Widok Rola regulacji ekspresji genów w stabilności plazmidów

G

JAGURA-BURDZY

Zak³ad Biochemii Drobnoustrojów Instytut Biochemii i Biofizyki PAN Pawiñskiego 5a, 02-106 Warszawa gjburdzy@ibb.waw.pl

ROLA REGULACJI EKSPRESJI GENÓW W STABILNOŒCI PLAZMIDÓW Plazmidy, czyli niezale¿nie replikuj¹ce siê

pozachromosomalne elementy genetyczne enetyczne wystêpuj¹ w Archea, Eubacteria i Eukaryota. Najlepiej poznano biologiê plazmi-dów u bakterii i tej grupie poœwiêcone bêd¹ ni-niejsze rozwa¿ania. Plazmidy, zgodnie z przy-jêt¹ definicj¹, nie s¹ niezbêdne komórce gospo-darza do przetrwania ale czêsto zwiêkszaj¹ jego zdolnoœci adaptacyjne do zmieniaj¹cych siê warunków œrodowiska. Ekspresja informa-cji genetycznej, któr¹ nios¹ (stanowi¹ca niejed-nokrotnie kilkanaœcie % informacji komórki) mo¿e prowadziæ do obci¹¿enia metabolizmu w takim stopniu, ¿e zmniejszy szansê gospodarza w konkurencji z komórkami bezplazmidowy-mi. Regulacja ekspresji genów plazmidowych decyduje wiêc o sukcesie w rozprzestrzenia-niu siê zarówno w linii pionowej (z pokolenia na pokolenie, ang. vertical inheritance), jak i horyzontalnie (poprzez „infekcjê” nowych ko-mórek, ang. horizontal transfer).

Mówi¹c o plazmidach zwykle wymieniamy cechy fenotypowe o jakie wzbogacaj¹ gospoda-rza: opornoœci na antybiotyki czy metale ciê-¿kie, zdolnoœæ rozk³adu zwi¹zków organicz-nych, wykorzystanie ró¿nych zwi¹zków wêgla, opornoœci na UV itp. Dla biologii plazmidów najistotniejsze s¹ jednak operony odpowiedzial-ne za replikacjê i mechanizmy stabilodpowiedzial-nego dzie-dziczenia stanowi¹ce tzw. szkielet genetyczny

(ang. backbone). Dla wiêkszych plazmidów jest to tak¿e zdolnoœæ zasiedlania nowych gospoda-rzy w wyniku transferu koniugacyjnego (pla-zmidy mobilizowalne czy koniugacyjne). Bada-nia nad transkryptomem plazmidów IncP-1 (Thomas, dane nieopublikowane) wskazuj¹, ¿e spoœród oko³o 60 genów plazmidu RK2 wysoki poziom ekspresji charakteryzuje jedynie opero-ny opornoœci na antybiotyki. Byæ mo¿e jest to regu³a dla genów warunkuj¹cych wymierne ko-rzyœci adaptacyjne, a byæ mo¿e jest oznak¹ nie-dawnego w³¹czenia tych genów do wyciszone-go na drodze ewolucji t³a genetycznewyciszone-go, jakim jest szkielet plazmidowego genomu.

Promotory operonów odpowiedzialnych za replikacjê, stabilne utrzymywanie w komór-kach czy transfer horyzontalny w przewa-¿aj¹cej czêœci nale¿¹ do bardzo silnych sy-gna³ów transkrypcyjnych, z których ekspresja rzadko zachodzi konstytutywnie. Podlegaj¹ one regulacji negatywnej, zapewniaj¹c w ten sposób potencjaln¹ mo¿liwoœæ wysokiego po-ziomu ekspresji genom plazmidowym. Mo¿li-woœæ, która przez wiêkszoœæ cyklu ¿yciowego plazmidu jest jednak niewykorzystana. Induk-cja ekspresji operonów jest rzadko u¿ywanym mechanizmem regulacji transkrypcji, najlepiej poznane przyk³ady dotycz¹ indukcji systemów transferu koniugacyjnego i jeden z przyk³adów bêdzie omówiony szczegó³owo.

REGULACJA PROCESU REPLIKACJI Celem kontroli procesu replikacji

plazmi-du jest utrzymywanie œcis³ej liczby kopii,

opty-malnej dla okreœlonej wielkoœci plazmidu tak, aby z jednej strony nie obni¿yæ zdolnoœci

prze-Numer 3

(256)

¿ycia gospodarza (ang. fitness) a z drugiej stro-ny zabezpieczyæ przekazanie w czasie podzia³u bakterii chocia¿ jednej kopii plazmidu ka¿dej komórce potomnej (DEL SOLAR i wspó³aut. 1998)

Plazmidy wykorzystuj¹ do powielania siê „fabryki replikacyjne” gospodarza. Sygna³ roz-poczêcia replikacji w oriV (ang. origin — punkt startu) plazmidu jest jednak zale¿ny od specy-ficznego Inicjatora kodowanego przez sam pla-zmid: mo¿e to byæ bia³ko (zwane najczêœciej Rep) lub inicjatorowe RNA (np. RNA II w pla-zmidach typu ColE1). Generalnie kontrola ilo-œci kopii plazmidu przebiega na etapie inicjacji replikacji poprzez obni¿anie ekspresji genu rep (ESPINOZA i wspó³aut. 2000). Najprostszy negatywny mechanizm regulacyjny to auto-genna represja. Wyjœciowo wysoki poziom eks-presji ( po podziale komórki i spadku iloœci ko-pii plazmidu czy przejœciu genomu plazmido-wego do biorcy w czasie koniugacji) jest repry-mowany w miarê przybywania produktu, czyli bia³ka Rep. Dla wielu plazmidów wykazano, ¿e bia³ko Rep przyjmuje dwie formy: w postaci monomeru wi¹¿e siê do powtórzonych se-kwencji w oriV zwanych iteronami, aktywuje oriV powoduj¹c „topnienie” dwuniciowej struktury DNA i inicjuje replikacjê, natomiast w postaci dimeru wi¹¿e siê do operatora w re-gionie w³asnego promotora i blokuje tran-skrypcjê (Ryc. 1) (CHATTORAJ2000). W

niektó-rych plazmidach lokalizacja iteronów oriV w regionie promotora rep umo¿liwia pe³nienie ró¿nych funkcji przez tê sam¹ formê bia³ka Rep w zale¿noœci od stê¿enia Rep. Co wiêcej, sam proces replikacji mo¿e indukowaæ produkcjê bia³ka Rep i nowe wydarzenia inicjacyjne po-przez usuwanie represora Rep z miejsc opera-torowych (profag P1) (MUKHOPADHYAY i CHATTORAJ 2000).

