Angiogeneza jako nowy czynnik rokowniczy

(1)

Angiogeneza jako nowy czynnik rokowniczy u chor

Angiogeneza jako nowy czynnik rokowniczy u chor ych

ych

na raka krtani

Angiogenesis as a prognostic factor in patients with lar

Angiogenesis as a prognostic factor in patients with laryngeal cancer

yngeal cancer

M

ACIEJ

G

RYCZYÑSKI

, W

IOLETTA

P

IETRUSZEWSKA

Katedra Otolaryngologii i Klinika Laryngologii Akademii Medycznej w £odzi, ul. Kopciñskiego 22, 90-153 £ódŸ

Mimo ci¹g³ego udoskonalania metod leczniczych w postêpowaniu u cho-rych na raka krtani, wskaŸniki wyleczalnoœci poprawiaj¹ siê nieznacznie. Uzna-ne kliniczUzna-ne i histologiczUzna-ne czynniki prognostyczUzna-ne nie s¹ wystarczaj¹ce w ustaleniu rokowania u indywidualnego chorego. Koniecznym staje siê wiêc poszukiwanie kolejnych, niezale¿nych wskaŸników rokowniczych. Badania ostatnich lat wskazuj¹ na prognostyczne znaczenie oceny angiogenezy. Jest to wieloetapowy proces prowadz¹cy do powstania nowego naczynia, obecny zarówno w warunkach fizjologicznych (gojenie siê ran), jak i patologicznych (zapalenia, nowotwory). Wzrost i powstawanie przerzutów litych nowotwo-rów z³oœliwych s¹ zale¿ne od wytworzenia nowej sieci naczyñ krwionoœnych, a wzmo¿on¹ intensywnoœæ angiogenezy obserwowano w wielu nowotwo-rach. Ocenê nasilenia angiogenezy uznaje siê za niezale¿ny czynnik rokowni-czy w niektórych guzach litych (rak sutka, prostaty, p³uca oraz nowotwory g³owy i szyi). W pracy przedstawiono metody oceny angiogenezy ze zwróce-niem szczególnej uwagi na przeciwcia³a wykorzystywane w technikach immu-nohistochemicznych. W oparciu o w³asne doœwiadczenie omówiono zastoso-wanie oceny neowaskularyzacji jako nowego czynnika prognostycznego w raku krtani oraz potencjalne mo¿liwoœci wykorzystania terapii antyangiogennej u chorych na lite nowotwory z³oœliwe.

Otorynolaryngologia, 2002, 1(1), 13-20 S³owa kluczowe:

S³owa kluczowe: S³owa kluczowe: S³owa kluczowe:

S³owa kluczowe: rak krtani, angiogeneza, czynnik rokowniczy, FVM, CD34

Despite continuous progress in surgical techniques used in the treatment of the patients with laryngeal cancer, survival rate hardly improves. The recognised clinical and pathological prognostic factors are not satisfactory in prognosis in individual patient. There is a need for searching of new, inde-pendent prognostic factors. The researches of recent years are focussed on prognostic value of angiogenesis. It is a multistage process which leads to the formation of new vessels and is present in physiological (wound he-aling), as well as in pathological processes (inflammation and neoplasms). The growth of solid tumours and the process of metastasis are dependent on the formation of new blood vessels and the intensity of angiogenesis has been shown to be increased in various human tumours. The evaluation of angiogenesis has been proposed to be an independent prognostic marker of some solid tumours (breast cancer, prostate cancer, lung cancer, head and neck neoplasms). The authors present methods of angiogenesis assessment with special focus on antibodies used for immunohistochemical techniques. Based on the literature review and own research the authors assess the possibility of using neovascularisation as a new prognostic factor in laryngeal cancer patients and the perspectives of antiangiogenic therapy in solid tumours. Otorynolaryngologia, 2002, 1(1), 13-20 Key words: Key words: Key words: Key words:

Key words: laryngeal cancer, angiogenesis, prognostic factor, FVM, CD34

Wybrane dane epidemiologiczne i etiologiczne w raku krtani

W ostatnich latach stwierdzono istotne zwiêkszenie wspó³czynników chorobowoœci i umieralnoœci z powodu nowotworów z³oœliwych dróg oddechowych u mê¿czyzn. Polska, obok Hiszpanii, W³och i Francji, nale¿y do kra-jów najwiêkszego ryzyka raka krtani w Europie. Rak krta-ni stanowi ok. 4,8% wszystkich zarejestrowanych zacho-rowañ na nowotwory wœród mê¿czyzn (12,6/100 000) i odpowiedzialny jest za ok. 3,6% zgonów (standaryzo-wany wspó³czynnik umieralnoœci 7,48/100 000). Nato-miast u kobiet wynosi on odpowiednio – 0,4% nowo-tworów (0,42/100 000) i 0,5 zgonów (0,53/100 000) [1,2]. Zarówno zapadalnoœæ, jak i umieralnoœæ na raka krtani jest wiêc oko³o 10-15-krotnie wiêksza w populacji mê¿czyzn ni¿ kobiet [3,4]. Najwiêksz¹ zachorowalnoœæ na ten nowotwór stwierdza siê w przedziale wieku od 50 do 60 lat u mê¿czyzn i powy¿ej 70 roku ¿ycia u kobiet.

W Polsce umieralnoœæ z powodu raka krtani u mê¿czyzn zwiêkszy³a siê w znaczny sposób od po³owy lat 60. (3,3/100 000) do po³owy lat 80. (6,4/100 000). W ostat-nim dziesiêcioleciu wzrost ten jest wolniejszy, lecz wspó-³czynniki chorobowoœci i umieralnoœci nadal utrzymuj¹ siê na wysokim poziomie. W populacji kobiet od po³owy lat 60. wspó³czynniki umieralnoœci stale s¹ na niskim po-ziomie [1,2]. We wszystkich grupach wiekowych wystê-puj¹ tendencje do wzrostu wspó³czynników umieralno-œci [2,3,5]. Najczêstszym, pierwotnym umiejscowieniem nowotworu krtani jest nadg³oœnia [4,5].

