Genetyka i hodowla
MIĘDZYGATUNK
MIĘDZYGATUNK
OWE
WE
MIESZAŃCE SOMATYCZNE ZIE
MIESZAŃCE SOMATYCZNE ZIE
MNIAKA
NIAKA
dr Anna Szczerbakowa
Instytut Biochemii i Biofizyki PAN, ul. Pawińskiego 5a, 02-106 Warszawa e-mail: annasz@ibb.waw.pl
spółczesne odmiany ziemniaka uprawnego powstawały w ciągu dziesięcioleci w procesach hodow-lanych w wyniku krzyżowań generatywnych, w tym również z gatunkami dzikimi. Jednak-że odrębność gatunków zawęża możliwości krzyżowań międzygatunkowych do gatunków spokrewnionych i nie pozwala na szerokie wykorzystanie puli genowej Solanum do ulepszania np. cech odporności ziemniaka na choroby. Barierę krzyżowalności można ominąć, stosując metodę somatycznej hybry-dyzacji, która polega na połączeniu (fuzji) protoplastów izolowanych z komórek soma-tycznych i wyprowadzeniu z nich mieszań-ców.
W
W
Protoplasty poddane fuzji tworzą hetero-kariony (komórki powstałe z połączenia pro-toplastów dwóch różnych gatunków) o różnej proporcji DNA: symetryczne – o jednakowej ilości DNA z protoplastów obu rodziców, asy-metryczne – o różnej ilości DNA z protopla-stów obu rodziców lub cybrydy, zawierające DNA jądrowe z protoplastu jednego z rodzi-ców, a chloroplasty i mitochondria z obu.
Hybrydyzacja somatyczna daje możliwo-ści przeprowadzenia bardzo dużej liczby kombinacji międzygatunkowych niezależnie od stopnia pokrewieństwa, ploidalności i płodności łączonych gatunków. Doskonale-nie metod regeneracji i selekcji mieszańców
somatycznych o pożądanych cechach po-zwala otrzymywać mieszańce w ciągu pół roku od momentu przeprowadzenia fuzji pro-toplastów. Metoda hybrydyzacji somatycznej jest jednak obarczona niedogodnościami, które zostaną omówione poniżej.
Głównymi etapami hybrydyzacji soma-tycznej są: (1) izolacja protoplastów z form rodzicielskich, (2) fuzja protoplastów i selek-cja mieszańców, (3) kultura i regeneraselek-cja mieszańców, (4) weryfikacja mieszańców i analiza dziedziczenia cech (Wielgat, Wasi-lewska 2001). Protoplasty otrzymuje się naj-częściej z miękiszu liści po strawieniu ścian komórkowych odpowiednimi enzymami. Ma-ceracja enzymatyczna jest możliwa jedynie w przypadku roślin z hodowli in vitro na od-powiednich pożywkach. U roślin polowych lub szklarniowych ściany komórkowe nie są podatne na trawienie przy użyciu enzymów w stężeniu nie uszkadzającym samej komór-ki.
Podstawą uzyskiwania regenerantów z pojedynczych komórek somatycznych jest właściwość totipotencji roślin, tzn. możliwość regeneracji całej rośliny z dowolnej, wyod-rębnionej komórki. Stopień totipotencji roślin odmian ziemniaka jest na ogół wyższy w po-równaniu z totipotencją roślin dzikich gatun-ków, np. S. bulbocastanum i S. pinnatisec-tum, przy zastosowaniu tych samych
warun-ków izolacji i regeneracji. W przypadku fuzji międzygatunkowych połączone protoplasty różnych gatunków wytwarzają merystemy, nawet gdy protoplasty jednego z gatunków rodzicielskich nie są do tego zdolne. Brak to-tipotencji ułatwia selekcję mieszańców mię-dzygatunkowych, wykluczając obecność ro-ślin dzikiego gatunku wśród regenerantów.
