Podstawowe zagadnienia ewolucji hemoglobin

A C T A U N I V E R S I T A T I S L O D Z I E N S I S

FOLIA BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA 10, 1994

Piotr Duchnowicz, Wirgiliusz Duda

PODSTAWOWE ZAGADNIENIA EWOLUCJI HEMOGLOBIN

Artykuł przedstawia zagadnienia dotyczące ewolucji hemoglobiny. Omówione zostały główne etapy ewolucji tego białka - rodowód genów globiny, powstanie tetrameru i jego rozpuszczalność oraz regulacja funkcji utlenowania hemoglobiny przez efektory allosteryczne. Omówiona została duplikacja genów przy tworzeniu hemoglobi­ ny zarodkowej i embrionalnej oraz szybkość ewolucji tego białka u kręgowców. Przedstawiono udział eksonów, intronów i pseudogenów w procesie ewolucji globiny i możliwości przyspieszenia ewolucji białka przez rekombinacje pomiędzy eksonami i intronami.

Hem oglobina jest jednym z najlepiej poznanych białek. D użo publikacji poświęcono studiom nad ewolucją tego białka. D o niedawna jedynymi źródłam i informacji w badaniach nad ewolucją białek były dane uzyskane z sekwencji aminokwasowej, porów nania immunologicznego, struktury tró j­ wymiarowej i właściwości funkcjonalnych. Obecnie wszystkie geny globiny człowieka zostały sklonowane i poznano ich sekwencje w D N A oraz ustalono lokalizacje w chrom osom ach. Odkrycie niekodujących fragm entów („in tro ­ nów ”) i sekwencji „flankujących” dodatkow o zwiększa możliwości poznania ewolucji hemoglobiny [13]. Przyjmuje się, że ewolucja hemoglobiny m ogła zachodzić dwom a drogami: poprzez selekcję adaptacyjną oraz dro gą zmian neutralnych; k tó ra z tych dróg dostarczyła większej ilości zmian jest obecnie dyskutow ane przez wielu badaczy. W iadom o jednak, że obie drogi m ają w tym swój udział. Być może szybki postęp w badaniach nad ewolucją białek i w prowadzanie nowych technik obliczeniowych pozwala odpowiedzieć na to pytanie. Niniejszy artykuł przedstaw ia stan wiedzy o ewolucji hem oglobiny opartej na podstawowej aktualnie literaturze przedm iotu.

RODOWÓD GENÓW GLOBINY

H em oglobina jest białkiem występującym bardzo szeroko, została znalezio­ na nie tylko wśród bezkręgowców i kręgowców, ale także u roślin i bakterii [32]. T ak szerokie występowanie w świecie żywym jednego, specyficznego białka daje podstawę do zadania pytania - czy hemoglobiny tych rozm aitych organizmów „są spokrew nione” ze sobą poprzez wspólny pień rozwoju? D w a fakty wskazują na pozytywną odpowiedź na to pytanie. Pierwszy, bliskie pokrewieństwo konform acyjne m ioglobiny i łańcuchów a oraz fi hemoglobiny kręgowców z łańcuchami hemoglobiny skąposzczetów, przedstawicieli Glycera, owadów z grupy Chironomus, i z leghemoglobiną pochodzącą z łubinu czy też z hem oglobiną drożdży lub bakterii np. Saccharomyces cerevisiae i Vitreoscilla [32, 33] sugeruje, że wszystkie łańcuchy globiny wywodzą się z wspólnego „pnia rozwoju” . D rugi, sporządzony za pom ocą kom putera plan ujawniający odległe w czasie pokrewieństwo pomiędzy sekwencjami aminokwasowym i sugeruje, że podobieństw a pomiędzy globiną bakterii, drożdży, roślin, bez­ kręgowców i kręgowców są zbyt wielkie, aby mogły powstać przypadkow o lub być wynikiem zbieżności [18].