Czynniki ryzyka

Notowane w Polsce zwiêkszenie liczby zgonów z po-wodu nowotworów mo¿e wynikaæ m.in. ze wzrostu czyn-ników rakotwórczych w œrodowisku oraz zachowañ sprzy-jaj¹cych rozwojowi tych chorób [2]. W znacznym stopniu Otorynolaryngologia, 2002, 1(1), 13-20

(2)

spowodowane jest to zwiêkszonym zagro¿eniem nowo-tworami tytoniozale¿nymi (guzy z³oœliwe wargi, jamy ustnej i gard³a, krtani, prze³yku, p³uca, pêcherza moczo-wego, trzustki oraz nerki). Badania epidemiologiczne jed-noznacznie wskazuj¹, ¿e palenie tytoniu i spo¿ywanie al-koholu s¹ podstawowymi czynnikami ryzyka wystêpo-wania raka krtani [4,6]. Wi¹¿e siê to z ekspozycj¹ na sub-stancje chemiczne o w³aœciwoœciach mutagennych i kar-cynogennych, do których nale¿¹ przede wszystkim poli-cykliczne wêglowodory aromatyczne (benzo[a]piren), aminy aromatyczne i N-nitrozaminy. Ryzyko zachoro-wania na nowotwór z³oœliwy krtani wzrasta wraz z liczb¹ wypalanych dziennie papierosów i jest wiêksze u wcze-œnie rozpoczynaj¹cych palenie [4]. Dane epidemiologicz-ne wskazuj¹ na zwi¹zek miêdzy wystêpowaniem raka krta-ni a nadmiernym spo¿ywakrta-niem alkoholu, jednak¿e me-chanizmy jego dzia³ania nie s¹ do koñca poznane. Eta-nol mo¿e dzia³aæ jako kokarcynogen i promotor procesu nowotworowego. Przewlekle spo¿ywany m.in. zmniej-sza wch³anianie sk³adników od¿ywczych, doprowadza do upoœledzenia czynnoœci w¹troby, wp³ywa na obni¿enie wydolnoœci uk³adu immunologicznego, przez co hamuje procesy unieczynniania zwi¹zków karcynogennych [6]. Podkreœla siê wspó³dzia³anie tytoniu i alkoholu w inicjo-waniu raka krtani w okolicy nadg³oœniowej, tj. regionu bezpoœrednio granicz¹cego z gard³em i najbardziej nara-¿onego na dzia³anie powy¿szych czynników [7]. Palenie ponad 20 papierosów dziennie i picie wysokoprocento-wego alkoholu przez ponad 15 lat zwiêksza ryzyko za-chorowania na nowotwór krtani oko³o 330 razy [4]. Udzia³ w patogenezie raka krtani przypisuje siê równie¿ takim czynnikom, jak: zaka¿enie wirusowe HSV, HPV i HIV, immunosupresja, przewlek³e choroby zakaŸne, sta-ny niedoboru ¿elaza, witamin A i C, ekspozycja na pro-mieniowanie ultrafioletowe i ryzyko zwi¹zane z wykony-waniem niektórych zawodów (m.in. nara¿enie na kon-takt z azbestem, niklem, kauczukiem i gum¹). Jednak ich rola w inicjowaniu procesu chorobowego w krtani pozo-staje nadal niejasna [3,4,7]. Z drugiej strony wskazuje siê na ochronny efekt dzia³ania witaminy A i C w nowo-tworach z³oœliwych.

Czynniki rokownicze

Poznanie czynników rokowniczych choroby nowo-tworowej u³atwia wybór metody leczenia i prowadzi do wyd³u¿enia czasu prze¿ycia dziêki mo¿liwoœci zastoso-wania odpowiedniego postêpozastoso-wania uzupe³niaj¹cego. Dotychczas wykazano, ¿e najbardziej wiarygodna w pro-gnozowaniu wyst¹pienia przerzutów, wznowy i czasu prze¿ycia jest ocena stopnia zaawansowania nowotworu wg klasyfikacji TNM i oparty na niej jednolity podzia³ zaawansowania klinicznego raka krtani [8]. Pierwszym etapem oceny stopnia zaawansowania choroby jest

okre-œlenie stanu klinicznego (clinical staging – cTNM), któ-ry jest najlepszym przedoperacyjnym wskaŸnikiem rozle-g³oœci procesu nowotworowego i na tej podstawie, przy uwzglêdnieniu typu histologicznego, podejmowane s¹ de-cyzje lecznicze. W przypadkach operacyjnych, usuniêty nowotwór z wêz³ami ch³onnymi s³u¿y do patomorfolo-gicznej diagnostyki makroskopowej i mikroskopowej (pa-thomorphological staging – pTNM), która, bêd¹c bezpo-œredni¹ ocen¹ rozleg³oœci raka, przewy¿sza czu³oœci¹ oce-nê kliniczn¹ i z tego wzglêdu jej wartoœæ prognostyczna jest du¿o wiêksza. Kolejnym wskaŸnikiem rokowniczym jest stopieñ zró¿nicowania histologicznego raka krtani, czyli tzw. grading. Czynnik ten zosta³ uznany za wskaŸnik o du-¿ym znaczeniu rokowniczym [9,10]. Stosowana obecnie klasyfikacja Œwiatowej Organizacji Zdrowia, w zale¿noœci od nasilenia cech guza, wyró¿nia 3 stopnie

histopatolo-

Ryc. 1. Obraz mikroskopowy wysokodojrza³ego raka p³askonab³onkowego krtani o „³awicowym” typie wzrostu z du¿ymi obszarami rogowacenia (1) i umiarko-wanym naciekiem zapalnym (2) (HE, powiêkszenie 40x)

Ryc.2. Obraz mikroskopowy raka p³askonab³onkowego o niskim stopniu zró¿-nicowania histologicznego (polimorfizm komórek i j¹der, nieprawid³owe figu-ry podzia³u) (HE, powiêkszenie 200x)

(3)

gicznego zaawansowania nowotworu (G1, G2, G3) uwzglêdniaj¹ce stopieñ rogowacenia, pleomorfizm komó-rek i j¹der, liczbê figur podzia³u w polu widzenia oraz obec-noœæ komórek wieloj¹drowych (ryc. 1, 2) [9,11].

Podzia³ jedynie na 3 stopnie sprawia, ¿e wiêkszoœæ rozpoznañ histopatologicznych w raku krtani to stopieñ drugi (G2). Dlatego znaczenie gradingu w ocenie roko-wania u poszczególnych chorych na raka krtani pozosta-je nadal dyskusyjne. Na podstawie badañ w³asnych doty-cz¹cych prognozowania u chorych na raka krtani wydaje siê, ¿e ocena morfologicznych i biologicznych cech no-wotworu na podstawie tylko stopnia zró¿nicowania hi-stologicznego nowotworu jest niewystarczaj¹ca. W oce-nie prze¿ywalnoœci w grupie 151 chorych oce-nie stwierdzo-no bowiem ¿adnych istotnych zale¿stwierdzo-noœci miêdzy kolej-nymi stopniami zró¿nicowania histologicznego nowo-tworu a ca³kowitym i wolnym od wznowy czasem prze-¿ycia tych chorych (p>0,05) (praca w druku). Pewien postêp wnios³a zaproponowana w 1987 r. przez Annero-tha, Batsakisa i Luny i oparta na danych Jacobssona nowa klasyfikacja uwzglêdniaj¹ca zarówno wybrane cechy hi-stologiczne guza (architektonika, stopieñ zró¿nicowania, polimorfizm j¹der, figury podzia³u), jak i rodzaj reakcji guz – tkanki otaczaj¹ce (sposób i stadium naciekania, obecnoœæ nacieku limfatycznego, komórek wrzecionowa-tych lub inwazji naczyñ) [12-15]. Ka¿d¹ z cech oceniano w skali od 1 do 4 punktów, a chorych podzielono na gru-py o wartoœciach punktacji mniejszych i wiêkszych od 10. W badaniach w³asnych stwierdzono statystycznie istotn¹ zale¿noœæ miêdzy sum¹ punktów powy¿ej 10 wg tej klasyfikacji a du¿ym zaawansowaniem nowotworu w krtani (T3 i T4), obecnoœci¹ przerzutów w wêz³ach ch³on-nych szyi i krótszym czasem prze¿ycia chorych (p<0,05). Nie zaobserwowano natomiast zale¿noœci miêdzy liczb¹ punktów uzyskanych wg ocenianej klasyfikacji a wystê-powaniem wznów procesu nowotworowego (p>0,05) (praca w druku).

