JOANNA LESZ C Z YŃ SK A
M O D Y F IK A C J A E N Z Y M A T Y C Z N E J M E T O D Y O Z N A C Z A N IA C H O L E S T E R O L U
M O D IFIC A TIO N O F EN ZY M A TIC M ETH O D O F CH O LESTER O L D E TE R M IN A T IO N
Zespół Chemii Bionieorganicznej i Analitycznej Instytut Podstaw Chemii Żywności Politechniki Łódzkiej
90-924 Łódź, ul. Stefanowskiego 4/10, Kierownik: prof. dr hab. J. Masłowska
W pracy zastosowano enzymatyczną metodę oznaczania cholesterolu. Do określania aktywności peroksydazy użyto substraty, które w wyniku reakcji dają fluoryzujące produkty. Opracowaną metodę zastosowano do oznaczania chole sterolu w przetworach mięsnych. Oznaczona zawartość cholesterolu wynosiła od 40,2 do 150,0 i nie odbiegała od wartości otrzymanych przez innych autorów. Współczynnik korelacji użytej metody oraz metody enzymatycznej - kolory metrycznej wynosił 0,998.
WSTĘP
N ajczęstszym i przyczynam i zgonów w P olsce o b e c n ie są c h o ro b a n ie d o k rw ie n n a serca i zaw ały o ra z u d ary m ózgu. P rzyczyną tych c h o ró b je s t n ie praw idłow y m e ta b o liz m lipidów , cz ęsto sp o w o d o w an y n ad m iern y m spożyciem tłuszczów , zw łaszcza zw ierzęcych.
W sk aź n ik iem p raw id ło w e g o m e tab o lizm u lipidów je s t za w a rto ść c h o le ste ro lu , k tó r e go p o zio m je s t cz ęsto sk o relo w a n y z p o zio m em lipidów . C h o le ste ro l je s t n ie z b ę d n y d o w łaściw ego fu n k cjo n o w a n ia o rg an iz m u . Szkodzi d o p ie ro je g o n a d m ia r.
Z w iąz ek te n , ja k o sk ła d n ik żółci, uczestniczy w p ro c e sie tra w ie n ia , je s t p o trz e b n y do p ro d u k c ji h o rm o n ó w , zw łaszcza płciow ych, ale rów n ież antystresow ych. U m o żliw ia przysw ajanie w itam iny D. B ierze ta k ż e u d ział w b u d o w a n iu k o m ó re k m ózgu w czasie in ten sy w n eg o rozw oju w o k re sie w czesnego dzieciństw a.
Występowanie cholesterolu i jego rola
C h o le s te ro l je s t p r e k u rs o re m w szystkich innych ste ro id ó w w o rg a n iz m ie ta k ich jak : k o rty k o ste ro id y , h o rm o n y płciow e, kwasy żółciow e i w ita m in a D . J e s t typow ym p r o d u k te m m e ta b o liz m u zw ierzęcego, a w ięc zn a jd u je się w p o k a rm a c h p o c h o d z e n ia zw ierzęceg o tak ich jak : ż ó łtk a ja ja , m ięso, w ą tro b a , m ózg. W u stro ju człow ieka z n a jd u je się o n w ilości o k o ło 250 g, głów nie w m ózgu i n a d n e rc z a c h . W osoczu krwi c h o le s te rolu je s t 150 - 200 m g /l00 c m 3, a je g o ilość w zrasta przy n ie k tó ry ch sc h o rz e n ia c h . W w a ru n k a c h p ato lo g iczn y ch zw iązek te n m o że o sa d za ć się w n a rz ą d a c h i tk a n k a c h
np. w p o sta c i k a m ie n i w p rze w o d a ch żółciow ych o ra z w śc ian a ch naczyń krw ionośnych przy m iażdżycy.