Inny mechanizm regulacji ekspresji genu rep równie czêsto wykorzystywany przez pla-zmidy oparty jest na powstawaniu antysensow-nego RNA, które poprzez oddzia³ywanie z mRNArep obni¿a jego trwa³oœæ, powoduje ate-nuacjê, maskuje sygna³y translacyjne lub zwiêk-sza powinowactwo dodatkowych elementów regulacyjnych np. bia³ek represorowych (WAGNER i SIMONS 1994, FRANCH i GERDES 2000). Regulatorowe, antysensowne RNA jest wysoce labilne, jego stê¿enie jest wiêc œciœle proporcjonalne do iloœci kopii plazmidu. Spa-dek iloœci kopii plazmidu, a tym samym regula-torowego RNA, prowadzi do wzmo¿onej synte-zy inicjatora. Najlepiej poznany system replika-cji plazmidów typu ColE1, w których inicjacja replikacji regulowana jest przez antysensowne RNA (RNA I) nie zale¿y od bia³ka inicjatorowe-go Rep: inicjatorem replikacji jest tu transkrypt tzw. RNA II. Jego prawid³owe zwiniêcie siê i od-dzia³ywanie z DNA w regionie oriV jest sy-gna³em do wkroczenia RNazyH i PolI DNA oraz rozpoczêcia replikacji plazmidu. Tworzenie dwuniciowych struktur miêdzy RNA II i kom-plementarnym do niego RNA I uniemo¿liwia tworzenie hybrydu RNAII-DNA i blokuje repli-kacjê.

Negatywna kontrola oparta na dzia³aniu re-presorów, produktów niezale¿nych operonów wydaje siê najrzadziej stosowanym sposobem regulacji ekspresji genu rep. W takich

przypad-kach sensorem iloœci kopii plazmidu staje siê element niezale¿ny od samego procesu repli-kacji. Interesuj¹cym przyk³adem s¹ tu plazmidy IncP-1, w których ekspresja genu trfA (czyli rep) jest regulowana przez przynajmniej trzy globalne represory KorA, IncC i KorB, produk-ty tzw centralnego operonu kontroli korAincC-korB (PANSEGRAU i wspó³aut. 1994).

Ryc. 1. Autogenna regulacja genu rep.

Bia³ko Rep w postaci monomeru wi¹¿e siê z iteronami (powtórzone miejsca wi¹zania Rep) w regionie oriV i ini-cjuje replikacjê. W postaci dimeru rozpoznaje operator w regionie w³asnego promotora i blokuje transkrypcjê.

Rozwój badañ nad replikacj¹ plazmidów wyraŸnie wskazuje, ¿e proste mechanizmy kontroli, chocia¿ skuteczne, ustêpuj¹ miejsca kombinacji ró¿nych mechanizmów:

autogen-nej regulacji i regulacji przy udziale antysen-sownego RNA czy antysenantysen-sownego RNA i do-datkowych bia³ek represorowych (DELSOLARi ESPINOZA 2000).

REGULACJA EKSPRESJI OPERONÓW ODPOWIEDZIALNYCH ZA STABILNE DZIEDZICZENIE PLAZMIDÓW

Plazmidy rozprzestrzeniaj¹ siê czynnie w populacji gospodarza dwoma sposobami: prze-kazywane s¹ do potomstwa w czasie podzia³u komórki albo na drodze koniugacji/mobilizacji „infekuj¹” bezplazmidowego dotychczas bior-cê. Replikacja zapewnia w³aœciw¹ iloœæ kopii plazmidu na komórkê zwiêkszaj¹c szansê prze-trwania, a kodowane przez plazmidy systemy mrs (ang. multimer resolution systems) maksy-malizuj¹ iloœæ kopii separuj¹c powstaj¹ce dime-ry/multimery. Podczas gdy ma³e plazmidy o du-¿ej iloœci kopii bazuj¹ na losowej segregacji cz¹steczek do komórek potomnych, du¿e pla-zmidy o niskiej liczbie kopii (1–2 na komórkê) aktywnie pomagaj¹ losowi stosuj¹c powszech-nie dwa mechanizmy: aktywnego rozdzia³u (ang. active aprtitioning) i niszczenia w popula-cji tych bakterii, które przypadkowo straci³y plazmid (ang. postsegregational killing, psk) (GERDESi wspó³aut. 2000a). Genomika plazmi-dów dostarcza dowoplazmi-dów na „mobilnoœæ” tych mechanizmów miêdzy ró¿nymi plazmidami. Jest to mo¿liwe m.in. dziêki temu, ¿e s¹ kodowa-ne przez zamkniête, samoregulowalkodowa-ne jednost-ki transkrypcyjne, nazywane czêsto „kasetami”.

Systemy aktywnego rozdzia³u to operony sk³adaj¹ce siê najczêœciej z dwóch genów parA i parB i z miejsca centromero-podobnego parS (przez analogiê do systemów eukariotycznych) (GERDES i wspó³aut. 2000b). W uproszczeniu aktywny rozdzia³ przebiega nastêpuj¹co: bia³ko typu B rozpoznaje i wi¹¿e parS, tworzy pary pla-zmidów, które nastêpnie s¹ aktywnie separowa-ne przy udziale aktywnoœci ATPazowej bia³ka ParA i cz¹steczki plazmidów kierowane s¹ do przeciwnych biegunów komórki w czasie jej podzia³u. Istniej¹ dwa g³ówne typy systemów aktywnego rozdzia³u oparte na budowie bia³ko-wych sk³adników, lokalizacji centromeru i regu-lacji ekspresji. W przypadku pierwszym iloœæ bia³ka typu ParA (ATPaza z motywami Walkera) jest limitowana (tak samo jak bia³ka ParB). Bia³ko ParA jest autogennym represorem ope-ronu parAparB i w tej funkcji jest wspomagane przez ParB lub bia³ko ParB jest autorepresorem wi¹¿¹c siê do centromeru w rejonie promotora i w tej funkcji wspomagane jest przez ParA (Ryc. 2A, B). Zaburzenia relatywnych iloœci obu sk³ad-ników prowadz¹ do gwa³townej utraty (destabi-lizacji) plazmidu. W przypadku plazmidu R1

Ryc. 2. Autoregulacja operonów aktywnego rozdzia³u.

Dwa modele autoregulacji s¹ przedstawione schematycznie: (A) g³ównym represorem jest ParA a ParB stabilizu-je kompleksy ParA-DNA, centromer (miejsce oddzia³ywania ParB z DNA) wystêpustabilizu-je bezpoœrednio za operonem lub w odleg³ych miejscach; (B) lokalizacja centromeru pokrywa siê z promotorem operonu parAB i dziêki temu ParB pe³ni równoczeœnie dwie funkcje — autorepresora i bia³ka podzia³owego.

(typ II) funkcjê autorepresora pe³ni bia³ko ParR (homolog ParB), którego iloœæ w komórce wy-nosi oko³o 1000 cz¹steczek. Nie jest to skutecz-na autorepresja poniewa¿ poziom pierwszego produktu operonu ParM (aktynopodobnej AT-Pazy) wynosi oko³o 15000 monomerów (MOLLER-JENSEN i wspó³aut. 2002). Ró¿nice w ekspresji obydwu genów wynikaj¹ z inhibicji translacji parB z policistronowego mRNA (ang. translation coupling). ParM oddzia³ywuje z kompleksem parS-ParR i polimeryzuj¹c tworzy dynamicznie aktywne d³ugie struktury sepa-ruj¹ce przestrzennie cz¹steczki plazmidu do biegunów- jest to pierwszy przyk³ad analoga wrzeciona podzia³owego u bakterii. Z punktu widzenia regulacyjnego jest to te¿ wyj¹tek od klasycznej regu³y „wyciszania” ekspresji genów plazmidowych.