Umiejscowienie zmian w poszczególnych okolicach anatomicznych krtani, zgodnie z zaleceniami Œwiatowej Organizacji Zdrowia z 1990 roku (ICD-O International Classification of Diseases for Oncology), to kolejny czyn-nik u³atwiaj¹cy rokowanie, zw³aszcza w aspekcie prze-rzutów do wêz³ów ch³onnych i wznów procesu nowo-tworowego. Najczêœciej stwierdza siê przerzuty do wê-z³ów ch³onnych szyi u chorych z nag³oœniow¹ lokaliza-cj¹ guza pierwotnego. Nowotwory umiejscowione w obrêbie g³oœni, z uwagi na bardzo ubog¹ sieæ naczyñ ch³onnych w tej okolicy, stosunkowo póŸno powoduj¹ powstawanie przerzutów. D³ugi okres bezobjawowego wzrostu guza w okolicy podg³oœniowej powoduje, ¿e zazwyczaj stwierdza siê istnienie procesu nowotworo-wego póŸno, tj. na etapie powsta³ych przerzutów do wêz³ów ch³onnych szyi.

Ocena molekularna

Mimo ci¹g³ego udoskonalania metod leczniczych w postêpowaniu u chorych na raka krtani, wskaŸniki wy-leczalnoœci poprawiaj¹ siê nieznacznie. Uznane klinicz-ne i histologiczklinicz-ne czynniki prognostyczklinicz-ne nie s¹ bowiem wystarczaj¹ce w ustaleniu rokowania u indywidualnego chorego. Niejednokrotnie bowiem stwierdza siê ró¿ny przebieg kliniczny choroby nowotworowej u chorych z tym samym stopniem klinicznego zaawansowania guza, stopniem zró¿nicowania histologicznego i o tym samym umiejscowieniu. Zmusi³o to badaczy do poszukiwania kolejnych czynników prognostycznych. Badania ostat-nich lat podnosz¹ rokownicze znaczenie oceny biologii nowotworów. Niepohamowany wzrost zwi¹zany z du¿¹ niestabilnoœci¹ genetyczn¹, utrata zdolnoœci do ró¿nico-wania i nabycie zdolnoœci do naciekania (inwazji) oraz zajmowania obszarów zasiedlonych w warunkach pra-wid³owych przez inne komórki (przerzut) to cechy ko-mórek, które naby³y fenotyp nowotworowy. Szereg zmian koniecznych, aby powsta³ nowotwór spowodowanych jest uaktywnieniem lub unieczynnieniem wielu genów. Pod-stawowe zmiany to brak reakcji na czynniki wyzwalaj¹ce apoptozê, brak zapotrzebowania oraz niewra¿liwoœæ na czynniki wzrostowe pochodz¹ce z otaczaj¹cego œrodowi-ska, a tak¿e nieograniczona zdolnoœæ do replikacji. Dwie pozosta³e cechy, szczególnie istotne w z³oœliwych nowo-tworach litych, to zdolnoœæ do inicjowania angiogenezy oraz inwazji tkanek i powstawania przerzutów. Maj¹c na uwadze powy¿sze przes³anki, w ostatnim dziesiêcioleciu w ocenie wartoœci poznawczych i praktycznych zyska³y znaczenie badania biologii nowotworów krtani. Obejmuj¹ one zarówno metody molekularne (ocena sekwencji nu-kleotydów cz¹steczki DNA i RNA), cytogenetyczne (oce-na morfologii chromosomów) jak i immunohistoche-miczne (rozpoznawanie determinant antygenowych zwi¹-zanych z komórk¹ nowotworow¹ za pomoc¹ przeciwcia³ monoklonalnych [16-19]. Powy¿sze badania dotycz¹ g³ównie pierwotnych uszkodzeñ DNA (przerwy nici, addukty, uszkodzenia oksydacyjne), oceny anomalii struk-tury i funkcji chromosomów, analizy bia³ek kontroli cy-klu komórkowego, mutacji w protoonkogenach i genach supresorowych transformacji nowotworowej i ekspresji ich bia³ek, ploidii DNA, utraty heterozygotycznoœci nie-których genów, oceny czynników wzrostu, receptorów hormonalnych i innych [17-20]. Badania immunohi-stochemiczne i analiza genetyczna w za³o¿eniu maj¹ wes-przeæ wysi³ki klinicystów w profilaktyce, diagnozowaniu, leczeniu i prognozowaniu u chorych na raka krtani. Obec-nie bada siê ponad 100 czynników prognostycznych od-zwierciedlaj¹cych w³aœciwoœci biologiczne, morfologicz-ne, immunologiczne i biochemiczne raka krtani. Wœród wielu badanych procesów podkreœla siê znaczenie angio-genezy, proliferacji i apoptozy w rokowaniu u chorych na ró¿ne nowotwory z³oœliwe.

(4)

Angiogeneza

Ju¿ w 1971 roku Folkman wysun¹³ hipotezê, ¿e wzrost i progresja nowotworów litych s¹ uzale¿nione od powstawania nowych naczyñ [21]. Dopiero jednak od lat 90. badania dotycz¹ce angiogenezy nowotworowej prowadzone s¹ na du¿¹ skalê w wielu oœrodkach.