Rodow ód hemoglobiny wydaje się być co najmniej tak stary ja k pierwsze zwierzęta (przypuszczalny podział na rośliny i zwierzęta nastąpił ok. 0.7-1.0 x 109 lat temu) [30],

H em oglobina m a nieregularne, przerywane występowanie wśród bezkrę­ gowców. Teraźniejsze protochordata, które praw dopodobnie są podobne bardziej do przodków chordata niż do współczesnych kręgowców, nie posia­ dają hemoglobiny. Dotychczas panow ało przekonanie, że geny, które nie ulegają ekspresji mogły być ostatecznie usunięte z genomu. Jeśli „przed­ stawiające” hemoglobinę geny różnych gatunków są spokrewnione wspólnym przodkiem , to jak wytłumaczyć fakt, że niektórzy przodkow ie organizm ów posiadających hemoglobinę nie mieli jej, a geny hemoglobiny zostały za­ chowane w genomie podczas ich ewolucyjnych przejść przez organizmy nie posiadające tego białka? M ożna zaproponow ać dwa rozw iązania tego p ro b ­ lemu. Pierwszy, cytochrom b 5 jest podobny strukturalnie do m ioglobiny, cytochrom b 562 m a sekwencję hom ologiczną z globiną [28], a cytochrom y znaleziono we wszystkich aerobowych kom órkach, istnieje więc potencjalna pula genetyczna, z której m ogła powstać wielokrotnie hem oglobina poprzez duplikację i dalsze różnicowanie. Drugi, geny hemoglobiny mogły nie ulegać ekspresji lub ulegać ekspresji na poziomie niższym niż obecnie wykrywany. Posiadane dowody są jednak niewystarczające do dokonania w yboru pom ię­ dzy tymi propozygam i.

EWOLUCJA FUNKCJI HEMOGLOBIN U KRĘGOWCÓW

Tetramcr. Powstanie tetram eru jest być może najważniejszym wydarzeniem w ewolucji hemoglobiny u kręgowców. U wszystkich klas kręgowców oprócz Agnata (śluzica i m inóg m orski) hem oglobina krwi jest tetram erem złożonym z dwóch a i dwóch fi łańcuchów globiny [18]. Integralność tetram eru zależy od dwóch rodzajów kontaktów , szczególnie a.i fi1 i d j i 2, każdy łańcuch a m a kon tak t z obom a łańcucham i fi (tab. 1). Aminokwasowe reszty w tych rejonach na ogół nie ulegają wymianom u kręgowców. Połączenie u l fi2 jest funkcjonalnie ważniejsze dla zmian konform acyjnych związanych z przyłącze­ niem tlenu - stała dysocjacji tetram eru do dimeru wzrasta 106 razy po przyłączeniu tlenu do hemów. T a zmiana czwartorzędowa ściśle związana ze zmianam i w strukturze trzeciorzędowej jest odbiciem ważnej fizjologicznie kooperatywności w przyłączaniu tlenu. K onform acja „deoksy” białka (stan T) z niskim powinowactwem do tlenu jest zmieniana w konform acje „oksy” (stan R) z wysokim powinowactwem d o tlenu [3, 23].

Poznane sekwencje aminokwasowe wskazują n a homologie pomiędzy wszystkimi istniejącymi obecnie a i fi łańcuchami [19]. Rodow e geny a i fi m u ­ szą być reprezentowane u przodka współczesnych kręgowców od ok. 420-500 m in lat. Istniejąca hom ologia dopuszcza stwierdzenie, że geny łańcuchów a i fi wywodzą się z jednego źródła przez duplikacje, po której nastąpiła dywergencja. D odatkow ym dowodem na istnienie „wspólnego p rzo d k a” łańcuchów a i fi są opisane sekwencje w obu genach a i fi, zajmujące dokładnie pozycje homologiczne w tych genach, np. u człowieka i myszy oraz w genach fi królika [20, 25], Przyporządkow anie tetram erowi funkcji kooperatyw nego wiązania tlenu wymusza istnienie dokładnych relacji sferycznych pom iędzy różnym i resztami aminokwasowymi w rejonach k o n tak tu między podjedno- stkam i. Przedstawione fakty prow adzą do nieuniknionej konkluzji, że geneza funkcjonalnego tetram eru hemoglobiny jest skorelowana z duplikacją genów i następującą po tym dywergencją dającą podjednostki białkowe a i fi. Proces ten m usiał nastąpić w czasie kiedy powstały kręgowce szczękowe od wspólnego przodka Osteichthyes i Elasmobranchii i był zależny od ewolucji specyficznych regionów kontaktu między tymi łańcuchami [7].