Systemy posegregacyjnego zabijania psk, mimo swojej ró¿norodnoœci i

wyspecjalizowa-nia w dzia³aniu na ró¿ne „cele” w komórce, ba-zuj¹ na ró¿nicach w stabilnoœci toksyny i od-trutki (GERDES i wspó³aut. 2000a). W opero-nach psk, które koduj¹ dwa bia³kowe sk³adniki albo sama odtrutka albo w kompleksie z tru-cizn¹ odpowiada za autoregulacjê. W niektó-rych plazmidach jak np. pSM19035 z grupy inc18 w operonie trucizny (z) i odtrutki (e) po-jawia siê niezale¿ny regulator omega, sk³adnik tego samego operonu (w-e-z), który pe³ni funk-cjê autorepresora (Ryc. 3) (DE LA HOZ i wspó³aut. 2000). W systemach gdzie odtrutk¹ jest antysensowne niestabilne RNA (np. hok/sok w plazmidzie R1) transkrypcja zacho-dzi konstytutywnie, a regulacja ekspresji jest posttranskrypcyjna. Mechanizm hok/sok by³ pierwszym szczegó³owo poznanym mechani-zmem potranskrypcyjnej regulacji ekspresji genów przy zastosowaniu antysensownego RNA (THISTED i wspó³aut. 1995).

REGULACJA EKSPRESJI OPERONÓW TRANSFERU KONIUGACYJNEGO Transfer koniugacyjny plazmidów jest

jed-nym z najistotniejszych procesów w horyzon-talnym rozprzestrzenianiu siê genów w biosfe-rze (ZECHNER i wspólaut. 2000). Generalnie proces koniugacji sk³ada siê z dwóch etapów:

(i) przygotowania DNA plazmidu do trans-feru tzw funkcje Dtr (ang. DNA transfer and re-plication);

(ii) zbudowania mostu koniugacyjnego miêdzy biorc¹ i dawc¹ (agregaty koniugacyjne u bakterii Gram dodatnich czy kontakt przy udziale pilusa u bakterii Gram-ujemnych) czyli funkcje Mpf (ang. mating pair formation).

Kompleksy bia³kowe bior¹ce udzia³ w tych dwóch etapach s¹ kodowane w du¿ych jed-nostkach transkrypcyjnych, przestrzennie roz-dzielonych. Podczas gdy funkcje Dtr s¹ plazmi-dowo-specyficzne (kompleks relaksazy rozpo-znaje i nacina jedn¹ niæ tylko w oriT w³asnego plazmidu), funkcje Mpf plazmidów z bakterii Gram-ujemnych czêsto wykorzystywane s¹ do transportu przez inne plazmidy obecne w ko-mórce bakterii (plazmidy mobilizowalne). Funkcje Dtr razem z Mpf zajmuj¹ od 20–40kb, stanowi¹ oko³o 50% informacji genetycznej plazmidów koniugacyjnych, nic wiêc dziwne-go, ¿e ich ekspresja musi byæ œciœle kontrolo-wana.

Wœród plazmidów koniugacyjnych rozró¿-niamy takie, które czekaj¹ na sygna³ do koniu-gacji utrzymuj¹c funkcje Dtr/Mpf w stanie

„utajnionym” i takie, które s¹ w ci¹g³ej gotowo-œci do transferu chocia¿ jest to gotowoœæ na mi-nimalnym poziomie (ZATYKAi THOMAS1998). Najlepiej poznanym (i najwczeœniej odkrytym) jest system koniugacyjny plazmidu F (i plazmi-dów pochodnych R1 czy R100) zakodowany w oko³o 40 genach regionu tra. Oko³o po³owa bia³ek Tra uczestniczy w syntezie piliny i budo-wie F-pilusa. Region tra znajduje siê za oriT i sk³ada siê z trzech jednostek transkrypcyjnych, dwóch mono traM, traJ i jednego multicistro-nowego operonu traY. TraJ jest aktywatorem promotora traY. Ekspresja traJp jest z kolei mo-dulowana przez mRNAfinP (antysensowne RNA, negatywny efektor translacji TraJ) i bia³ko FinO, produkt ostatniego genu operonu traY (stabilizator dupleksu mRNAfinP-m-RNAtraJ). Dzia³anie FinOP (ang. fertility inhi-bition) skutecznie wy³¹cza gen traJ i tym sa-mym operon traY, jedynie oko³o 0.1% komó-rek w populacji gospodarza R1 czy R100 jest zdolna do transferu. Dziêki mutacji insercyjnej IS3 w genie finO prowadz¹cej do czêœciowej derepresji traJp populacja gospodarza plazmi-du F jest w 100% zdolna do transferu i to sprzy-ja³o odkryciu zjawiska koniugacji u bakterii i skorelowania go z wystêpowaniem plazmidu F (LEDERBERG i TATUM 1946).

Plazmidy IncP-1 s¹ plazmidami o bardzo szerokim spektrum gospodarzy — mog¹ siê re-plikowaæ i stabilnie utrzymywaæ we

wszyst-kich badanych bakteriach Gram-ujemnych (PANSEGRAUi wspó³aut. 1994). Ich system ko-niugacyjny ma jeszcze szerszy zasiêg: plazmidy IncP-1 mog¹ byæ przenoszone koniugacyjnie do bakterii Gram-dodatnich i komórek euka-riotycznych (HEINEMANN i SPRAGUE 1989). Funkcje Dtr zakodowane s¹ w regionie tra (Tra1) w dwóch jednostkach transkrypcyjnych traJIHGFEDCBA i traKLM, których przeciwnie

skierowane promotory obejmuj¹ oriT (miejsce inicjacji transferu koniugacyjnego). Kompleks relaksazy TraJ/TraI/TraK wi¹¿¹c siê do oriT i wprowadzaj¹c jednoniciowe naciêcie jedno-czeœnie pe³ni funkcjê autoregulatora obydwu promotorów. Drugi multicistronowy operon trb (Tra2) koduje funkcje Mpf. Produktem pierwszego genu tego operonu — trbA jest bia³ko represorowe, które jest g³ównym

regula-Ryc. 4. Regulacja ekspresji operonów transferu koniugacyjnego w plazmidzie pTiC58 z A.

tumefa-ciens.

OccR i TraR s¹ aktywatorami transkrypcji, do swojej funkcji wymagaj¹ niskocz¹steczkowych kofaktorów — spe-cyficznych opin, produktu uszkodzonych komórek roœlinnych (OccR) i pochodnej laktonu homoseryny AAI (TraR). Ekspresja traR jest zale¿na od kompleksu OccR-opiny. Autoinduktor AAI jest produktem syntazy TraI. Ni-ski poziom podstawowy AAI jest niewystarczaj¹cy do aktywacji TraR ale wzrasta wraz ze wzrostem liczby komó-rek-dawców (gêstoœci¹ populacji). Przekroczenie poziomu progowego indukuje kaskadê wydarzeñ transkrypcyj-nych poprzez autoindukcjê traI i traR. Wi¹zanie TraR-AAI w regionie promotora traItrb indukuje transkrypcjê równie¿ z przeciwnie skierowanego promotora operonu repABC odpowiedzialnego za replikacjê wegetatywn¹ i aktywny rozdzia³ plazmidów.

Ryc. 3. Regulon Omega w plazmidzie pSM19035 (inc18).