Angiogeneza (neowaskularyzacja, naczyniotworze-nie) jest wieloetapowym procesem, który prowadzi do powstania nowych naczyñ krwionoœnych z istniej¹cych naczyñ gospodarza. Towarzyszy ona zarówno zjawiskom fizjologicznym, jak i patologicznym. W warunkach fi-zjologicznych wystêpuje „waskulogeneza”, czyli powsta-wanie naczyñ z angioblastów w czasie embriogenezy, a nastêpnie formowanie nowego ³o¿a naczyniowego w zwi¹zku z owulacj¹ lub powstawaniem cia³ka ¿ó³tego. W stanach patologicznych neowaskularyzacja wystêpuje w czasie gojenia siê ran, w zapaleniach (m.in. retinopatia cukrzycowa, choroby dzi¹se³, ³uszczyca, egzema, choro-by autoimmunologiczne, powstawanie kr¹¿enia obocz-nego po zawale miêœnia sercowego) i w nowotworach. W badaniach doœwiadczalnych udowodniono, ¿e angio-geneza jest procesem niezbêdnym dla wzrostu i powsta-wania przerzutów litych nowotworów z³oœliwych [22,23]. Rozwój guzów powy¿ej wielkoœci 2-3 mm2_(graniczna wielkoœæ, dla której mo¿liwe jest od¿ywianie komórek na drodze prostej dyfuzji) jest zale¿ny od wytworzenia nowej sieci naczyñ i dostarczenia przez nie sk³adników od¿ywczych, czynników wzrostu i tlenu [21,24,25]. Roz-poczêcie angiogenezy mo¿e byæ wywo³ane zarówno nie-dotlenieniem komórek, jak i mutacjami genów supreso-rowych i onkogenów, prowadz¹cymi do powstania tzw. fenotypu angiogennego, tj. stanu, w którym komórki nowotworowe stale wydzielaj¹ czynniki pobudzaj¹ce an-giogenezê [25,26]. W wyniku tych nak³adaj¹cych siê pro-cesów komórki nowotworowe aktywuj¹ swoiste czynni-ki stymuluj¹ce migracje i podzia³y komórek œródb³onka naczyñ krwionoœnych w najbli¿szym s¹siedztwie guza, powoduj¹c powstanie sieci naczyñ oplataj¹cych i pene-truj¹cych jego masê. W pierwszym etapie dochodzi do degradacji b³ony podstawnej naczynia gospodarza. Sty-mulacja œródb³onka prowadzi do zwiêkszenia aktywno-œci biochemicznej i proliferacji oraz przemieszczania siê komórek œródb³onkowych poza naczynie przez powsta³e liczne przerwy w po³¹czeniach miêdzykomórkowych œródb³onka. Nowe pasma komórek œródb³onkowych ³¹-cz¹ siê z pêtl¹ istniej¹cego naczynia, a nastêpnie docho-dzi do wytworzenia œwiat³a nowego naczynia, nowej b³o-ny podstawnej i rekrutacji perycytów (komórek zlokali-zowanych na zewnêtrznej stronie naczynia, odpowiedzial-nych m.in. za hamowanie proliferacji œródb³onka). W tym z³o¿onym procesie wzajemnie oddzia³ywaj¹ komórki no-wotworowe, komórki œródb³onka i podœcieliska, co pro-wadzi do powstania nowego mikroœrodowiska, bardziej korzystnego dla nowotworu, które u³atwia migracjê ko-mórek nowotworowych do naczyñ, umo¿liwiaj¹c tym

samym powstawanie przerzutów. Jednak¿e, aby uzyskaæ pe³ny fenotyp angiogenny, niezbêdne jest dodatkowe za-hamowanie przez komórki nowotworowe czynników blo-kuj¹cych angiogenezê. W przypadku neowaskularyzacji nowotworowej równowaga pomiêdzy stymulacj¹ a ha-mowaniem jest przesuniêta w kierunku pobudzenia an-giogenezy. Czynnikami aktywuj¹cymi s¹ cytokiny, en-zymy i czynniki wzrostu wydzielane zarówno przez ko-mórki nowotworowe, jak i koko-mórki bêd¹ce w bezpoœred-nim s¹siedztwie pobudzonego naczynia (fibroblasty, ko-mórki tuczne, granulocyty, makrofagi i limfocyty). W oto-czeniu komórek nowotworowych istnieje przewaga czyn-ników pobudzaj¹cych angiogenezê, takich jak: aFGF i bFGF (acidic and basic fibroblast growth factor – kwa-œny i zasadowy czynnik wzrostu fibroblastów), VEGF (va-scular endothelial growth factor – naczyniowo-œródb³on-kowy czynnik wzrostu), TGF (transforming growth fac-tor – transformuj¹cy czynnik wzrostu), PDGF (platelet derived growth factor – p³ytkopochodny czynnik wzro-stu), angiogenina, interleukina 8, pleotropina, prostaglan-dyna E1 i E2, proliferyna i inne [27,28]. Ma³e stê¿enia endogennych inhibitorów angiogenezy (m.in. czynnika p³ytkowego 4, trombospondyny, tkankowych inhibito-rów metaloproteinaz, angiostatyny, prolaktyny, interfe-ronu α, β, γ i innych) równie¿ sprzyjaj¹ pobudzeniu pro-cesu angiogenezy. Skutkiem przewagi stymulatorów neo-waskularyzacji i ci¹g³ej aktywacji tego procesu jest wy-tworzenie mniej dojrza³ych naczyñ krwionoœnych, co powoduje, ¿e komórki nowotworu ³atwiej dostaj¹ siê do kr¹¿enia, u³atwiaj¹c powstawanie przerzutów [29]. Na-czynia te cechuje brak perycytów, odmienny sk³ad ma-cierzy zewn¹trzkomórkowej – wiêksza zawartoœæ kwasu hialuronowego a mniejsza usiarczanowanych proteogli-kanów, wiêksza przepuszczalnoœæ b³ony podstawnej, brak unerwienia oraz inny kszta³t – naczynia nowopowsta³e s¹ poszerzone, krête, rozga³êzione i maj¹ liczne po³¹cze-nia têtniczo-¿ylne.

Metody oceny angiogenezy

Intensywnoœæ neowaskularyzacji guzów ocenia siê stosuj¹c ró¿ne metody: radiologiczne, ultrasonograficz-ne, dopplerowskie oraz rezonansu magnetycznego [30,31]. Unaczynienie nowotworów bada siê równie¿ pod mikroskopem, oznaczaj¹c gêstoœæ mikronaczyñ (naczyñ o œrednicy mniejszej ni¿ 100 m) po zastosowaniu ró¿-nych metod (srebrzenie, paS, barwienie w³ókien sprê¿y-stych metod¹ van Giesona). Celem wybiórczego uwidocz-nienia naczyñ w badaniach immunohistochemicznych znakuje siê komórki œródb³onka lub elementy b³ony pod-stawnej naczynia w³osowatego. Na powierzchni œródb³on-ka naczyniowego istnieje szereg antygenów, które w wy-niku reakcji ze swoistymi przeciwcia³ami monoklonal-nymi i chromogenem tworz¹ kompleksy uk³adaj¹ce siê wzd³u¿ naczynia. W badaniach na skrawkach

