020 smeltende fijne naaldjes verkregen, welke bij 1630 een zeer sterke verweking vertoonden. Het lijkt waarschijnlijk dat kristalvloei-stof hier een rol speelt. Bij verhitting der naaldjes in een droogstoof op omstreeks 1000 werden zij dof en bij de bepaling van het smelt-punt hierna trad geen verweking meer op.

De elementairanalyse leidt tot de eenvoudigste samenstelling C 16H 1 gNO 4; de verbinding bevat één methoxy 19roep en één methy 1-imidegroep. De kwalitatieve tests op de methyleendioxygroep waren negatief. Abf,orpties bij 3610 en bij 3300 cm- 1 (breed) in het infra-rood-spectrum wij zen er op dat een hydroxylgroep aanwezig is.

Gevonden C 66,3 ; H 6,7 ; N 4,9 ; OCH

3 10,1 ; (N)CH3 5,7

Berekend voor

Het hydrochloride van Lunasia 2 smelt bij 201-202°; de resultaten van de elementairanalyse wijzen er op dat het een half mol kristal-water bevat. Gevonden C57,7 ; H6,4 ; N4,1 Berekend voor C 16H 19NO 4 .HCl.Y2H20(334,8): "57,34;" 6,32; "4,18 C16H19N04.HCl (325,8): "58,93;" 6,19; "4,30

Voor het equivalentgewicht, bepaald door titratie met 0,1 N natron-loog en met phenolphtaleïne als indicator, werd gevonden 327Y2 en

331.

Het perchloraat van Lunasia 2 werd bereid door aan een oplossing van 102 mg Lunasia 2 in methanol-ether een oplossing van Y2 mI 45

%-ig perchloorzuur in methanol toe te voegen. Het zich hierbij direct vormende witte neerslag werd afgefiltreerd en omgekristalliseerd uit methanol-ether. Het aldus verkregen perchloraat is een witte, bij 215Y2-216° onder ontleding smeltende stof.

Gevonden : Cl 9,2

Berekend voor

C16H19N04.HCI04 (389,8):" 9,11

LUNASlA 3

Smeltpunt 107-109°; [a] ~2= +3,9

±

O,6°(c = 2,O).De resultaten van de elementairanalyse duiden op de samenstelling C 17 H2 3NO 4' De me-thoxylbepaling gaf een resultaat dat ligt tussen die, verwacht voor één respectievelijk twee groepen; het resultaat der methylimidebe-paling wij stop één methy limidegroep. Een methy leendioxygroep is niet aanwezig gezien de negatieve resultaten der kleurreacties. Uit het infrarood-spectrum blij kt dat geen hydroxylgroep aan we zig is. Gevonden _{: C 66,7 ; H 7,5 ; N 4,4 ; OCH 3 17,1 ; (N)CH 3 4,8}

Berekend voor 17,5

C17H23N04(305,3): "66,86; "7,59; "4,59;" Ix 10,16;

"

4,92

LUNASlA 4

omkristalliseren het oplosmiddel een weinig water bevatte werden niet de kleurloze kristalletjes met het genoemde smeltpunt verkregen maar lange, zeer dunne naalden die reeds bij omtrent 90 0 begonnen te smelten. Het lijkt waarschijnlijk, dat hier sprake is van een hydraat. De elementairanalyse wij st op de samenstelling C 16Hl gNO 3; de verbinding bevat één methoxylgroep en één methylimidegroep. De kleurreacties op de methyleendioxygroep hadden een negatief resul-taat; deze groep is dus niet aanwezig.

Gevonden C 69,9 ; H 7,2 ; N 5,3 ; OCH₃ 12,0 ; (N)CH₃ 6,3 Berekend voor

C16HlgN03 (273,3): 11 70,29; "7,01; 11 5,13; 11 11,35;

"

5,49

LUNASlA 5

Smeltpunt 79-810 ; [a]~2=+30

±

10 (c

=

3,0). De verbinding bleek te destilleren bij 190-210° bij 0,25 mrn Hg.

De resultaten van de elementairanalyse stemmen overeen met die, verwacht op grond van de formule C17H23N04; er zijn twee methoxylgroepen en één methy-lirnidegroep aanwezig. De kleurreacties op de methyleendioxygroep waren negatief. Een brede absorptieband bij 3300 cm- 1 in het infrarood-spectrum wijst op de aanwezigheid van een hydroxylgroep.