Represor Omega (w) rozpoznaje krótkie sekwencje nukleotydów wystepuj¹ce jako bezpoœrednie lub odwróco-ne powtórzenia w promotorach copS (determinuj¹cego iloœæ kopii plazmidu),d, koduj¹cego homolog ParA i w-e-z koduj¹cego system stabilizacyjny typu psk.

torem promotorów tra i trb (ZATYKA i wspó³aut.1994). Ekspresja operonu trb jest re-gulowana tak¿e przez globalny regulator KorB (nastêpny rozdzia³) dziêki temu ekspresja ope-ronów transferu koniugacyjnego jest sprzê-¿ona z ekspresj¹ pozosta³ych operonów pla-zmidu. Gospodarze plazmidów IncP-1 s¹ w ci¹g³ej gotowoœci do transferu koniugacyjne-go. Synteza piliny i zbudowanie pilusa zacho-dzi natychmiast po zasiedleniu nowego gospo-darza. Jedna z nici DNA w obrêbie oriT plazmi-du jest naciêta i tylko oddzia³ywanie relaksazy z oriT zapobiega relaksacji cz¹steczki DNA. Kon-takt z potencjalnym biorc¹ jest wiêc natych-miast uwieñczony rozpoczêciem replikacji ko-niugacyjnej i transferem jednej nici do biorcy.

Inny bardzo ciekawy system koniugacyjny, o którym nale¿a³oby wspomnieæ jest reprezen-towany przez plazmidy Ti z Agrobacterium tu-mefaciens (ZECHNERi wspó³aut. 2000). Plazmi-dy Ti koduj¹ dwa systemy koniugacyjne: pierw-szy, sk³adaj¹cy siê z kilku multicistronowych operonów vir umo¿liwiaj¹cy transfer oko³o 20kb T-DNA do komórek roœlinnych i drugi, czterooperonowy tra/trb odpowiedzialny za koniugacjê miêdzy komórkami bakterii. Do in-dukcji ekspresji operonów virA,virB,virD i virG potrzebne s¹ sygna³y z uszkodzonych ko-mórek roœlinnych. Aktywacja ekspresji regulo-nu vir zale¿y od VirA i VirG, bia³ek nale¿¹cych do dwu sk³adnikowego systemu regulacyjne-go. Do ekspresji genów tra/trb wymagana jest kombinacja sygna³ów z komórek roœlinnych i

informacji o gêstoœci populacji dawcy (ang. qu-orum sensing). Pierwszym genem dwunasto-genowego operonu trb jest traI koduj¹cy syn-tazê autoinduktora AAI (ang. N-3-oxo-o-canoyl-L-homoserine lactone) (Ryc. 4). Autoin-duktor AAI jest kofaktorem bia³ka TraR, akty-watora transkrypcji operonów traAFB, tra-CDG, traM, trb i occ. Indukcja ekspresji tra/trb przebiega dwu etapowo: specyficzne opiny produkowane przez uszkodzone komórki ro-œlinne w po³¹czeniu z bia³kami regulatorowy-mi (np. OccR w pTiR10) aktywuj¹ transkrypcjê operonu occ i produkcjê TraR (traR ostatni gen operonu occ). Niski podstawowy poziom syn-tezy induktora AAI przez TraI jest jednak nie-wystarczaj¹cy do aktywacji TraR, dopiero wzrost gêstoœci populacji dawcy i addytywny efekt induktora AAI jest w stanie zmieniæ kon-formacjê bia³ka TraR na aktywator transkryp-cyjny m.in. dla w³asnego operonu a tak¿e ope-ronu trb i tym samym traI.

System koniugacyjny indukowany nie gê-stoœci¹ populacji dawcy, ale obecnoœci¹ w od-powiednim stê¿eniu potencjalnych biorców reprezentuj¹ plazmidy z bakterii Enterococcus faecalis np. pAD1 czy pCF10. Bakterie wydzie-laj¹ niskocz¹steczkowe feromony specyficzne w stosunku do okreœlonego dawcy (gospoda-rza plazmidu), które osi¹gaj¹c progowe stê¿e-nie indukuj¹ syntezê substancji agregacyjnej u dawcy i ekspresjê operonów koniugacyjnych tego plazmidu. Bez obecnoœci feromonu ope-rony te podlegaj¹ œcis³ej negatywnej kontroli.

GLOBALNA REGULACJA — SYSTEMY KOORDYNUJ¥CE WSZYSTKIE PROCESY ¯YCIOWE PLAZMIDU

W cyklu ¿yciowym plazmidu poszczególne procesy wymagaj¹ sekwencji wydarzeñ tran-skrypcyjno-translacyjnych czyli derepresji ko-lejnych operonów. Najwa¿niejszym jednak aspektem regulacyjnym wydaje siê byæ skoor-dynowana represja wszystkich funkcji plazmi-dowych tak, aby gospodarz nie przegra³ walki o prze¿ycie i umo¿liwi³ plazmidom dalsze roz-przestrzenianie siê w populacji. Koordynacja ró¿nych funkcji plazmidu mo¿e byæ wynikiem organizacji genów w operony np. w plazmi-dach typu RepABC autoregulowane operony repABC, które koduj¹ bia³ko RepC (niezbêdne do inicjacji replikacjji) koduj¹ równie¿ dwa bia³ka odpowiedzialne za aktywny rozdzia³ ko-pii plazmidu do komórek potomnych: RepAB (RAMIREZ-ROMERO i wspólaut. 2000). Innym

przyk³adem organizacji przestrzennej u³atwiaj¹cej koordynacjê ekspresji jest wystê-powanie regionów promotorowych ini-cjuj¹cych transkrypcjê w przeciwnych kierun-kach (ang. divergent promoters) ze wspólnymi miejscami wi¹zania dla efektorów. Takie pro-motory najczêœciej wystêpuj¹ miêdzy operona-mi uczestnicz¹cyoperona-mi w tym samym procesie (operony Dtr w plazmidach IncP-1 czy IncN) (ZECHNERi wspó³aut. 2000), ale równie¿ miê-dzy operonami np replikacji wegetatywnej i operonami transferu koniugacyjnego (pTi58, IncP-1 czy IncP-9) (LI i FARRAND 2000, JAGURA-BURDZY i THOMAS 1994, GREATED i wspó³aut. 2000). Tutaj ciekawym przyk³adem mo¿e byæ wspomniany ju¿ plazmid pTiC58 (Ryc. 4), w którym indukcja za pomoc¹

sy-gna³ów z uszkodzonych komórek roœlinnych, w po³¹czeniu z sygna³em gêstoœci populacji ko-mórek z plazmidem, indukuje system transferu koniugacyjnego (LI i FARRAND 2000). Kom-pleks TraR-AAI wi¹¿¹c siê w regionie przeciw-nie skierowanych promotorów trb i repABC in-dukuje równie¿ operon aktywnego rozdzia³u i replikacji wegetatywnej plazmidu.