K onform acja łańcuchów a i fi była praw dopodobnie zachow ana przez cały czas ewolucji kręgowców. Perutz zaobserwował, że wewnętrzne reszty am ino­ kwasowe w regionach helikalnych łańcuchów a i fi są rzadko wymieniane - są konserwatywne. Reszty te w dużej mierze uczestniczą w oddziaływaniach hydrofobow ych odpowiedzialnych za strukturę globularną całej cząsteczki, jak i poszczególnych podjednostek hemoglobiny. C o a t e s [7] wykazał statystycz­ nie, opierając się na sekwencjach globiny różnych gatunków (wg Deyhoffa) i analogii z trzeciorzędową strukturą hemoglobiny człowieka, że reszty te są

bardzo stabilne (rzadko wymieniane - konserwatywne) przez cały okres ewolucji, tak jak i w przypadku krótkiej ewolucji hem oglobiny u ssaków. G o o d m a n [16] ułożył na podstawie danych sekwencyjnych drzewo genealo­ giczne genów globiny. Z a podstawę przyjął, że najlepsza genealogia m a najmniejszą liczbę wymienianych nukleotydów. N a podstawie tego drzewa G oodm an wnioskuje o niejednolitej ewolucji genów globiny zarów no przy rozpatryw aniu całości drzewa, jak i poszczególnych jego gałęzi. W począt­ kowej ewolucji tetram eru, w rejonie kontaktów a j/i2 reszty aminokwasowe były częściej wymieniane niż w okresie późniejszym [20].

U kręgowców prymitywnych z podtypu Agnatha wszystkie formy m ono- m eryczne hem oglobiny są związane z ligandem, a formy niezwiązane tw orzą agregaty. T o funkcjonalne, czasowe połączenie powoduje kooperatyw ność w przyłączaniu tlenu. Utlenow anie powoduje dysocjację do m onom erów , które m ają większe powinowactwo do tlenu niż agregat [26]. D w a składniki hem oglobiny wyizolowane od sluzicy są oddzielnie m onom eram i (brak koope- ratywności), a po połączeniu tw orzą układ tetram eryczny (pojawia się kooperatywność). Składniki te zachowują się jak podjednostki a i P u kręgow ­ ców wyższych. Sekwencja tych składników nie została jeszcze poznana i brak jest zatem ich pełnego porów nania z łańcuchami a i P kręgowców wyższych.

Rozpuszczalność tetrameru. Cecha agregacji zasługuje na bliższe rozpatrze­ nie. H em oglobina w krwinkach czerwonych kręgowców występuje w stężeniu bliskim granicy jej rozpuszczalności [27]. K ażda zmiana w topologii, która pow oduje kom plem entarność powierzchniową tetram eru, prowadzi do d o d a t­ kowej agregacji i precypitacji. Ekstrem alnym przykładem jest tu hem oglobina S w krw inkach sierpowatych. Tendencja do tworzenia agregatów wyższych niż tetram er została opisana u wielu kręgowców [2, 4, 12]. Precypitacja wewnątrz krwinki czerwonej m oże być zatrzym ana przez co najmniej trzy mechanizmy, pierwszy z nich - brak kom plem entarności powierzchniowej pomiędzy dwiema identycznymi m olekułam i - już o tym mówiliśmy. D ruga możliwość to ewolucja przez duplikacje genów wielorakich hemoglobin, których ekspresja jest szeroko rozpowszechniona wśród kręgowców. Obecność kilku różnych hemoglobin w organizmie może podnosić rozpuszczalność zgodnie z regułą faz (prawo rozpuszczalności między fazami). Trzecia możliwość to obserwowane, np. u niektórych ptaków zjawisko podniesienia rozpuszczalności hem oglobiny przez fosforany organiczne.

Efekt Bohra i efektory allosteryczne. Ewolucja kooperatywnego tetram eru była połączona z nabyciem m echanizm u kontroli utlenow ania przez protony (efekt Bohra), C 0 2, fosforany organiczne i chlorki. Nie jest zaskoczeniem, że rola tych różnych czynników zmienia się u różnych gatunków . K o n tro la utlenow ania i kooperatyw ność sprawiają, że system transportu tlenu jest