Gevonden C 67,2 ; H 7,5 ; N 4,7 ; OCH₃ 19,4 ; (N)CH₃ 5,5 Berekend voor

C17H23N04(305,3): "66,86; "7,59; "4,59; 11 _20,32; 11 _4,92

LUNASlA 6

Dit alkaloïde werd geïsoleerd in. en"ïge fracties die verschillen in smeltpun t en optische draaiing, bij voorbeeld smelttraject 86~-91 0,

[a]

SO

= _45~0 en smelttraject 77-800, [a]

SO

= _420 . De verbinding bleek bij 0,6-0,7 mm Hg zonder ontleding te des tilleren bij een bad-temperatuur van 180-2100; de infrarood-spectra van uitgangsproduct, destillaat en residu waren gelijk.

De resultaten van de elementairanalyse waren voor beide eer-der genoemde fracties in overeenstemming met de samenstelling Cl 6H 19NO 3' De verbinding bevat één methoxy 19roep en één methy 1-imidegroep. De kleurreacties op de methy leendioxygroep waren nega-tief.

Gevonden Sm. tr. 86Y2-91 0 C 70,0 ; H6,9 N 5,0 ; OCH₃ (N)CH₃ 77-800 " 70,5 "6,9 " 5,0 1/ _11,5

"

6,0 Berekend voor C 16H 19N03 (273,3): " 70,29; "7,01; " 5,13; 1/ _11,35; 11 _5,49

Een poging Lunasia 6 te zuiveren via het perchloraat had geen succes. Het zout, verkregen door aan een oplossing van het alkaloïde in ether een oplossing van perchloorzuur in water-methanol toe te voegen, had een smelttraject van 189-1920• Bij herhaald

omkristal-liseren gin~ dit weliswaar omhoog tot 195-2000, doch een scherp smeltend product werd niet verkregen.

LUNASIA 7

Smeltpunt 188-1900; het praeparaat was optisch inactief. Het bleek

gezien de zeer kleine hoeveelheid die ter beschikking stond, niet mogelijk om een analyse-zuiver monster te verkrijgen, mogelijkerwijs

speelde de aanwezigheid van kristalwater een rol.

Gevonden C 63,7 ; _{H 7,0 ; N 4,8 ; OCH 3 10,5 (N)CH3 5,2} Berekend voor

C 16 H21 NOs (307,4)1

(C 16 H19NO 4 .H20~:" 62,54; "6,84; 11 4,56; 1/ 10,10;

"

4,88 Klaarblijkelijk zijn één methoxylgroep en één methylimidegroep aan-wezig.

DISCUSSIE

De bij het onderhavige onderzoek verkregen alkaloïden kunnen worden verdeeld in twee groepen, de alkaloïden met duidelijk basische eigenschappen, met name Lunasia 1, 2, 4 en 7 en die -met lage basici-teit, Lunasia 3, 5 en 6. Laatstgenoemde verbindingen lossen niet op in ,verdund waterig zoutzuur, terwijl dit bij Lunasia 2, 4 en 7 vlot het geval is. Lunasia 1 gaat weliswaar eerst bij langdurige verwarming enigermate in oplossing, doch bij een vergelijking van het ultraviolet-spectrum van een oplossing van het alkaloïde in IN ethanolisch zout-zuur met het spectrum van een neutrale oplossing blijkt een duidelijk verschil. Ook bij Lunasia 2, 4 en 7 zijn er vanzelfsprekend duidelijke verschillen tussen de spectra opgenomen in zuur respectievelijk neutraal milieu; bij Lunasia 3,5 en 6, in het bijzonder bij de eerste twee, zijn deze verschillen daarentegen slechts klein.

logE

4.5

4.0

3.5

FIGUUR 3

Ultraviolet-spectra van Lunasia 1,2 en 6

"

1 - - Lunasia 1 Lunasia 2 Lunasia 6 , I

,

_,

, .•.. I ..

,

.. _.

,

_,

1

_,

; ~" 3.0 L...---''---'_--'_--'_---'-_---'-_---'-_---'-_....J 220 260 300 340 mIJ. logE 4.5 4.0 3.5 FIGUUR 4

Ultraviolet-spectra van Lunasia 3 en 5

3.0 L---''---'-_---'-_---'-_-'-_-'-_-'-_.L.I...---l

logE

FIGUUR 5

Ultraviolet-spectra van Lunasia 4 en 7

Lunasia 4 Lunasia 7

3,0 L...---'_---'_----L_----'-_----'-_--'-_..L.J..._--'-_....J

220 260 300 340 m~

Bij een vergelijking van de ultraviolet-spectra der alkaloïden zien wij een zekere overeenkomst in type tussen die van de zwak basische onderling en die der sterker basische onderling (Tabel IV). Een uitzondering vormt Lunasia I waarvan het spectrum duidelijk verschilt van die van de andere alkaloïden. Ook uit het feit dat dit alkaloïde relatief veel minder waterstof bevat dan de andere alk alo -iden blijkt dat het een aparte plaats inneemt.