Względna łatwość otrzymywania i fuzji protoplastów roślinnych nie oznacza auto-matycznie sukcesu w regeneracji roślin mie-szańcowych w warunkach in vitro. Szybkość i skuteczność regeneracji zależy m. in. od ilości i jakości użytych protoplastów, o czym decydują wiek i morfologia roślin rodziciel-skich, oraz od totipotencji ich komórek. Za pośrednictwem fuzji chemicznej lub fuzji w polu elektrycznym (elektrofuzji) można
łą-czyć protoplasty dowolnych, nie spokrewnio-nych gatunków, omijając bariery krzyżowal-ności międzygatunkowej. Jednakże w wielu wypadkach proces regeneracji zatrzymuje się na etapie kilku podziałów heterokarionu lub na etapie nie różnicującego się kalusa (tzn. zespołu komórek powstałych z kolej-nych podziałów heterokarionu). Etap kalusa zwykle decyduje o powodzeniu regeneracji, ponieważ wtedy powstają (lub nie) meryste-my zarodkowe, dające początek pędom, po odcięciu i ukorzenieniu których otrzymujemy regeneranty mieszańcowe, zawierające ge-nomy obydwóch rodziców (fot. 1). Z każdego różnicującego się kalusa zwykle odcina się jeden pęd, z którego po ukorzenieniu i na-mnożeniu powstaje jeden klon.
Fot. 1. Otrzymywanie mieszańców somatycznych. A: heterokarion (strzałka) w 1. dniu po fuzji proto-plastów, powiększenie 500×; B: powstawanie pędu (strzałka) na kalusie w 8. tygodniu po fuzji, po-większenie 4×; C: mieszaniec somatyczny pomiędzy psianką czarną (nie wytwarza bulw) a ziemnia-kiem uprawnym, klon NT-98-119
Wstępnej identyfikacji mieszańców doko-nuje się na podstawie mieszanej morfologii uzyskanych regenerantów (Szczerbakowa i in. 2003b). Udowodnienie mieszańcowości odbywa się na podstawie analizy DNA mie-szańców w porównaniu z DNA form rodzi-cielskich. Opisując pochodzenie zweryfiko-wanych mieszańców somatycznych, stosuje-my symbol „+” pomiędzy formami rodziciel-skimi (P1 + P2), zamiast symbolu „×” (P1 × P2) używanego do oznaczania pochodzenia
mieszańców generatywnych. Względna ła-twość oraz szybkość metody hybrydyzacji somatycznej (regeneranty można otrzymać w ciągu dwóch miesięcy od dnia przeprowa-dzenia fuzji) decydują o jej atrakcyjności w otrzymywaniu mieszańców pomiędzy różny-mi, nawet oddalonymi gatunkami. Atutem mieszańców somatycznych, w porównaniu z generatywnymi, jest posiadanie cytoplazmy pochodzącej od obydwóch rodziców, co może być ważne w przekazywaniu cech
ko-dowanych przez DNA chloroplastowe i mito-chondrialne. Mankamentem zaś jest częścio-wa lub pełna sterylność mieszańców soma-tycznych, wynikająca z odległego pokrewień-stwa form rodzicielskich. Trudności w otrzy-mywaniu generatywnego potomstwa mie-szańców somatycznych ziemniaka są czę-ściowo rekompensowane wegetatywnym rozmnażaniem ziemniaka i możliwością na-mnożenia wartościowego materiału mieszań-cowego poprzez bulwy.
Hybrydyzacja somatyczna dwóch różnych diploidalnych (2x) gatunków ziemniaka zwy-kle prowadzi do powstania mieszańców o różnej ploidalności, zarówno spodziewanych tetraploidów (4x), jak i heksaploidów (6x) oraz rozmaitych aneuploidów, które utraciły od kilku do kilkunastu chromosomów w ciągu wieloetapowego procesu regeneracji proto-plastów. Wśród regenerantów znajdują się również chimery – rośliny odznaczające się mozaikowatością tkanek o różnym pocho-dzeniu i różnej ploidalności.
Selekcja stabilnych mieszańców syme-trycznych i mniej stabilnych, ale wartościo-wych mieszańców asymetrycznych na pod-stawie cytologicznego obrazu chromosomów jest trudna, gdyż chromosomy ziemniaka i spokrewnionych z nim gatunków są bardzo małe i słabo zróżnicowane. Dlatego mie-szańce identyfikuje się za pomocą techniki cytometrii przepływowej, pozwalającej oce-nić ploidalność na podstawie zawartości ją-drowego DNA.