bardzo sprawny w wyniku różnic w powinowactwie tlenowym na powierzchni pęcherzyków płucnych i w tkankach. Każdy z tych czynników obniża powinowactwo poprzez uprzywilejowane wiązanie się do konform acji „deok- sy” hemoglobiny. Ewolucja tych m echanizmów zależy od niewielkiej liczby reszt aminokwasowych, które zostały zlokalizowane w N- i C-końcowych segmentach łańcuchów polipeptydowych. W ten sposób blisko 50% alkalicz­ nego efektu Bohra w hemoglobinie człowieka zależy od wiązania wodorowego w „deoksy” hemoglobinie pomiędzy C-term inalną histydyną (/?14.6His) każ­ dego łańcucha ¡i a /J93 asparagina (Asp) tego samego łańcucha. T o wiązanie ulega przerywaniu w czasie utlenowania, pK grupy imidazolowej histydyny spada i uwalniany jest proton. Następne 25% alkalicznego efektu B ohra jest rezultatem m ostka solnego pomiędzy grupam i — N H łańcuchów a a C-term inalną argininą sąsiedniego łańcucha a. Z a pozostałe 25% od­ powiedzialna jest oti22 histydyną (His). Podobnie m ała liczba reszt am ino­ kwasowych odpowiedzialna jest za wiązanie C O z i fosforanów organicznych [24]. F ak t, że tylko m ała liczba reszt aminokwasowych m a znaczącą rolę wskazuje na możliwość zmiany tego efektu w ewolucji poprzez wymianę tylko jednego aminokwasu. U trata regulacji funkcji hem oglobiny przez fosforany organiczne wiąże się z jed ną lub dwom a substytucjami aminokwasowymi. Opisane mechanizmy kontrolne zostały znalezione u wszystkich kręgowców z wyjątkiem prymitywnych Agnatha. U bezkręgowców nie znaleziono regulacji funkcji hem oglobiny przez fosforany organiczne, w znaczeniu ja k to m a miejsce u kręgowców.

Głównymi efektoram i fosforanowymi u Elasmobranchii i Osteichthyes są A TP i GTP. G ady wykorzystują głównie ATP, a płazy i ssaki A T P i 2,3-D PG (2,3-difosfoglicerynian), pentafosforan inozytolu (IPP) jest głównym fosfora­ nem u ptaków i żółwi [5]. 2,3-DPG jest głównym efektorem allosterycznym hemoglobin „dorosłych” (adult) w krwinkach czerwonych ssaków. Te obser­ wacje sugerują, że trifosfonukleotydy były praw dopodobnie efektoram i allos- terycznymi wczesnych kręgowców wykorzystujących tetram er u2fl2, wykorzys­ tywanie 2,3-DPG i IPP jest sprawą późniejszego dostosow ania, jakkolw iek IPP jest obecny u prymitywnych ryb oddychających powietrzem. Efektory fosforo­

organiczne wzm agają efekt Bohra, obniżając powinowactwo tlenowe i stabili­ zują form ę „deoksy” hemoglobiny. Ich stężenie w krwinkach czerwonych m oże się zmieniać w odpowiedzi na zmiany zachodzące w środowisku wewnętrznym i zewnętrznym, tak że wyrównują zmiany w powinowactwie tlenowym hemoglobiny. Przykładem jest wzrost stężenia 2,3-D PG w krw in­ kach czerwonych u ludzi w w arunkach wysokogórskich i u owiec cierpiących na anemię [1, 6],

Interesujące są dwie grupy ssaków, przeżuwacze i kotow ate, które nie posiadają hemoglobiny regulowanej przez 2,3-DPG. Stężenie 2,3-D PG w ich krwinkach czerwonych jest niskie; ich hem oglobiny nie wiążą 2,3-D PG

w sposób znaczący. U człowieka hem oglobina A (adult) wiąże 2,3-DPG w kieszeni uformowanej pomiędzy dw om a łańcuchami fi po odtlenowaniu. Ujemnie naładow ane grupy 2,3-DPG za pom ocą wiązań elektrostatycznych wiążą się z dodatnio naładowanym i resztami aminokwasowymi w każdym łańcuchu /J: N -term inalną waliną, NA2 histydyną, E F 6 lizyną i H21 histydyną [24]. Łańcuch fi hemoglobiny B kota m a N -term inalną serynę acetylowaną, a histydyną NA 2 zastąpiona jest przez fenyloalaninę i w ten sposób cztery d odatn io naładow ane grupy zostają „zgubione” . W hemoglobinie A k o ta N -term inalnym aminokwasem jest glicyna i brak jest NA 2 histydyny. Form y te słabo reagują na 2,3-DPG [31]. Łańcuch fi przeżuwaczy m a delecje w N -term inalnym końcu, brak jest NA2-histydyny oraz w miejscu N -term inal- nej waliny (powszechnie występującej w tej pozycji) występuje w hemoglobinie Bos sp. - m etionina, zatem łańcuch ten jest krótszy o jeden am inokwas (145 aminokwasów). Perutz zobserwował, że w tym przypadku odległość między dw om a łańcuchami fi jest zbyt duża w formie „deoksy” , aby m ogło zajść przyłączenie 2,3-DPG. „Zgubienie” regulacji funkcji hem oglobiny poprzez fosforany organiczne u przeżuwaczy i kotow atych, jakkolwiek m echanizm y tego zgubienia są różne - obie grupy są odizolowane filogenetycznie, jest niewątpliwie spraw ą wtórną.