Z a w a rto ś ć c h o le s te ro lu w e krwi nie p o w in n a p rz e k ra c z a ć 200 m g/dl. O k o ło p ołow a c h o le s te ro lu w o rg a n iz m ie człow ieka p o ch o d z i z syntezy, a p o z o s ta ła ilość je s t d o s ta r c z an a z pożyw ieniem . O k o ło 5 0 % zsy n tety zo w an eg o c h o le ste ro lu p o c h o d z i z w ątroby,
15% z je lit, a z n a c z n a część ze skóry.
W ciągu je d n e g o d n ia z o rg a n iz m u w ydala się o k o ło 1 g c h o le ste ro lu . P raw ie p o ło w a, p o p rz e k sz ta łc e n iu w kwasy żółciow e, je s t w y d ala n a z k ałem , p o z o s ta ła część - w p o sta c i o b o ję tn y c h ste ro id ó w . Z n a c z n a część c h o le ste ro lu w y d ala n a z żó łcią je st p o n o w n ie w c h ła n ia n a w je lita c h , a n a s tę p n ie w ychw ytyw ana p rz e z w ą tro b ę i p o n o w n ie w y d ala n a z żółcią. Z ja w isk o to je s t z n a n e ja k o k rą ż e n ie je lito w o - w ątro b o w e .
W celu o b n iż e n ia zbyt w ysokiego p o zio m u c h o le ste ro lu p o w in n a być sto s o w a n a d ie ta n isk o c h o le ste ro lo w a , k tó ra z a w iera m ożliw ie ja k najw ięcej p ro d u k tó w b o g aty ch w b ło n n ik - pieczyw a razow ego, g rubych kasz, ro ślin strączkow ych, w arzyw i ow oców . N ależy ró w n ież u n ik a ć stresó w , a p rzy n ajm n iej sta ra ć się go rozładow yw ać, r e g u la rn ie u p raw ia ć sp o rt.
Metody wykrywania i oznaczania cholesterolu
C h e m ic z n e m e to d y w ykryw ania i o z n a c z a n ia c h o le ste ro lu o p ie ra ją się z a sa d n ic z o na dw óch rea k cja ch . P od w pływ em stę ż o n e g o kw asu siark o w eg o d o c h o d z i d o o d cią g n ię c ia c z ąstec ze k w ody. T w orzy się czerw ony kw as disulfonow y b ic h o le s tia d ie n u (odczyn Sa lkow skiego).
W o b ec n o śc i kw asu siark o w eg o i b ez w o d n ik a kw asu o cto w eg o tw orzy się zielo n o za b arw io n y kw as m o n o su lfo n o w y b ic h o le s tia d ie n u (odczyn L ieb e rm a n n a -B u rc h a rd a ). Ś lady w ody u n ie m o żliw iają re a k c ję [11].
Z n a n e są ta k ż e m e to d y en zy m aty czn e z z a sto so w a n iem e s te ra z y ch o le ste ro lo w e j, oksydazy i p ero k sy d a zy [4, 9]. C h o le ste ro l o z n a c z a n o ta k ż e za p o m o c ą czujników enzym aty czn y ch , sk o n stru o w an y c h w o p a rc iu o e le k tro d ę tle n o w ą [5]. W o sta tn ic h la ta c h sto so w a n e są ró w n ież m e to d y c h ro m a to g ra fii gazow ej [1, 6, 8, 10], w tym także k a p ila rn e j [7] o ra z H P L C [2, 7]. C h o c ia ż m e to d y c h ro m a to g ra fic z n e , ja k o d o k ła d n ie jsz e i p ro stsz e , są n a jb a rd z ie j p o le c a n e d o o zn a c z a n ia c h o le ste ro lu , to ró w n ież m e to d y en zy m a ty cz n e są czułe, precyzyjne i nie w ym agają dro g iej a p a ra tu ry .
In ten sy w n o ść c z erw o n eg o z a b arw ien ia o trzy m an ej p o c h o d n e j je s t p ro p o rc jo n a ln a d o stę że n ia c h o le ste ro lu . D o p o m ia ró w fluorym etrycznych używ ano sp e k tro flu o ry m e tr firm y H ita ch i.