(5)

parafino-wych przydatne s¹ przeciwcia³a skierowane przeciwko antygenom œródb³onka: FVIII (czynnik von Willebran-da), CD31, CD34, Ulex I. Do barwieñ wy³¹cznie w skrawkach mro¿onych s³u¿¹ przeciwcia³a: CD38, PAL-E, EN4, BMA 120 [32]. Dla oceny angiogenezy istotne jest uwidocznienie nowopowsta³ych naczyñ. Do-tychczasowe doniesienia wskazuj¹, ¿e ¿aden ze stosowa-nych obecnie markerów œródb³onka nie spe³nia tego kryte-rium. Nie stwierdza siê bowiem ró¿nic antygenowych (immunofenotypowych) miêdzy komórkami œródb³onka naczyñ w nowotworach a tymi, które powsta³y na drodze angiogenezy nie zwi¹zanej z karcynogenez¹. We wstêpnej fazie badañ s¹ przeciwcia³a (E9, EN, 7/44, TEC11, H4/ 18, 4A11), które maj¹ byæ swoiste jedynie w stosunku do aktywowanych komórek œródb³onka, jednak¿e mog¹ byæ one stosowane tylko dla skrawków mro¿onych [32,33]. Wobec braku mo¿liwoœci u¿ycia swoistych przeciwcia³ dla naczyñ powsta³ych w procesie angiogenezy nowotwo-rowej, do jej oceny stosuje siê markery, które nie wyró¿-niaj¹ nowopowsta³ych naczyñ w obrêbie guza. Do ich uwidocznienia wykorzystywane s¹ wiêc metody immu-nohistochemiczne, których czu³oœæ i swoistoœæ zale¿y od przeciwcia³a skierowanego przeciwko poszukiwanemu antygenowi œródb³onka. Stosuje siê jedno z trzech prze-ciwcia³: anty-CD31, anty-CD34 i anty-FVIII. Bada siê równie¿ ekspresjê genu i bia³ka naczyniowo-œródb³on-kowego czynnika wzrostu œródb³onka (VEGF) i czynni-ka wzrostu fibroblastów (FGF) bezpoœrednio w tczynni-kance guza lub w surowicy krwi. VEGF jest czynnikiem wy-dzielanym przez komórki nowotworowe ró¿nych typów i pobudza proces angiogenezy: bezpoœrednio – bêd¹c spe-cyficznym mitogenem dla komórek œródb³onka oraz po-œrednio – zwiêkszaj¹c przepuszczalnoœæ naczyñ dla czyn-ników bia³kowych pobudzaj¹cych jego wydzielanie (m.in. fibrynogen). FGF wykazuje dzia³anie mitogenne i che-motaktyczne dla komórek œródb³onka [27,28,34-38].

Czynnik von Willebranda

Czynnik VIII (F VIII) jest najlepiej poznanym i roz-powszechnionym markerem komórek œródb³onka, a jako polimer glikoprotein odgrywa istotn¹ rolê w adhezji p³y-tek. Wystêpuje on w cia³kach Weibel-Palade’a i w apa-racie Golgiego komórek œródb³onka oraz w ziarnisto-œciach alfa megakariocytów [39]. Antygen FVIII umiej-scowiony jest na powierzchni komórek œródb³onka na-czyñ (w³osowatych i wiêkszych), poza naczyniami w prze-grodach pêcherzyków p³ucnych, k³êbkach nerkowych i si-nusoidach w¹troby (ryc. 3) [40].

Antygen CD34

Antygen CD34 jest bia³kiem o masie cz¹steczkowej 115 kD, obecnym na komórkach prekursorowych mie-loidalnych oraz na komórkach œródb³onka. Bia³ko to re-guluje migracje komórek œródb³onka podczas dojrzewa-nia nowych naczyñ, pojawia siê we wczesnych etapach ich tworzenia i jest obecne w trakcie ró¿nicowania

na-czyñ [40,41]. Jest ono wskaŸnikiem o du¿ej czu³oœci, porównywalnej z FVIII i CD31. Jednak¿e w odró¿nie-niu od FVIII i CD31, antygen CD34 nie daje reakcji krzy¿owej z komórkami krwi, mo¿e jednak dawaæ reak-cje z komórkami nab³onka oraz z komórkami wrzecio-nowatymi miêsaka Kaposiego [40]. W badaniach w³a-snych (praca w druku) stwierdzono znamiennie wiêksz¹ liczbê naczyñ wybarwionych po zastosowaniu przeciw-cia³a anty-CD34 w porównaniu do liczby naczyñ uwi-docznionych reakcj¹ z antygenem FVIII w grupie 151 chorych na raka krtani (ryc. 4). Antygen CD34 wydaje siê byæ bardziej swoistym ni¿ czynnik FVIII w ocenie neowaskularyzacji w raku krtani.

Antygen CD31

CD31 jest glikoprotein¹ o masie cz¹steczkowej 130 kD, która nale¿y do nadrodziny immunoglobulin zwa-nej PECAM (Platelet Endothelial Cell Adhesion

Ryc. 3. Liczne naczynia uwidocznione ekspresj¹ antygenu FVIII w obrêbie raka krtani (odczyn immunoperoksydazowy, powiêkszenie 200x)

Ryc. 4. Obraz mikroskopowy licznych naczyñ zabarwionych po zastosowaniu przeciwcia³a anty-CD34 w raku krtani (odczyn immunoperoksydazowy, po-wiêkszenie 200x)

(6)

Molecule – p³ytkowo-œródb³onkowa cz¹steczka adhezji komórkowej). Antygen ten wystêpuje na powierzchni p³ytek, monocytów, granulocytów, limfocytów B i na ko-mórkach œródb³onka. W porównaniu z czynnikiem von Willebranda i CD34 wystêpuje znacznie czêœciej, rów-nie¿ na powierzchni komórek œródb³onka sinusoidów w¹troby, œledziony, uwidaczniaj¹c tak¿e prawid³owe na-czynia przegród pêcherzyków p³ucnych [40].