DUPLIKACJA GENU PRZY TWORZENIU HEMOGLOBINY ZARODKOWEJ I EMBRIONALNEJ

U kręgowców niższych posiadających stadia „larw alne” różniące się od form dorosłych rozpowszechnione jest występowanie „larw alnych” hem o­ globin różniących się od hemoglobiny osobników dorosłych (hem oglobina adult). Przykładem m oże być kijanka bullfrog (gatunek żaby amerykańskiej), k tó ra posiada łańcuchy a. i fi znacznie różniące się od tych łańcuchów u osobnika dorosłego [21].

Em briony i zarodki wielu ssaków posiadają hem oglobiny różne od ich form dorosłych. Te rozwojowe hemoglobiny są korzystne, ponieważ wysokie powinowactwo do tlenu tych form hemoglobin pozwala na łatwe przechodze­ nie tlenu z krwi m atki do krwi zarodka. N iektóre hemoglobiny zarodkow e m ają wysokie wewnętrzne powinowactwo do tlenu w nieobecności 2,3-DPG. W pływ 2,3-D PG na hemoglobinę zarodkow ą człowieka różni się od efektu z hem oglobiną adult, ponieważ /i143 histydyną jest zastąpiona w łańcuchu y hem oglobiny zarodkowej przez serynę. P onadto stężenie 2,3-DPG w krw in­ kach czerwonych zarodka jest niższe niż u dorosłego człowieka, tak że powinowactwo do tlenu jest znacznie wyższe u zarodka. Zróżnicowane powinowactwo do tlenu m oże być osiągnięte także wyłącznie poprzez różnice

w stężeniu fosforanów organicznych, tak jak jest to osiągane w przypadku zarodka konia. Hem oglobina zarodka i dorosłego zwierzęcia nie różnią się, a jedynie stężenie 2,3-DPG w krwinkach zarodka jest dużo niższe.

Ontogeneza ekspresji genów hemoglobiny embrionalnej i płodowej została dobrze poznana w przypadku człowieka. Najwcześniejsza hem oglobina, znale­ ziona w zarodku przed 8 tygodniem ciąży, jest tetram erem złożonym z dwóch e i dwóch £ łańcuchów. Później wytwarzany jest tetram er zbudowany z dwóch a i dwóch y łańcuchów. Tuż przed porodem łańcuch y jest zastępowany łańcuchem fi i następnie w niewielkiej ilości ok. 1% przez łańcuch ó, tw orzą się hemoglobiny: A t o budowie a 2/?2 i A 2 - <x252. Geny łańcuchów podobnych do łańcucha a (dwa ( i dwa ot) zlokalizowane są w chrom osom ie 16, a geny z serii łańcucha fi (jeden e, dwa y, jeden 8 i jeden fi) w chrom osom ie 11 (rys. 1) [10, 13], Z badano sekwencję am inokwasową i nukleotydową tych łańcuchów i wyciągnięto wniosek, że rodzina tych genów pow stała ze „wspólnego p rzo d k a” w procesie duplikacji, a następnie dywergencji. Proces kształtow ania się genów hemoglobiny przebiegał przez długi czas i m ożna go skorelować z procesem ewolucji zwierząt, kolejne etapy ewolucji datow ano na podstawie szczątków kopalnych. Powstanie łańcuchów a i /? jest związane z pojawieniem się pierwszych kręgowców szczękowych ok. 420-500 min lat temu. E f s - t r a t i a d i s i wsp. [11] podaje, na podstawie obliczeń, w których przyjął 10 m in lat za 1% dywergencji, że początek istnienia genów em brionalnych/zarod­ kowych przypada na 200 m in lat tem u - w okresie intensywnej ewoluq’i gadów będących przodkam i ssaków. Rozdzielenie się genów y i ( przypada na ok. 100 m in lat temu, mniej więcej n a czas rozdzielenia się ssaków łożyskowych i torbaczy. Wydaje się, że ewolucja genów hemoglobiny płodowej (zarodkowej) i embrionalnej człowieka była związana z ewolucją długiego okresu ciąży i łożyskowym utrzym aniem płodu u ssaków.