Z a sto so w a n a m o d y fik a cja m eto d y niniejszej p racy p o le g a n a użyciu fluoryzujących su b stra tó w d la p eroksydazy.
CZĘŚĆ DOŚW IADCZALNA Odczynniki i roztwory
Część odczynników pochodziła z zestawu do oznaczania cholesterolu firmy Aqua-med (Łódź), który zawiera: odczynnik Ri (0,1 mol/dm3 bufor fosforanowy pH 6,8; cholan sodu 1 g/dm3), odczynnik R 2 (liofilizat: esterazy cholesterolowej, oksydazy cholesterolowej, peroksydazy) oraz wzorzec cholesterolu 200 mg/100 cm3. Pozostałe odczynniki: kwas fenylooctowy, lumionol, kwas homowanilinowy, kwas p-hydroksyfenylomlekowy zostały zakupione w firmie Sigma.
Przygotowanie próbki
1 g zhomogenizowanej próbki wyrobu mięsnego (np. pasztetu) ekstrahowano trzykrotnie porcjami izopropanolu po 5 cm3, zbierając ekstrakty w kolbce pojemności 25 cm3. N astępnie dodawano 5 cm' HC1 o stężeniu 8 mol/dm3, uzupełniano izopropanolem do kreski i wstawiano do lodówki na okres 20 min. w celu oddzielenia tłuszczu. Próbkę przesączano przez bibułę filtracyjną. W ten sposób oznaczano cholesterol wolny.
W celu oznaczenia cholesterolu całkowitego najpierw przeprowadzano hydrolizę estrów cho lesterolu. W tym celu stosowano metanolowy roztwór КО Н o stężeniu 1,0 m ol/dm \ 5 cm3 tego roztworu dodawano do odważonej próbki i ogrzewano pod chłodnicą zwrotną w ciągu 25 min. stosując mieszanie za pomocy mieszadła magnetycznego. Następnie przeprowadzano ekstrakcję za pomocą kilku porcji 5 cm' izopropanolu na gorąco, po ostudzeniu filtrowano i uzupełniano w kolbie miarowej do kreski izopropanolem.
Sposób wykonania oznaczenia cholesterolu
Odczynnik roboczy przygotowywano w ten sposób, że zawartość buteleczki z odczynnikiem R2 rozpuszczano w odczynniku Ri i mieszano. W celu wykonania oznaczenia przygotowywano następujące próbki wg schematu.
Schemat przygotowania mieszanin inkubacyjnych (cm3)
W celu wykonania oznaczenia zawartości cholesterolu, do przygotowanej w oparciu o powyż szy schemat mieszaniny inkubacyjnej, w kuwecie kwarcowej dodawano 0,5 cm' roztworu kwasu p - hydroksyfenylooctowego i mierzono intensywność świecenia po 15 minutach.
WYNIKI I ICH OM Ó W IENIE
W ta b e li I ze sta w io n o dłu g o ści fal: w zb udzającej i em isji d la p oszczególnych s u b s tra tó w p eroksydazy. P o n iew aż o k az ało się, że kw as p -h y d roksyfenylooctow y m a n a j
wyższy w sk aźn ik m olow ej em isji (2,93 x 106), te n zw iązek w y k o rzy stan o w dalszych o z n a c z e n ia c h . O d c h y le n ie sta n d a rd o w e i w spółczynnik zm ien n o ści w m e to d z ie spek- tro fo to m e try c z n e j z w yk o rzy stan iem fe n o lu i 4 -am in o an ty p iry n y o ra z w m e to d z ie fluo- ry m etry czn ej kształto w ały się n a p o d o b n y m p o zio m ie . J e d n a k ż e o s ta tn ia m e to d a c h a ra k te ry z o w a ła się z n a cz n ie niższą g ra n ic ą ozn aczaln o ści. W ynosiła o n a 0,4 n g /m l w p o ró w n a n iu d o 5 (ig/m l w m e to d z ie sp e k tro fo to m e try c z n e j.