Metoda hybrydyzacji somatycznej zyski-wała coraz większą popularność od końca lat 70. XX wieku. Synteza mieszańców so-matycznych pomiędzy oddalonymi, nie krzy-żującymi się w środowisku naturalnym ga-tunkami wydawała się niezmiernie atrakcyj-nym sposobem korzystania z zasobów geno-wych roślin dzikich dla tworzenia nogeno-wych od-mian roślin uprawnych. Metoda ta, operując komórkami somatycznymi, rozszerza granice krzyżowań międzygatunkowych możliwych do przeprowadzenia metodami genetyki kla-sycznej, wzbogaca germplazmę roślin uprawnych, wykorzystuje zmienność pier-wotną odległych gatunków, nie potrzebuje genów markerowych do selekcji mieszań-ców, nie budzi oporu społecznego i zastrze-żeń etycznych jak w przypadku roślin gene-tycznie modyfikowanych (GMO). Jest
szcze-gólnie przydatna w przekazywaniu do roślin uprawnych, w tym ziemniaka, cech determi-nowanych zarówno przez geny główne, jak i tzw. geny mniejsze, warunkujące cechy ilo-ściowe, np. odporności na niektóre choroby (zaraza ziemniaka) lub czynniki abiotyczne (mróz czy susza). Przykładem może być wprowadzenie do ziemniaka uprawnego trwałej niespecyficznej (horyzontalnej) od-porności na zarazę z meksykańskiego dzi-kiego diploidalnego gatunku S. bulbocasta-num poprzez syntezę płodnego odpornego mieszańca somatycznego, a następnie serię krzyżowań z ziemniakiem uprawnym (Helge-son i in. 1998).
W pracy przeglądowej Wielgat i Wasilew-skiej (2001) zostały podsumowane dane do-tyczące prób międzygatunkowej hybrydyzacji somatycznej ziemniaka wykonanych od koń-ca lat 70. do końkoń-ca lat 90. XX wieku. W cyto-wanych pracach jako źródła odporności na choroby oraz czynniki abiotyczne występują zarówno dzikie gatunki wytwarzające bulwy (S. acaule, S. berthaultii, S. bulbocastanum, S. chacoense, S. circaeifolium, S. commer-sonii, S. papita, S. phureja, S. pinnatisec-tum, S. torvum), jak i gatunki nie wytwarzają-ce bulw (S. brevidens, S. etuberosum, S. ni-grum).
W pierwszych latach XXI wieku ukazały się nowe doniesienia dotyczące syntezy od-pornych na różne choroby międzygatunko-wych mieszańców somatycznych ziemniaka z dzikimi gatunkami. Na przykład odporność na alternariozę z dzikiego diploidalnego ga-tunku S. brevidens wprowadzono do ziem-niaka uprawnego poprzez krzyżowania ge-neratywne pomiędzy wcześniej wyselekcjo-nowanym mieszańcem somatycznym S. tu-berosum (+) S. brevidens (Austin i in. 1986) i odmianami Katahdin oraz Atlantic użytymi jako zapylacze (Tek i in. 2004). Wykorzysty-wanie techniki hybrydyzacji somatycznej w badaniach genetycznych oraz w hodowli ziemniaka uprawnego zostało omówione w pracy przeglądowej Orczyka i innych (2003). Na podstawie obszernie cytowanej literatury światowej autorzy odnotowali szczególne osiągnięcia zastosowania tej metody, m. in. w przypadku introgresji kompleksowej odpor-ności na choroby z dzikiego gatunku S. bre-videns (odporność na wirusy A, X, Y i liścio-zwoju ziemniaka, na mokrą zgniliznę bulw i
zarazę ziemniaka) oraz tolerancji na mróz i zdolności adaptacji do niskiej temperatury z S. commersonii do pokoleń generatywnych międzygatunkowych mieszańców somatycz-nych. Autorzy podkreślili ważność tej metody dla syntezy tetraploidalnych linii ziemniaka hodowlanego z nowymi kombinacjami cech właściwych dla wyjściowych linii di(ha)plo-idalnych.
Niestabilność genetyczna oraz sterylność są głównymi przyczynami ograniczonego wykorzystania mieszańców somatycznych pomiędzy taksonomicznie odległymi gatun-kami Solanum jako źródła nowej zmienności genetycznej w programach hodowlanych ziemniaka. Na przykład w wypadku mieszań-ców S. nigrum (+) S. tuberosum, skrajnie od-pornych na różne szczepy Phytophthora in-festans o szerokim spektrum wirulencji (Zimnoch-Guzowska i in. 2003), krzyżowania generatywne z ziemniakiem uprawnym do-tychczas nie doprowadziły do uzyskania doj-rzałych nasion.
W mieszańcach somatycznych ziemniaka diploidalnego ze spokrewnionymi diploidal-nymi dzikimi gatunkami wytwarzającymi bul-wy (Szczerbakowa i in. 2003a) często jest obserwowane obniżenie odporności na czyn-nik chorobotwórczy w porównaniu z odpor-nością dzikiego gatunku rodzicielskiego. W takich wypadkach krzyżowania generatywne z odpowiednio dobranymi zapylaczami po-winny prowadzić do uzyskania dojrzałych na-sion i otrzymania w potomstwie form o pod-wyższonej odporności.