SZYBKOŚĆ EW OLUCJI GENÓW HEMOGLOBINY U KRĘGOWCÓW

H o l m g u i s t [17] wykazał niejednolite tem po ewolucji hem oglobiny używając m odelu R E H (random evolutionary hits - przypadkow e trafienia ewolucyjne), w którym liczba wymienionych nukleotydów jest obliczana z sekwencji aminokwasowej i dostarcza dwa param etry: T 2 - liczba miejsc m utacji w sekwencji D N A i U 2 - średnia zmienność pozycji, gdzie R E H (liczba nukleotydów wymienionych) rów na się T 2 U 2.

C o a t e s i S t o n e [8] także wnioskują o ogólnej powolności ewolucji, w obu genach a i fi od m om entu rozejścia się linii owodniowców (ptaki i ssaki) n a podstaw ie korelacji pomiędzy liczbą wymienionych am inokwasów i czasem ewolucji określonym na podstawie szczątków kopalnych i porów nania m o rfo­ logicznego.

Z drugiej strony, wg K i m u r a [19] szybkość ewolucji hem oglobiny jest względnie stała.

Poznanie problem u szybkości ewolucji hemoglobiny, jak widać, wiąże się z dokładnym określeniem czasu powstania wielu linii filogenetycznych, czyli na określeniu punktów dywergencji i powstawania gatunków. Pom im o tego, zastosowanie testu względnej szybkości S a r i c h a i W i l s o n a [29], który jest zależny od danych uzyskanych ze szczątków kopalnych, doprow adziło do wniosku, że ewoluq'a hemoglobiny była ok. 1,5 raza wolniejsza u naczelnych w porów naniu do innych ssaków. Dowody na wolne tem po ewolucji hem o­ globiny w linii prowadzącej od przodka owodniowców do współczesnych ptaków i ssaków przedstawił G o o d m a n [15]. D odatkow e zwolnienie ewolucji obserwuje się u naczelnych z wyjątkiem pawianów (Papio sp.), gdzie szybkość ewolucji łańcucha a jest podwyższona.

Przy zastosowaniu tego samego czasu dywergencji tem po ewolucji dla cytochrom u c wydaje się być bardziej jednolite u kręgowców niż tem po ewolucji łańcuchów a i fi hemoglobiny [8],

EKSONY, INTRONY I PSEUDOGENY

Sekwencjonowanie genów globiny ujawniło istnienie niekodujących frag­ m entów („intronów ”), które rozdzielają sekwencje kodujące białko (,,ekso- ny”). Łańcuch a kodują trzy eksony określające reszty aminokwasowe 1-31, 32-99 i 100-141, łańcuch fi również trzy eksony 1-30, 31-104 i 105-146 (rys. 2) [13]. Introny zajmują pozycje homologiczne w obu genach. Podział genów na eksony związany jest z różnymi właściwościami funkcjonalnymi hemoglobiny. Ekson centralny koduje większość reszt z regionu k o n tak tu z hemem i kontaktu który zapewnia kooperatywność pomiędzy dimeram i. G rupy aminokwasów odpowiedzialne za efekt Bohra i za przyłączanie fosforanów organicznych kodowane są głównie przez pierwszy i ostatni ekson.

G i l b e r t [14] sugerował, że istnienie intronów i eksonów m oże być wynikiem rekombinacji genów kodujących różne funkcje innych białek. Taki proces m ógłby przyspieszyć proces ewolucji hemoglobiny powyżej tem pa możliwego do uzyskania poprzez substytucje pojedynczych nukleotydów. Połączenie regionów kodujących, różnych funkcjonalnie części hem oglobiny było przytaczane przez E atona jako poparcie tej hipotezy. Sugerował on, że ewolucja hemoglobiny przebiegała etapow o poprzez:

1) wiązanie hemu i odwracalne utlenowanie;

2) form owanie tetram eru i ewolucję kontaktów a i fil i u 1[lz oraz koop era­ tywność;

3) wytworzenie grup odpowiedzialnych za efekt B ohra i przyłączanie fosforanów organicznych.

C r a i g i wsp. [9] zwrócił uwagę, że fragm ent polipeptydowy, zgodny z centralnym eksonem łańcucha fi, silnie i specyficznie wiązał hem, co potwierdzałoby hipotezę G i l b e r t a [14].