Plazmidy IncP-1 przez wiele lat reprezen-towa³y jedyny w swoim rodzaju majstersztyk regulacyjny (PANSEGRAU i wspó³aut. 1994, THORSTEDi wspó³aut. 1998). Ich system regu-lacyjny charakteryzuje siê ogromn¹ z³o¿ono-œci¹. Niew¹tpliwie najbardziej uderzaj¹c¹ cech¹ tego systemu jest istnienie centralnego operonu kontroli korAB(FG)incC (ang. cco-central control operon) koduj¹cego trzy globalne bia³ka regulatorowe: KorA, KorB i IncC (spoœród piêciu do tej pory dok³adnie scharakteryzowanych w plazmidach IncP-1) (Ryc. 5). Bia³ka te determinuj¹ istnienie tzw regulonów — grup operonów kontrolowa-nych przez ten sam globalny regulator. Dodat-kowo wiele operonów na plazmidzie podlega autogennej represji. Istnienie regulonów nak³adaj¹cych siê na siebie i na lokalne obwo-dy autoregulacyjne sprawia, ¿e ka¿obwo-dy promo-tor jest reprymowany przez przynajmniej dwa represory a niektóre z nich jak trfAp czy kfrAp przez piêæ czy szeœæ (Ryc. 6). Zachodz¹ce na siebie sytemy regulacyjne (ang. multivalent regulatory network) zapewniaj¹ bardzo œcis³¹ kontrolê promotorów, które zwykle maj¹ se-kwencje zbli¿one do consensus i bardzo wyso-ki poziom ekspresji. Istnienie takich nak³adaj¹cych siê obwodów regulacyjnych to z pewnoœci¹ doskona³y mechanizm bufo-ruj¹cy — uszkodzenie jednego z nich nie pro-wadzi do „ucieczki” promotora spod kontroli. Wreszcie wiele spoœród regulatorów wydaje siê dzia³aæ kooperacyjnie: niezale¿nie dzia³aj¹c obni¿aj¹ poziom ekspresji promoto-ra kilka promoto-razy a dzia³aj¹c wspólnie nawet kilka-set razy. Przez wiele lat uwa¿ano, ¿e posiada-nie przez IncP-1 tak silnych promotorów (posiada-nie- (nie-klonowalnych w nieobecnoœci represorów) jest niezbêdnym warunkiem ekspresji opero-nów w ró¿nych gospodarzach — jak wspo-mniano plazmidy IncP-1 mog¹ siê replikowaæ we wszystkich bakteriach Gram-ujemnych. Byæ mo¿e jest to prawd¹, ale badania ekspresji genów plazmidowych w rozmaitych gospoda-rzach nie wykaza³y a¿ tak wielkich ró¿nic w powinowactwie RNA polimeraz do sekwencji tych promotorów.

W przypadku najlepiej zbadanego systemu regulacyjnego plazmidu RK2 (IncP-1a) global-ny regulator KorC (85 aminokwasów, aa) kon-troluje ekspresjê trzech operonów uczest-nicz¹cych w stabilizacji plazmidu poprzez re-presjê promotorów: klcA, kleA i kleC (Ryc. 5). Sekwencja palindromowa rozpoznawana przez KorC (OC) 5’TAGGGCATAATGCCCTA3’ pokrywa siê z sekwencj¹ –10 promotorów i KorC jest dla tych promotorów nadrzêdnym represorem.

KorA (101aa) reguluje siedem operonów m.in. trzy regulowane przez KorC a tak¿e inne odpowiedzialne za stabilne dziedziczenie kla-ABC, kfrAupf54.8upf54.4, korABincCkorFG i wegetatywn¹ replikacjê (ssbtrfA). KorA rozpo-znaje palindrom (O_A) 5’TTTAGCTAAA3’, który albo zachodzi na sekwencjê –10 promotorów (klaAp, korAp i trfAp) albo poprzedza sekwen-cjê –35 (klcAp, kleAp, kleCp, kfrAp). W pierw-szej grupie promotorów „bezb³êdny” palin-drom jest 12 nukleotydowy, powiêkszony o skrajne 5’G i 3’C. W przypadku OA wystê-puj¹cych w pobli¿u –35 tylko w kfrAp jest 12 nukleotydowy palindrom ale z wewnêtrznym b³êdem (ang. mismatch). Badania hierarchii wi¹zania KorA do operatorów wykaza³y 10-kr-otne wiêksze powinowactwo bia³ka do 12 per-fekcyjnego palindromu ni¿ do 10 nukleotydo-wego lub 12 z „b³êdem” (JAGURA-BURDZY i THOMAS 1995). Badania te wykaza³y równie¿, ¿e dodatkowe sekwencje poprzedzaj¹ce palin-drom moduluj¹ powinowactwo represora. Po-dzielono wiêc miejsca O_Ana dwie klasy w zale-¿noœci od si³y wi¹zania KorA. Odzia³ywuj¹c z klas¹ pierwsz¹ O_A(wi¹zanie w obrêbie consen-sus –10) KorA jest g³ównym represorem dla da-nego promotora, oddzia³ywania z klas¹ drug¹ s¹ s³absze i dla takich promotorów KorA jest drugorzêdnym represorem. Poniewa¿ stê¿enie KorA w komórkach podlega fluktuacjom taka hierarchia wi¹zania zapewnia hierarchiê re-presji/derepresji poszczególnych operonów. Unikalna i interesuj¹ca jest funkcja KorA w re-gionie pomiêdzy operonami ssbtrfA (wegeta-tywna replikacja) a trb (transfer koniugacyjny — funkcje Mpf) (JAGURA-BURDZY i THOMAS 1994). Wi¹¿¹c siê do pojedynczego operatora OA pomiêdzy przeciwnie skierowanymi za-chodz¹cymi na siebie promotorami trfAp i trbAp (ang. face to face divergent promoters) KorA hamuje wegetatywn¹ replikacjê i jedno-czeœnie podnosi poziom ekspresji trbA duj¹cego represor wszystkich operonów ko-niugacyjnych. Nie dzia³a jednak jako

bezœredni aktywator transkrypcji trbAp tylko po-œrednio uniemo¿liwiaj¹c RNAP tworzenie otwartych kompleksów (izomeryzacjê) w se-kwencji –10 trfAp u³atwia cz¹steczkom RNAP pod¹¿aj¹cym po przeciwnej nici od trbAp elon-gacjê w kierunku genu struktury trbA.

TrbA jak wspomniano jest podstawowym represorem operonów transferu koniugacyj-nego (ZATYKAi wspó³aut.1994). Bia³ko jest sto-sunkowo ma³e (121 aa) z tego 35 C-koñcowych

aminokwasów jest œciœle zakonserwowane miêdzy KorA i TrbA. TrbA jako jedyny spoœród globalnych regulatorów plazmidów IncP-1 przez d³ugi czas nie mia³ zidentyfikowanego miejsca wi¹zania poniewa¿ jego operator OTw przeciwieñstwie do O_A, O_Cczy O_Bw ¿adnej z lokalizacji nie jest perfekcyjnym palindromem. Badania w grupie C. M.THOMAS(dane nieopu-blikowane) wykaza³y, ¿e zast¹pienie w plazmi-dzie RK2 palindromu OTz b³êdem przez palin-Ryc. 5. Centralny operon kontroli plazmidu RK2 (IncP-1a).