Podobnie jak krzyżowania generatywne pomiędzy różnymi gatunkami/odmianami ro-ślin powszechne w praktyce hodowlanej krzyżówki somatyczne pozwalają rozszerzyć pulę genową roślin uprawnych, korzystając z naturalnych zasobów genowych mniej lub bardziej spokrewnionych roślin dzikich o ce-chach pożądanych przez hodowców, przede wszystkim ich naturalnej odporności na cho-roby. Szybkie zmiany w populacjach czynni-ków chorobotwórczych w następstwie zmian klimatycznych i cywilizacyjnych, globalny wzrost produkcji żywności i jednoczesny wzrost kosztów ochrony roślin uprawnych przed chorobami, dążenie konsumentów do spożywania zdrowej i bezpiecznej żywności oraz próby ograniczania użycia chemicznych środków ochrony roślin dyktują potrzebę
ko-rzystania z mechanizmów obronnych wy-kształconych przez poszczególne dzikie ga-tunki roślin. Oczywiście, niektóre z tych me-chanizmów prowadzą do wytwarzania związ-ków niekorzystnych w roślinach uprawnych. Jednak zróżnicowany charakter mechani-zmów obronnych pozwala mieć nadzieję na wyodrębnienie bezpiecznych ich składników, które po wprowadzeniu do mieszańców ro-ślin uprawnych będą je skutecznie chronić przed chorobami lub szkodnikami. Synteza i badanie właściwości oddalonych mieszań-ców roślin uprawnych z wykorzystaniem techniki hybrydyzacji somatycznej, przyspie-szającej i upraszczającej tworzenie mieszań-ców, jest jednym z ważnych etapów w po-znawaniu i gromadzeniu wiedzy na temat funkcjonowania i praktycznego wykorzysty-wania naturalnych mechanizmów obronnych roślin.
Literatura
1. Austin S., Ehlenfeldt M. K., Baer M. A., Helgeson J. P. 1986. Somatic hybrids produced by protoplast
fu-sion between Solanum tuberosum and Solanum brevidens: phenotypic variation under field conditions. – Theor. Appl. Genet. 71: 682-690; 2. Helgeson J. P.,
Pohlman J. D., Austin S., Haberlach G. T., Wielgus S. M., Ronis D., Zambolim L., Tooley P., McGrath J. M., James R. V., Stevenson W. R. 1998. Somatic
hy-brids between Solanum bulbocastanum and potato: a new source of resistance to late blight. – Theor. Appl. Genet. 96: 738-742; 3. Orczyk W., Przetakiewicz J.,
Nadolska-Orczyk A. 2003. Somatic hybrids of
Solan-um tuberosSolan-um – application to genetics and breeding. – Plant Cell Tissue Organ Cult. 74: 1-13;
4. Szczerbakowa A., Bołtowicz D., Lebecka R., Ra-domski P., Wielgat B. 2003a. Characteristics of the
interspecific somatic hybrids Solanum pinnatisectum (+) S. tuberosum H-8105. – Acta Physiol. Plant. 27: 317-325; 5. Szczerbakowa A., Borkowska M.,
Wiel-gat B. 2000. Plant regeneration from the protoplasts of
Solanum tuberosum, S. nigrum and S. bulbocastanum. – Acta. Physiol. Plant. 22: 3-10; 6. Szczerbakowa A.,
Maciejewska U., Zimnoch-Guzowska E., Wielgat B. 2003b. Somatic hybrids Solanum nigrum (+) S.
tuberosum: morphological assessment and verification of hybridity. – Plant Cell Rep. 21: 577-584; 7. Tek A.
L., Stevenson W. R., Helgeson J. P., Jiang J. 2004.
Transfer of tuber soft rot and early blight resistances from Solanum brevidens into cultivated potato. – The-or. Appl. Genet. 109: 249-254; 8. Zimnoch-
Maciejew-ska U., Szczerbakowa A., Wielgat B. 2003.
Resist-ance to Phytophthora infestans in somatic hybrids of Solanum nigrum L. and diploid potato. – Theor. Appl. Genet. 107: 43-48; 9. Wielgat B., Wasilewska D.
2001. Hybrydyzacja somatyczna pomiędzy dzikimi i
uprawnymi gatunkami ziemniaka. – Biotechnologia 2: 9-15