Segregacja wariantów hemoglobiny „Lepore” człowieka, ukazuje, że zachodzi rekom binacja części genów. Siedem takich „fuzji” łańcuchów hem o­ globiny zostało zidentyfikowanych, sześć z nich zachodzi pomiędzy łań­ cuchami fi i S, a jeden pomiędzy fi i y. Dwie z sześciu rekombinacji mogły powstać przez rekom binacje eksonów 1 i 2, dwie następne eksonów 2 i 3. Większość rekombinacji hemoglobiny „L epore” (60% ) może być wyjaśnione przez przestawienia całych eksonów. Sugeruje to, że zmiany pomiędzy eksonam i i intronam i, prowadzące do rekombinacji, mogły być częstsze niż zmiany w obrębie samych eksonów. Zostały także odkryte geny, które nie są transkrybow ane z powodu insercji lub delecji, będących przyczyną zmiany struktury. Te „pseudogeny” oznaczone i ¥/?, znalezione u królika, myszy i człowieka, są w ok. 75-80% homologiczne do prawidłowych genów globiny. Duże podobieństwo „pseudogenów” do genów kodujących globinę wchodzącą w skład hem oglobiny sugeruje, że powstały razem z tymi genami. W „pseudo- genach” połączenie intron-ekson różni się od połączenia w norm alnych genach i praw dopodobnie dlatego geny te nie produkują funkcjonalnego m -R N A ; u myszy znaleziono nawet „pseudogen” a globiny nieposiadający obu intro- nów. Jakkolw iek wszystkie możliwe funkcje „pseudogenów” nie są znane, ich istnienie sugeruje dynamiczny stan loci genetycznych, którego rezultatem jest zróżnicowanie sekwencji genowych. Te sekwencje mogły być pylą, z której wyłoniły się później nowe funkcjonalnie geny.

Porów nanie sekwencji nukleotydowych genów hemoglobiny wskazuje na dw a modele ewolucji tych genów. Jeden to nagły proces składający się z insercji, delecji i duplikacji, który zachodził przede wszystkim w intronach i sekwencjach flankujących te geny. Drugi to powolne w czasie m utacje punktow e (substytucje pojedynczych nukleotydów), obserwowane przede wszystkim w regionach kodujących białko. Inne typy zmian prowadziły do pow stania niefunkcjonalnych białek [22].

PODSUMOWANIE

Porównawcze studia nad hemoglobiną wskazuj i, że m ożna wyróżnić trzy aspekty ewolucji jej części białkowej. Pierwszy to ewolucja głównych właściwo­ ści funkcjonalnych, ogólnej konform acji łańcuchów, okolicy przyłączania hemu, regionów k ontak tu w utworzonym tetram erze i praw dopodobnie

kieszeni przyłączającej fosforany organiczne. Drugi - wolne, mniej lub bardziej regularne w czasie gromadzenie różnic sekwencyjnych. Większość zmian obserw owano przez porównanie hemoglobiny kręgowców. Trzeci stanow ią m ałe, często pojedyncze zmiany sekwencji aminokwasowej, które mogły dawać drastyczne zmiany we właściwościach funkcjonalnych hemoglobiny, takich jak powinowactwo tlenowe, efekt Bohra, przyłączanie C 0 2, fosforanów organicz­ nych i rozpuszczalność tetram eru. Te m ałe zmiany są często obserwowane między blisko spokrewnionymi gatunkam i i w w ariantach w ew nątrzgatun- kowych (np. hemoglobina S człowieka). W niektórych jednak przypadkach rozpatryw anie typów zmian, jakie zaszły w ewolucji hem oglobiny kręgowców, m oże prowadzić do mylnych wniosków. N a przykład powinowactwo tlenowe głównych hemoglobin człowieka i kury jest zasadniczo identyczne pom im o faktu, że różnice w sekwencji aminokwasowej wynoszą ponad 1/3 ogólnej liczby aminokwasów.

W ostatnich latach dużo doniesień na tem at ewolucji białek opiera się na badaniach sekwencji nukleotydowej genów kodujących te białka i ich sekwen­ cji aminokwasowej. W skazuje to na rosnącą rolę badań ewolucji m olekularnej i m ożna się spodziewać, że wraz z rozwojem i doskonaleniem m etod badawczych najbliższe lata przyniosą rozwiązanie wielu problem ów zasyg­ nalizowanych w tym artykule. P onadto artykuł niniejszy, ograniczony wydaw­ niczo w swej objętości, om awia ogólnie podstawowe zagadnienia dotyczące ewolucji hemoglobiny.