Intensywnoœæ angiogenezy jako czynnik prognostycz-ny i wskaŸnik rozwoju choroby nowotworowej

W pracach klinicznych badanie wartoœci prognostycz-nej intensywnoœci angiogenezy (IA) by³o odnoszone do wielkoœci guza, obecnoœci przerzutów w wêz³ach ch³on-nych i do czasu prze¿ycia. Wykazano, i¿ intensywniejsza angiogeneza zwiêksza ryzyko wyst¹pienia przerzutów w rakach sutka, prostaty, pêcherza moczowego, g³owy i szyi oraz jelita grubego [42-44]. W niektórych pracach doty-cz¹cych raka sutka angiogenezê uwa¿a siê za niezale¿ny czynnik prognostyczny [45]. W raku krtani wp³yw an-giogenezy na wielkoœæ guza i powstawanie przerzutów nowotworowych do wêz³ów ch³onnych nie zosta³ dosta-tecznie poznany, a wyniki nielicznych badañ nie s¹ jed-noznaczne [46,34,47]. Wp³yw intensywnoœci angioge-nezy na wzrost guza i powstawanie przerzutów zosta³ potwierdzony w licznych badaniach we wczesnym i in-wazyjnym raku sutka [42,45], w raku endometrium [49], w raku p³uca [50], w raku prostaty [51] i w raku prze³yku [52]. W nowotworach g³owy i szyi badania angiogenezy zapocz¹tkowali m.in. Gasparini i wsp. (1993), którzy w grupie 70 chorych z zaawansowanymi guzami wyka-zali istnienie znamiennej zale¿noœci (p<0,001) miêdzy liczb¹ naczyñ (≥25 w polu widzenia pod powiêkszeniem 200x) a obecnoœci¹ wêz³owych i odleg³ych przerzutów. Naczynia uwidoczniono stosuj¹c przeciwcia³o anty--CD31. Jednak nie wszystkie kolejne prace dawa³y tak jednoznaczne wyniki i znaczenie rokownicze angioge-nezy w nowotworach g³owy i szyi (w tym w raku krtani) pozostaje nie w pe³ni wyjaœnione. Rozbie¿noœci te t³u-maczone s¹ brakiem wystandaryzowanych metod iden-tyfikacji naczyñ i oceny intensywnoœci angiogenezy w gu-zie. W badaniach w³asnych (praca w druku) obejmuj¹-cych grupê 151 chorych na raka krtani stwierdzono istot-ne zale¿noœci miêdzy intensywnoœci¹ angiogeistot-nezy oce-nion¹ liczb¹ naczyñ uwidocznionych ekspresj¹ antygenu CD34 i wielkoœci¹ guza a wzmo¿ona IA wystêpowa³a znamiennie czêœciej w guzach krtani o stopniu zaawan-sowania T3 (p=0,04) i T4 (p=0,001) i by³a istotnie wiêk-sza w grupie chorych ze wznow¹ wêz³ow¹ (p=0,02. Pole powierzchni naczyñ, badane z zastosowaniem metody morfometrycznej, by³o znamiennie najwiêksze u chorych z IV stopniem klinicznego zaawansowania choroby (p=0,04) oraz ocenianymi niezale¿nie: guzem pierwot-nym T4 (p=0,02), obecnoœci¹ przerzutów w regionalnych

wêz³ach ch³onnych (N1-3) (p<0,001) i obecnoœci¹ wznowy wêz³owej (p=0,001). Intensywnoœæ angiogene-zy, oceniana liczb¹ naczyñ uwidocznionych ekspresj¹ antygenu FVIII, zale¿a³a dodatnio od wielkoœci guza pierwotnego (p=0,01) i by³a znamiennie wiêksza w gru-pie chorych z przerzutami do wêz³ów ch³onnych, okre-œlonymi jako N2 i N3 (p<0,05). Pole powierzchni tych naczyñ by³o istotnie wiêksze w grupie chorych z IV stop-niem zaawansowania klinicznego nowotworu (p=0,03) i u pacjentów ze wznow¹ wêz³ow¹ (p<0,001).

Reasumuj¹c, badania intensywnoœci angiogenezy w raku krtani pozwalaj¹ na ocenê agresywnoœci raka krta-ni, zw³aszcza w aspekcie wielkoœci guza pierwotnego i przerzutów do wêz³ów ch³onnych, zarówno tych stwier-dzonych podczas pierwotnej oceny zaawansowania no-wotworu (cecha N), jak i odleg³ych w czasie (wznowa wêz³owa). Badania immunohistochemiczne neowasku-laryzacji pozwalaj¹ na ocenê biologii nowotworu i jego cech z³oœliwoœci ju¿ na podstawie badania guza pierwot-nego i na tej podstawie – wybór postêpowania lecznicze-go. W ocenie angiogenezy przeprowadzonej przez wielu autorów w nowotworach z³oœliwych o innej lokalizacji ni¿ g³owa i szyja [42,45,49-52], a w badaniach w³asnych w raku krtani (praca w druku) wykazano, ¿e wzmo¿ona intensywnoœæ angiogenezy w guzie pierwotnym wskazu-je na tendencwskazu-je nowotworu do intensywnego wzrostu i do powstawania przerzutów w wêz³ach ch³onnych, wznów wêz³owych oraz krótszego czasu prze¿ycia. Ocena tego procesu w raku krtani mog³aby byæ przydatna w wyod-rêbnieniu chorych, u których korzystne by³oby rozsze-rzenie leczenia. Tak wiêc, w ka¿dym przypadku stwier-dzenia wzmo¿onej IA w guzie pierwotnym, nale¿y roz-wa¿yæ, czy istnieje koniecznoœæ zastosowania dodatko-wej terapii (napromienianie, chemioterapia) lub wyko-nania selektywnej operacji wêz³owej, mimo klinicznego braku przerzutów do wêz³ów ch³onnych szyi (N0) w celu prewencji wznów raka. Wyniki tych badañ mog³yby staæ siê przyczynkiem do rozwi¹zania szeroko omawianego w piœmiennictwie laryngologicznym od kilku lat proble-mu dotycz¹cego przeprowadzania tzw. profilaktycznych selektywnych operacji wêz³owych w przypadku cechy N0, które to postêpowanie budzi liczne kontrowersje i ma swoich przeciwników i zwolenników [53,54]. Ocena an-giogenezy mog³aby wiêc pomóc w kwalifikowaniu cho-rych do takich zabiegów.

Nowe perspektywy leczenia

Ocena procesu neowaskularyzacji w nowotworach z³oœliwych staje siê bardzo istotna w œwietle intensyw-nych badañ maj¹cych na celu wprowadzenie leczenia anty-angiogennego. Znajomoœæ angiogenezy mog³aby pozwo-liæ na zastosowanie egzogennych substancji hamuj¹cych tworzenie nowych naczyñ i tym samym opóŸniæ rozwój guza. W badaniach doœwiadczalnych wykazano, ¿e

(7)

substancje, które dzia³aj¹ antagonistycznie w stosunku do czynników stymuluj¹cych angiogenezê, mog¹ jedno-czeœnie hamowaæ wzrost guza [55]. Próby w tym kie-runku rozpoczêto dopiero w ostatnich latach. Obecnie w trzeciej fazie badañ klinicznych s¹ m.in. leki hamuj¹ce rozk³ad b³ony podstawnej bêd¹ce inhibitorami metalo-proteaz (enzymów u³atwiaj¹cych penetracjê macierzy ze-wn¹trzkomórkowej), marimastat i batimastat. Podobne dzia³anie wykazuj¹ równie¿ pochodne distamycyny A i TIMP-1 i 2. Kolejn¹ grup¹ s¹ leki blokuj¹ce dzia³anie czynników pobudzaj¹cych angiogenezê, np. VEGF (po-przez neutralizacjê VEGF lub zablokowanie odpowie-dzi komórki œródb³onka na VEGF). Nale¿¹ do niej m.in. Talidomid, Linomid, CM101 toksyna streptokokowa, CAI, TNP-470, AGM1470. Badane s¹ równie¿ leki hamuj¹ce migracjê komórkow¹ (winblastyna, taksol, in-terferon alfa, bleomycyna) i leki hamuj¹ce proliferacjê ko-mórek œródb³onka (rapamycyna, PF4 czynnik p³ytkowy 4 [56,57].