KorA jest zakodowane w 5’ koñcu genu incC w innej ramce odczytu. Gen incC koduje dwie ró¿nej d³ugoœci for-my IncC, z których d³u¿sza ma w³aœciwoœci regulatorowe a krótsza jest wystarczaj¹ca do uczestnictwa w aktyw-nym rozdziale kopii plazmidu. korF i korG nie s¹ zakonserwowane w podgrupie IncP-1b, ich rola jako global-nych regulatorów wymaga potwierdzenia. OAi OBreprezentuj¹ miejsca wi¹zania dla KorA i KorB w promotorze.

Ryc. 6. Genom RK2 (IncP-1a) z zaznaczonymi miejscami oddzia³ywañ piêciu globalnych regulatorów: KorA, KorB, IncC, KorC i TrbA.

Na mapie zaznaczono: funkcje replikacji wegetatywnej jako oriV i trfA, determinanty opornoœci na tetracyklinê (TcR_{), penicylinê (Pn}R_{) i kanamycynê (Kn}R_{), region par/mrs koduj¹cy system psk i mrs, region par/cco czyli}

cen-tralny operon kontroli bior¹cy udzia³ w aktywnym rozdziale kopii plazmidu oraz dodatkowe funkcje stabilizacyj-ne — kla, klc i kle.

drom perfekcyjny powoduje kilkusetkrotne obni¿enie zdolnoœci takiego wariantu RK2 do transferu koniugacyjnego. B³êdy nagromadzo-ne wiêc zosta³y prawdopodobnie celowo na drodze ewolucji aby utrzymaæ ekspresjê repry-mowanych przez TrbA operonów na stosunko-wo wysokim poziomie. Jednak TrbA nie jest re-presorem daj¹cym odpowiedŸ wszystko albo nic, wspó³czynnik represji przy nadprodukcji TrbA waha siê od 3 do10 razy trudno wiêc by³o zrozumieæ koniecznoœæ obni¿ania i tak s³abej represji poprzez nagromadzanie mutacji w miejscu wi¹zania. Dopiero badania nad ostat-nim na liœcie globalnym regulatorem KorB zdaj¹ siê wyjaœniaæ ten paradoks.

KorB jest najwiêkszym bia³kiem spoœród re-presorów IncP-1, sk³ada siê z 358 aminokwa-sów. Tworzy dimery, tetramery i kompleksy wy¿szego rzêdu (WILLIAMSi wspó³aut. 1993). W formie dimerycznej rozpoznaje 13 nukleoty-dowy palindrom OB5’TTTAGC(G/C)GCTAAA3’, który w niektórych przypadkach zawiera do-datkow¹ parê 5’G-3’C odpowiedzialn¹ za zwiê-kszone powinowactwo KorB (KOSTELIDOU i THOMAS2000). O_Bwystêpuje 12 razy w geno-mie RK2 ale tylko dla 6 geno-miejsc wykazano rolê regulacyjn¹ KorB jako represora transkrypcji. W zale¿noœci od lokalizacji wzglêdem sekwen-cji promotorowych podzielono OBna trzy kla-sy. Klasa pierwsza to miejsca znajduj¹ce siê w pobli¿u sekwencji –35 (trfAp, korAp i klaAp). Promotory te powsta³y prawdopodobnie wskutek duplikacji poniewa¿ nie tylko œciœle zakonserwowane s¹ ich istotne czêœci (se-kwencje –35, –10), ale równie¿ lokalizacja miejsc wi¹zania O_Ai O_Bwzglêdem promotora i wzglêdem siebie (33 nukleotydów miêdzy cen-trami symetrii palindromów). Represja tych trzech promotorów przez KorB okreœlana jako „proksymalna” zachodzi poprzez bezpoœred-nie oddzia³ywabezpoœred-nie z RNAP zwi¹zan¹ z promo-torem i jej „uwiêzienie” (ang. RNAP arrest) i nie wymaga dimeryzacji KorB ani obecnoœci C-ter-minalnych 100aa. Klasa druga O_B to miejsca wystêpuj¹ce w pewnym oddaleniu od promo-tora od 100nt poni¿ej miejsca startu transkryp-cji (trbAp) do oko³o 200nt powy¿ej tego miej-sca (kfrAp, kleAp, trbBp). Represja tych promo-torów okreœlana jest mianem „represji na dy-stans” i wymaga obecnoœci domeny dimeryza-cyjnej/tetrameryzacyjnej w KorB (JAGURA -BURDZY i wspó³aut. 1999a). Wreszcie trzecia klasa to miejsca O_Boddalone oko³o 1kb od zna-nego promotora; dotychczas nie wykazano dla nich funkcji regulacyjnej. Spoœród szeœciu

miejsc tej klasy cztery s¹ równomiernie roz-mieszczone w operonach tra i trb, jedno w re-gionie stabilizacyjnym par/mrs i jedno (o suge-rowanej funkcji centromeru, WILLIAMS i wspó³aut. 1998) miêdzy genami o nieznanej funkcji (upf54.4-upf54.8). Hierarchia wi¹zania KorB do operatorów wskazuje najwiêksze po-winowactwo do trfAp, najs³absze do OBz klasy trzeciej. KorB jest znacznie s³abszym represo-rem ni¿ KorA ale ma wiêksze spektrum dzia³ania: reprymuje operony uczestnicz¹ce w wegetatywnej replikacji, transferze koniuga-cyjnym i stabilnym dziedziczeniu. Koordynuje wiêc wszystkie procesy ¿yciowe plazmidu. Wa-¿nym aspektem, który nale¿y podkreœliæ jest kooperatywne oddzia³ywanie KorB z innymi globalnymi regulatorami: KorA i TrbA. Od-dzia³ywania te zale¿¹ od N-koñca KorB i zakon-serwowanego (85% homologii) C-koñca KorA i TrbA (KOSTELIDOUi wspó³aut. 1999, ZATYKAi wspó³aut. 2001). I w³aœnie te oddzia³ywania ko-operacyjne mog¹ odgrywaæ tak istotn¹ rolê w regulacji ekspresji genów: nieznaczne fluktu-acje w poziomie jednego z kooperantów, nie-wielkie zmiany w jego strukturze i w powino-wactwie do operatora s¹ potêgowane w sygna-le koñcowym, kooperacyjnym.

Wi¹zanie KorB do OB jest stabilizowane obecnoœci¹ innego globalnego regulatora, pro-duktu centralnego operonu kontroli cco: IncC-1, chocia¿ IncC nie wi¹¿e siê do DNA bez-poœrednio (JAGURA-BURDZY i wspó³aut. 1999b). IncC i KorB nale¿¹ odpowiednio do rodzin bia³ek ParA i ParB i pe³ni¹ istotn¹ funk-cjê w stabilnym dziedziczeniu plazmidów IncP-1 stanowi¹c ich system aktywnego roz-dzia³u kopii plazmidów do komórek potom-nych (MOTALLEBI- VESHAREHi wspó³aut. 1990). Fakt, ¿e obydwa bia³ka pe³ni¹ jednoczeœnie rolê globalnych regulatorów przez wiele lat by³ unikalnym wœród plazmidów przyk³adem kon-centracji funkcji (sugerowano równie¿ rolê KorB w przestrzennym upakowaniu DNA).