T a b e l a I. Długości fali wzbudzającej (EX) i emisji (EM ) dla poszczególnych substratów
T a b e l a I I . Zestawienie wyników oznaczania cholesterolu uzyskanych m etodą fluory- metryczną
W tabeli II przedstaw iono wyniki oznaczania całkowitej zawartości cholesterolu otrzym ane m etodą enzym atyczną z fluorymetrycznym pom iarem aktywności peroksy- dazy. Mieściły się one w norm ach przyjętych dla danych produktów i nie odbiegały od wartości podaw anych przez innych autorów . W spółczynnik korelacji między m etodą spektrofotom etryczną w oparciu o test enzymatyczny firmy A quam ed a m etodą fluo- rymetryczną wynosił 0,998.
WNIOSKI
1. Z astosow anie fluoryzujących substratów do oznaczania aktywności peroksydazy w m etodzie enzymatycznej pozwala na ponad dziesięciokrotne obniżenie granicy oznaczalności tego związku.
2. Peroksydaza jest często stosowana w różnych oznaczeniach enzymatycznych i im- m unoenzym atycznych. Celowe wydaje się być użycie kwasu p-hydroksyfeny- looctowego do oznaczania jej aktywności, gdyż wiąże się to z możliwością wykry w ania znacznie mniejszych zawartości danych związków.
J . L e s z c z y ń s k a
M O D IFIC A TIO N O F EN ZY M A TIC M ETH OD O F CH O LESTER O L D ETER M IN A TIO N Summary
Fluorim etric substrates for peroxidase activity determining were descirbed in this work so that to establish cholesterol concentration by enzymatic method, p-hydroxyphenyloacetate acid was used, as the most favourable, so that to determ ine cholesterol content in meat products. Using of this com pound enables to diminish cholesterol determining limit more than 10-times. Obtained results of cholesterol content are convergent with results obtained by the other authors.
PIŚM IENNICTW O
1. Aguello E., Gelos, B.S.: Gas - liquid chromatographic determ ination of the total and free cholesterol in egg pastes, Food Research Int. 1996, 29, 77-80.
2. A m eth W., Al.-Ahm ad H.: Cholesterol. Its determ ination in muscle and adipose tissue and in offal using HPLC, Fleiwirtschaft 1995, 75, 1001-1003.
3. Bergmayer. M ethods of enzymatic analysis, Pergamon Press.
4. Dong-Кик L., Joung-Jwa A., Hae-Soo K : Comparison of gas chrom atographic method with enzymatic methodfor cholesterol determ ination in milk and cream, Foods and Biotechnology 1997, 6, 322-324.
5. Jung-ho K , Tai-Jin K , Dong-Нее R., Bong-Soo N.\ Simultaneous determ ination of glucose, lactate and cholesterol using an oxygen electrode with the multiple cathode system, Food Sci. Biotech. 1998, 7, 28-34.
6. King A.J., Paniangvait P., Jones A.D., German J.B.: Rapid m ethod for quntification of cholesterol in turkey meat and products, J. Food Sci. 1998, 63, 382-385.
7. Moraschiello G., DiazJ., Garcia-Regueiro J.A.: Determ ination of cholesterol in fat and muscle of pig by HPLC and cappilary gas chromatography with solvent venting injection, H R C 1996, 19, 165-168.
8. Naeemi E.D., Nissar A.A., Sharrah Т.К.: Rapid and simple m ethod for determ ination of cholesterol in processed food, Journal of A O AC Int. 1995, 78, 1522-1525.
9. Pasin G., Smith G.M., O ’Mahony М.: Rapid determ ination of total cholesterol in egg yolk using commercial diagnostic cholesterol reagent, Food Chem. 1998, 61, 255-259.
10. Peterson E., A m ado R.: Simplified method for the simultaneous gas chromatografie deter mination of fatty acid composition and cholesterol in food, Lebensm.-W issenschaft und Technologie 1997, 30, 202-209.
11. Stmszyński М.: Jakościowa analiza organiczna, PWN 1960. Otrzymano: 1999.02.08