Du¿e nadzieje pok³ada siê w terapii genowej zwi¹za-nej z zastosowaniem genów samobójczych z promotora-mi swoistypromotora-mi dla komórek œródb³onka lub genu

koduj¹-cego TNF-α (czynnik martwicy nowotworów), który wprowadzony do nowotworów litych za poœrednictwem wektora adenowirusowego swoiœcie niszczy naczynia krwionoœne, ulega ekspresji pod wp³ywem promieniowa-nia jonizuj¹cego, w wyniku czego powstaj¹cy TNF-α powoduje powstawanie zakrzepów i niszczenie naczyñ.

Poza doskonaleniem technik diagnostycznych i lecz-niczych, pok³ada siê nadziejê w tym, ¿e postêp badañ bio-logii nowotworów, w tym procesu angiogenezy, ostatecz-nie przyostatecz-niesie korzyœci aplikacyjne. Stwierdzono bowiem, ¿e inwazyjnoœæ procesu w wielu nowotworach, w tym w raku krtani, jest zale¿na od angiogenezy. Neowaskula-ryzacja jest niezbêdna do powstania przerzutów nowo-tworowych tych guzów, chocia¿ nie jest jedynym czyn-nikiem warunkuj¹cym ich wyst¹pienie. Ocena nasilenia angiogenezy wydaje siê byæ obiecuj¹cym wskaŸnikiem w diagnozowaniu rozleg³oœci procesu nowotworowego oraz w monitorowaniu i prognozowaniu u chorych na z³oœliwe nowotwory lite o ró¿nym umiejscowieniu.

Praca czêœciowo finansowana z funduszu prac w³asnych Akademii Medycznej w £odzi nr projektu 502-11-714(62)

Piœmiennictwo

1. Tyczyñski JE, Wojciechowska U, Didkowska J i wsp. Atlas umieralnoœci na nowotwory z³oœliwe w Polsce w latach 1991-1995. Centrum Onkologii – Instytut im. Marii Sk³odowskiej-Curie. Warszawa 1997.

2. Zatoñski WA, Tyczyñski JE (red.). Epidemiologia nowotworów z³oœliwych w Polsce w piêtnastoleciu 1980-1994. Centrum Onkologii – Instytut im. M. Sk³odowskiej-Curie. Warszawa 1997.

3. Becker W, Naumann HH, Pfaltz CR. Choroby uszu, nosa i gard³a. Bel Corp. Warszawa 1999.

4. Zatoñski WA. Nowotwory z³oœliwe w Polsce. Centrum Onkologii. Warszawa 1993.

5. Semczuk B, Szmeja Z, Janczewski G i wsp. Wyniki operacyjnego leczenia chorych na raka krtani w latach 1988-1989 w czterech oœrodkach klinicznych. Otolaryng Pol 1998; 70 (3): 259-263. 6. Wojtukiewicz MZ, Sierko E. Alkohol a nowotwory. Nowotwory

2000; 50 (1): 39-47.

7. Muscat JE, Wyndre EL. Tobacco, alcohol, asbestos, and occupational risk factors for laryngeal cancer. Cancer 1992; 69, 9: 2244-2250.

8. Rosai J. Ackerman’s Surgical Pathology. Mosby 1996: 314-337. 9. Bocca E, Calearo C, DeVincentiis I i wsp. Occult metastases in cancer of the larynx and their relationship to clinical and histological aspects of the primary tumor: a four-year multicentric research. Laryngoscope 1984; 94, 8: 1086-1090. 10. Hirvkoski P, Kumpulainen E, Virtaniemi J i wsp. Enhanced

apoptosis correlates with poor survival in patients with laryngeal cancer but not with cell proliferation, bcI-2 or p53 expression. Eur J Cancer 1999; 35 (2): 231-237.

11. Shanmugaratnam K, Sobin LH. Histological typing of tumours of the upper respiratory tract and ear. Springer - Verlag 1991. 12. Anneroth G, Batsakis J, Luna M. Reviev of the literature and recommended system of malignancy grading in oral squamous cell carcinomas. Scand J Dent Rs 1987; 95: 229-249.

13. Goldsmith MM, Belchis DA, Cresso DH. The importance of the eosinophil in head and neck cancer. Otolaryngol Head Neck Surg 1992; 106: 27-33.

14. Jacobsson PA, Eneroth CM, Killander D i wsp. Histological classification and grading of malignancy in cancer of the larynx (a pilot study). Acta Radiol Ther Phys Biol 1973; 12: 1-7. 15. Weidner N. Intratumor microvessel density as a prognostic

factor in cancer. Am J Pathol 1995; 147: 9-19.

16. Gerdes J, Li L, Schlueter C, Duchrow M. i wsp. Immunohisto-chemical and molecular biology characterisation of the cell proliferration-associated nuclear antigen that is defined by monoclonal antibody Ki-67. Am J Patholog 1991; 138: 867-873. 17. Limon J, Siedlecki JA. Choroby nowotworowe. w: Bala J. (red.) Badania molekularne i cytogenetyczne w medycynie. Elementy genetyki klinicznej. Springer PWN, Warszawa 1998. 18. Kujawski M, Szyfter K. Cytogenetyczne badania nowotworów

cz³owieka – p³askonab³onkowy rak krtani. Post Biol Komórki 2000; 27, supl. 14: 184-191.

19. Szyfter K, Ja³oszyñski P, Kujawski M. i wsp. Zagadnienia metodyczne w analizie molekularnej raka krtani. Otolaryng. Pol. 2000; 27( supl. 14): 193-213.

20. Golusiñski W, Szmeja Z, Olofsson J i wsp. Wartoœæ diagnostyczna i prognostyczna onkogenu p.-53, wybranych markerów nowotworowych (Ki67, PCNA, DNA-ploidii) ultrastruktury u chorych na raka krtani. Otolaryng Pol 1996; 50, 6: 607-617.

21. Folkman J. Tumor angiogenesis: therapeutic implications. N Engl J Med 1971; 285: 1183-1186.

22. Folkman J, Watson K, Ingber D. Induction of angiogenesis during the transition from hyperplasia to neoplasia. Nature 1989; 235: 442-447.