Ostatnio wykazano, ¿e bia³ko Omega z pSM19035 (bakterie Gram-dodatnie) jest glo-balnym regulatorem funkcji replikacyjnych/ ilo-œci kopii plazmidu (copS), funkcji stabilizacyj-nych (operon posegregacyjnego zabijania:epsi-lon/zeta) i operonu delta i byæ mo¿e jest rów-nie¿ sk³adnikiem aparatu aktywnego rozdzia³u (DELAHOZi wspó³aut. 2000) (Ryc. 3). Plazmidy IncP-1 ze swoim z³o¿onym systemem regulacyj-nym nie s¹ wiêc mo¿e wcale unikalne, a koordy-nacja ró¿nych funkcji plazmidu jest zjawiskiem bardziej uniwersalnym ni¿ myœlano.

PODSUMOWANIE Organizacja przestrzenna w du¿e

jednost-ki transkrypcyjne zapewnia mo¿liwoœæ koor-dynacji ekspresji genów uczestnicz¹cych w tym samym procesie. U³o¿enie tych jednostek transkrypcyjnych wzglêdem siebie np. z pro-motorami w tym samym regionie ale skiero-wanymi przeciwnie pozwala na zastosowanie tego samego elementu regulacyjnego do sko-ordynowanej ekspresji operonów uczest-nicz¹cych w podobnych lub zupe³nie innych procesach. Autogenna represja zachodz¹ca w miarê syntezy produktów i utrzymanie eks-presji na niskim, podstawowym poziomie za-pewnia najbardziej ekonomiczne rozwi¹zania bez potrzeby zewnêtrznych sensorów. Auto-regulacja, chocia¿ wydaje siê najprostsz¹ stra-tegi¹, nie zawsze mo¿e jednak zaspokoiæ wy-magania regulacyjne. W wiêkszoœci plazmi-dów koniugacyjnych (IncP-1, IncQ, IncI1) kompleks relaksazy jest zazwyczaj autoregula-torem operonów Dtr dziêki lokalizacji oriT w regionie promotorowym. Trudniej wyobraziæ sobie zachodzenie autoregulacji poprzez ko-ñcowy produkt operonu Mpf (kompleks bia³ek tworz¹cych pilus). Uzasadnione jest tu pojawienie siê bia³ek o funkcji regulatorowej kodowanych przez operon mpf (IncP-1, IncF, IncN). Plazmidy IncP-1 id¹ jakby o krok dalej skupiaj¹c geny regulatorowe w jednym opero-nie (autoregulowanym), co wiêcej opero-niektóre z bia³ek represorowych maj¹ do spe³nienia do-datkowe funkcje w biologii plazmidów IncP-1 (aktywny rozdzia³ kopii plazmidów do komó-rek potomnych).

Z punktu widzenia ewolucji istnienie re-gulatorowego RNA jest idealnym rozwi¹za-niem: umo¿liwia zachodzenie zmian równo-czeœnie w sekwencji „regulatora” i celu, na który ten regulator dzia³a. Szczególnie cenne mo¿e to byæ przy zjawisku niezgodnoœci pla-zmidów (kontrola replikacji). Mutacja w

anty-sensownym RNAI w plazmidach typu ColEI to równoczeœnie mutacja w inicjatorowym RNAII tej kopii plazmidu, si³a oddzia³ywañ miêdzy komplementarnymi cz¹steczkami RNA nie ulegnie zmianie ale zmieni siê si³a od-dzia³ywañ regulatorowego RNAI z pozo-sta³ymi kopiami plazmidu co mo¿e pozwoliæ ró¿nym wariantom na wspó³istnienie w tej sa-mej komórce gospodarza. Regulacja przy udziale antysensownego RNA ma jeszcze inne zalety: jest bardziej czu³a i podlega szybszym zmianom ni¿ regulacja przy udziale bia³ek. Niew¹tpliwie mo¿e byæ mniej dyskrymi-nuj¹ca w wyborze w³aœciwego celu i pewnie dlatego wiêkszoœæ systemów opartych na re-gulacji antysensownym RNA zawiera równie¿ bia³kowe sk³adniki.

Intryguj¹c¹ cech¹ regulacji ekspresji ge-nów plazmidowych jest osi¹gniêcie wywa-¿onej równowagi (ang. fine tuning) miêdzy tym co niezbêdne do przetrwania w gospoda-rzu i tym co mo¿e obni¿yæ zdolnoœæ prze¿ycia gospodarza. Plazmidy IncP-1 zdolne do replika-cji i stabilnego dziedziczenia w wielu odmien-nych gatunkach bakterii s¹ tutaj niezast¹pio-nym przyk³adem do perfekcji opanowanej techniki regulacji ekspresji genów. Istnienie z³o¿onej sieci regulacyjnej, nak³adaj¹cych siê na siebie regulonów koordynuj¹cych wszyst-kie procesy ¿yciowe czy kooperacyjne dzia³anie regulatorów buforuje niespodziewa-ne zmiany œrodowiska.

Wspomniane przyk³ady sprzê¿enia syste-mów koniugacyjnych plazmidów Ti czy pla-zmidów feromono-zale¿nych z obecnoœci¹ po-tencjalnych dawców/biorców czy czynnikami ze œrodowiska sygnalizuj¹ istotn¹ now¹ dzie-dzinê badañ nad plazmidami: relacje plazmid a œrodowisko z mo¿liwoœciami manipulacji w przysz³oœci odpowiedziami plazmidów.

THE ROLE OF REGULATION OF GENE EXPRESSION IN PLASMID STABILITY S u m m a r y

Plasmid survival relies heavily on the regulation of gene expression assuring the balance between the ne-cessity of a certain level of plasmid genetic information being expressed and minimalization of the metabolic burden imposed on the host. The most commonly used regulatory mechanisms are autogenous repression and antisense RNA-mRNA interactions which provide the systems with economy, simplicity, sensitivity and

possi-bility of rapid response to internal and external changes. IncP-1 plasmids are described in more detail as the paradigm of a multivalent regulatory network, responsi-ble for tight repression, coordination and fine-tuning of almost all plasmid functions and providing simulta-neously a high level of security to plasmid genome.

Appropriate recognition and use of environmen-tal stimuli as very important factors in plasmid

biol-ogy is nicely exhibited by Ti plasmids of Agro- bacterium tumefaciens and pheromone-responsive plasmids of Enterococcus faecalis.

LITERATURA CHATTORAJD. K., 2000. Control of plasmid DNA

repli-cation by iterons: no longer paradoxical. Mol. Microbiol. 37, 467–476.

DE LAHOZ A. B.,AYORA S., SITKIEWICZI., FERNANDEZS., PANKIEWICZ R., ALONSO J. C., CEG£OWSKI P., 2000, Plasmid copy-number control and better-than-random segregation genes of pSM19035 share a common regulator. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 728–733.

DELSOLARG., ESPINOZAM., 2000. Plasmid copy number

control: an ever-growing story.Mol. Microbiol.37, 492–500.

DEL SOLAR G., GIRALDO R., RUIZ-ECHEVARRIA M. J., ESPINOZAM., DIAZ-OREJAZR., 1998. Replication and

control of circular bacterial plasmids. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62, 434–464.

ESPINOZA M., COHEN S., COUTURIER M., DEL SOLAR G., DIAZ-OREJAZR., GIRALDOR., JANNIEREL., MILLER, C.,

OSBORNM., THOMASC. M., 2000. Plasmid replica-tion and copy number control. [W:] The Horizon-tal Gene Pool. THOMAS C. M. (red.) Amsterdam, Harwood Academic Publishers 1–47.