23. Folkman J. What is evidence that tumors are angiogenesis dependent? J. Natl. Canc. Inst. 1990; 82: 4-6.

(8)

24. Folkman J. The role of angiogenesis in tumor growth. Semin Cancer Biol 1992; 3: 65-71.

25. Szala S, Radzikowski Cz. Pod³o¿e molekularne angiogenezy nowotworów. Nowotwory 1997; 47: 1-19.

26. Petruzelli G. The biology of tumor invasion, angiogenesis and lymph node metastasis. ORL 2000; 62: 178-185.

27. Eisma RJ, Spiro JD, Kreuzer DL. Role of angiogenic factors: coexpression of interleukin-8 and vascular endothelium growth factor in patients with head and neck squamous carcinoma. Laryngoscope 1999; 109: 687-693.

28. Toi M., Taniguchi T, Yamamoto Y i wsp. Clinical significance of the determination of angiogenic factors. Eur J Cancer 1996; 32A, 14: 2513-2519.

29. Nagy JA, Morgan ES, Herzberg KT i wsp. Pathogenesis of ascites tumor growth: angiogenesis, vascular remodeling and stroma formation in the peritoneal lining. Canc Res 1995; 55: 376-85.

30. Frouge C, Guinebretiere JM, Contesso G i wsp. Correlation between contrast enhancement in dynamic resonance imaging of yhe breast and tumor angiogenesis. Invest Radiol 1994; 29: 1043-1049.

31. Yuan A, Chang DB, Yu CJ. Color Doppler sonography of benign and malignant pulmonary masses. AJR 1994; 163: 545-549. 32. Vermeulen PB, Gasparini G, Fox SB i wsp. Quantification of

angiogenesis in solid human tumours: an international consensus on the methodology and criteria of evaluation. Eur J Cancer 1996; 32A(14): 2474-2584.

33. Wang JM, Kumar S, Pye D i wsp. A monoclonal antibody detects heterogeneity in vascular endothelium of tumours and normal tissues. Int J Cancer 1993; 54: 363-366.

34. Burian M, Quint Ch, Neuchrist C. Angiogenic factor in laryngeal carcinomas: Do they have prognostic relevance? Acta Otolaryngol (Stockh) 1999; 119: 289-292.

35. Dellacono FR, Spiro J, Eisma R i wsp. Expression of basic fibroblast growth factor and its receptors by head and neck squamous cell carcinoma tumor and vascular endothelial cells. Am J Surg 1997; 174: 540-544.

36. Neuchrist C, Quint C, Pammer A i wsp. Vascular endothelial growth factor (VEGF) and micovessel density in squamous cell carcinoma of the larynx: an immunohistochemical study. Acta Otolaryngol (Stockh.) 1999; 119: 732-738.

37. Riedel F, Götte K, Schwalb J i wsp. Vasculat endothelial growth factor expression correlates with p53 mutation and angiogenesis in squamous cell carcinoma of the head and neck. Acta Otolaryngol 2000; 120: 104-111.

38. Smith BD, Smith GL, Carter D i wsp. Prognostic significence of vascular endothelial growth factor protein levels in oral and oropharyngeal squamous cell carcinoma. J Clin Oncol 2000; 18(10): 2046-2052.

39. Calapso P, Vitarelli E, Crisafulli C i wsp. Immunocytochemical detection of megacariocytes by endothelial markers: a comparative study. Pathologica 1992; 84: 215-223.

40. Kuzu I, Bicknell R, Harris AL. Heterogeneity of vascular endothelial cells with relevance to diagnosis of vascular tumours. J Clin Pathol 1992; 45: 143-148.

41. Rijn M., Rouse RV. CD-34 – a rview. Appl Immunohist 1994; 2: 71-80.

42. Bosari S, Lee AKC, Delellis RA i wsp. Microvessel quantification and prognosis in invasise breast carcinoma. Hum Pathol 1992; 23: 755-761.

43. Brawer MK, Deering RE, Brown M i wsp. Predictors of pathological stage in prostatic carcinoma. Cancer 1994; 73: 678-687.

44. Gasparini G, Weidner N, Matula S. Intratumoral microvessel density and p53 protein correlation with metastasis in head-and-neck carcinoma. Int J Cancer 1993; 55: 739-744. 45. Weidner N, Folkman J, Pozza F i wsp. Tumor angiogenesis:

a new significant and independent prognosyic indicator in early-stage breast carcinoma. J Natl Cancer Inst 1992; 84: 1875-1887. 46. Beatrice F, Cammarota R, Giordano C i wsp. Angiogenesis: prognostic significance in laryngeal cancer. Anticancer Res 1998; 18 (6B): 4737-4740.

47. Murray JD, Carlson GW, McLaughlin K i wsp. Tumor angiogenesis as a prognostic factor in laryngeal cancer. Am J Surg 1997; 174(5): 523-526.

48. Weidner N, Semple JP, Welch WR i wsp. Tumor angiogenesis and metastasis – correlation in invasive breast carcinoma. N Engl J Med 1991; 324: 1-8.

49. Schoell WM, Pieber D, Reich O i wsp. Tumor angiogenesis as a prognostic factor in ovarian carcinoma: quantification of endothelial immunoreactivity by image analysis. Cancer 1997; 80 (12): 2257-2262.

50. Macchiarini D, Fantanini G, Hardin MJ i wsp. Relation of neovascularisation to metastasis of non-small-celllung cancer. Lancet 1992; 340 (8812): 145-146.

51. Wakui S, Furusato M, Itoh T i wsp. Tumor angiogenesis in prostatic carcinoma with and without bone marrow metastasis: a morphometric study. J Pathol 1992; 168(3): 257-262. 52. Tanigawa N, Matsumura M, Amaya H i wsp. Tumor vascularity

correlates with the prognosis of patients with esophageal squamous cell carcinoma. Cancer 1997; 79: 220-225. 53. Buckley JG, MacLennan K. Cervical node metastases in

laryngeal and hypopharyngeal cancer: a prospective analysis of prevalence and distribution. Head-Neck 2000; 22: 380-385. 54. Varela AS, Gonzales CF, Valerias RM i wsp. Efficency of

funcional elective neck dissection for treatment of cancer of larynx. Rev Laryngol Otol Rhinol 1996; 117, 1: 41-45. 55. Kim KJ, Li B, Winer J, Armani M i wsp. Inhibition of vascular

endothelial growth factor induced angiogenesis suppresses tumour growth in vivo. Nature 1993; 362: 841-844.

56. Kohn EC, Liotta LA. Molecular insight into cancer invasion: strategies for prevention and intervention. Cancer Res 1995; 55: 1856-1862.

57. Rak JW, St.Croix BD, Kerbel RS. Consequences of angiogenesis for tumor progression, metastasis and cancer therapy. Anticancer Drugs 1995; 6(1): 3-18.

Angiogeneza jako nowy czynnik rokowniczy