FRANCH T., GERDES K., 2000. U-turns and regulatory RNAs. Curr. Opin. Microbiol. 3, 159–164. GERDES K., AYORA S., CANOSA I., CEG£OWSKI P.,

DIAZ-OREJAZ R., FRANCH T., GULTYAEVA. P., BUGGE

JENSENR., KOBAYASHII., MACPHERSONC., SUMMERSD., THOMAS C. M., ZIELENKIEWICZ U., 2000a. Plasmid maintenance systems. The Horizontal Gene Pool. THOMASC. M. (red.) Amsterdam, Harwood

Acade-mic Publishers, 49–85.

GERDES K., MOLLER-JENSEN J., JENSEN R. B., 2000b. Pla-smid and chromosome partitioning: surprises from phylogeny. Mol. Microbiol. 37, 455–466. GREATED A., TITOK M., KRASOWIAK R., FAIRCLOUGH R.,

THOMASC. M., 2000. The replication and stable in-heritance functions of IncP-9 plasmid pM3. Micro-biol. 146, 2249–2258.

HEINEMANN J. A., SPRAGUE G. F. Jr., 1989. Bacterial conjugative plasmids mobilize DNA transfer be-tween bacteria and yeast. Nature 340, 205–209. JAGURA-BURDZYG., THOMASC. M., 1994. KorA protein of promiscuous plasmid RK2 controls a transcriptio-nal switch between divergent operons for plasmid replication and conjugative transfer. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 10597–10575.

JAGURA-BURDZYG., THOMASC. M., 1995. Purification of KorA protein from broad host range plasmid RK2: definition of a hierarchy of KorA operators. J. Mol. Biol 253, 39–50.

JAGURA-BURDZY G., MACARTNEY D. P., ZATYKA M., CUNLIFFE L., COOKED., HUGGINS C., WESTBLADEL., FARHATK., THOMASC. M., 1999a. Repression at a

di-stance by the global regulator KorB of the promi-scuous IncP plasmids. Mol. Microbiol. 32, 519–532.

JAGURA-BURDZY G., KOSTELIDOU K., POLE J., KHARE D., JONESA., WILLIAMSD. R., THOMASC. M., 1999b. IncC

of broad-host-range plasmid RK2 modulates KorB transcriptional repressor activity in vivo and ope-rator binding in vitro. J. Bacteriol. 181, 2807–2815.

KOSTELIDOUK., THOMASC. M., 2000. The hierarchy of KorB binding at its twelve binding sites on the broad host range plasmid RK2 and modulation of this binding by IncC1 protein. J. Mol. Biol. 295, 411–422.

KOSTELIDOUK., JONESA.C., THOMASC. M., 1999. Conse-rved C-terminal region of the global regulator KorA of promiscuous plasmid RK2 is required for co-operativity between KorA and a second RK2 global regulator, KorB. J. Mol. Biol. 289, 211–221. LEDERBERGJ., TATUME.I., 1946 Gene recombination in

Escherichia coli. Nature 158, 558.

LIP.L., FARRANDS.K. 2000. The replicator of the nopali-ne-type Ti plasmid pTiC58 is a member of the rep-ABC family and is influenced by the TraR-depen-dent quorum-sensing regulatory system. J. Bacte-riol. 182, 179–188.

MOLLER-JENSENJ., BUGGEJENSENR., LOWEJ., GERDES K.

2002. Prokaryotic DNA segregation by an actin-like filament. The EMBO J. 21, 3139–3127. MOTALLEBI-VESHAREH M., ROUCH D. A., THOMAS C. M.,

1990. A family of ATPases involved in active parti-tioning of diverse bacterial plasmids. Mol. Micro-biol. 4, 1455–1463.

MUKHOPADHYAY S., CHATTORAJ D. K. 2000. Replicatio-n-induced transcription of an autorepressed gene: the replication initiator gene of plasmid P1. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 7142–7147.

PANSEGRAU W., LANKA E., BARTH P., FIGURSKI D. H., GUINEY D.G., HAAS D., HELINSKI R. R., SCHWAB H.,

STANISICHV. A., THOMASC. M., 1994. Complete nuc-leotide sequence of Birmingham IncPa plasmids: compilation and comparative analysis. J. Mol. Biol. 239, 623–663.

RAMIREZ-ROMEROM. A., SOBERONN., PEREZ-OSEGUERAA., TELLEZ-SOSAJ., CEVALLOSM. A., 2000. Structural ele-ments required for replication and incompatibili-ty of the Rhizobium etli symbiotic plasmid. J. Bac-teriol. 182, 3117–3124.

THISTEDT., SORENSENN. S., GERDESK., 1995. Mechanism of post-segregational killing: secondary structure analysis of the entire Hok mRNA from plasmid R1 suggests a fold back structure that prevents trans-lation and antisense RNA binding. J. Mol. Biol. 247, 859–873.

THORSTEDP. B., MACARTNEYD. P, AKHTARP., HAINESA. S., ALIN., DAVIDSONP., STAFFORDT., POCKLINGTONM. J., PANSEGRAUW., WILKINSB. M., LANKAE., THOMASC. M., 1998. Complete sequence of the IncPb plasmid R751: implications for the evolution and

organi-sation of the IncP backbone. J. Mol. Biol. 282, 969–990.

WAGNER E. G. H., SIMONSR. W., 1994. Antisense RNA control in bacteria, phages and plasmids. Annu. Rev. Microbiol. 48, 713–742.

WILLIAMSD. R., MOTALLEBI-VESHAREHM., THOMASC. M., 1993. Multifunctional repressor KorB can block transcription by preventing isomerization of RNA polymerase-promoter complexes. Nucl. Acids Res. 21, 1141–1148.

WILLIAMS D. R., MACARTNEYD. P., THOMASC. M., 1998. The partitioning activity of the RK2 central con-trol region requires only IncC, KorB and KorB-binding site O_B3 but other KorB-binding si-tes form destabilizing complexes in the absence of O_B3. Microbiol. 144, 3369–3378.

ZATYKAM., JAGURA-BURDZYG.,THOMASC. M., 1994. Regu-lation of transfer genes of promiscuous IncPa

pla-smid RK2: repression of Tra1 region transcription both by relaxosome proteins and by the Tra2 regu-lator TrbA. Microbiol. 140, 2981–2990.

ZATYKA M., THOMAS C. M., 1998.Control of genes for conjugative transfer of plasmids and other mobi-le emobi-lements. FEMS Microbiol. Rev. 21, 291–319. ZATYKAM., BINGLEL., JONESA. C., THOMASC. M., 2001.

Cooperativity between KorB and TrbA repressors of broad-host-range plasmid RK2. J. Bacteriol.183, 1022–1031.

ZECHNERE. L., DELACRUZF., EISENBRANDTR., GRAHNA. M., KORAIMANNG., LANKAE., MUTHG., PANSEGRAU

W., THOMASC. M., WILKINSB. M., ZATYKAM., 2000. Conjugative- DNA transfer processes. [W:] The Ho-rizontal Gene Pool. THOMASC. M. (red.) Amster-dam, Harwood Academic Publishers, 87–174.