Kb 0 10 ₂₀ 30 40 50 60 70 80

* « < * % * i « * f „

E] III

BI BI n III III

IU

i *1 4 * 4 *

III III III III

a

Podstawowe zagadnienia ewolucji hemoglobin

1 3 13 2 99 100 141

mm

■■

1 30 31 104 105 146

Kb

Rys. 2. Struktura genów a i p globiny człowieka

(IYS-1 i IVS-2 oznaczają introny, eksony oznaczone zostały czarnymi prostokątami) T a b e l a 1 Kontakty między aminokwasami poszczególnych łańcuchów globiny

A. Kontakt a,/}, - dimer. K ontakt łańcucha a z /}.

Nr N r pozycji Aminokwas Aminokwas Nr pozycji Nr

pozycji heliksu heliksu pozycji

1 2 3 4 5 6 30 31 34 35 36 103 B 11 B 12 B 15 B 16 C 4 O 10 Glu Pro H 2 124 Gin H 5 127 Pro H 2 124 Thr H 1 123 Phe GH 15 122 Ala H 6 128 Pro H 3 125 Pro H 2 124 Gin H 9 131 Ala H 6 128 Gin H 9 131 Gin H 9 131 Cys G 14 112 Asn G 10 108

Tabela 1 (cd.) 104 106 107 111 114 117 119 122 123 126 G 11 G 13 G 14 G 18 GH 2 GH 5 H 2 H 5 H 6 H 9 Cys Leu Ala Pro Gin H 5 127 Cys G 14 112 Gly H 5 127 Ala G 17 115 Cys G 14 112 Gly GH 2 119 His G 18 116 Ala G 17 115 His G 18 116 His G 18 116 Cys G 14 112 Arg B 12 30 Met D 6 55 Pro D 2 51 Arg B 15 33 Cys G 14 112 Arg B 12 30 Val B 16 34 Tyr C 1 35 Val B 16 34

B. K ontakt ot1/i1 - dimer. K ontakt łańcucha jl z u.

Pi “ i

Nr pozycji

Nr pozycji heliksu

Aminokwas Aminokwas N r pozycji

heliksu Nr pozycji 1 2 3 4 5 6 ___— Phe GH 5 117 30 B 12 Arg - = m _{--- His H 5 112} 33 B 15 Val --- --- Pro H 2 119 Val - = m _____ Ala H 6 123 34 B 16 ~ --- - Asp H 9 126 35 C 1 Tyr --- --- Asp H 9 126 51 D 2 Pro --- --- Pro H 2 119 55 D 6 M e t--- --- Pro H 2 119

Tabela 1 (cd.) 108 G 10 112 G 14 Asn 115 116 119 122 123 124 125 127 128 131 G 17 G 18 GH 2 GH 5 H 1 H 2 H 3 H 5 H 6 H 9 Ala His Gin His G 10 103 His G 10 103 Leu G 13 106 Val G 14 107 Phe GH 5 117 His H 5 122 Val G 14 107 Ala G 18 111 Ala G 18 111 Pro GH 2 114 Phe GH 5 117 Ala G 18 111 Arg B 12 31 Arg B 12 31 Glu B 11 30 Arg B 12 31 Leu B 15 34 Leu B 15 34 Arg B 12 31 Cys G 11 104 Val G 14 107 Leu B 15 34 Ser B 16 35 Ser B 16 35 Phe C 1 36 His G 10 103

C. Kontakt otiß 2 - dimer. Kontakt łańcucha a z ß - konfiguracja oksy.

“ i ßi

Nr Nr pozycji Aminokwas Aminokwas Nr pozycji Nr

pozycji heliksu heliksu pozycji

1 2 3 4 5 6

37 C 2 Pro --- ---- His HC 3 146

- - Tyr HC 2 145

38 C 3 Thr --- Pro G 2 100

Tabela 1 (cd.) 1 2 3 4 5 6 40 C 5 Lys - - His HC 3 146 42 C 7 Tyr • Asp Arg G 1 C 6 99 40 44 CD 2 Pro - - His FG 4 97 92 FG 4 Arg - --- — Arg Trp C 6 C 3 40 37 94 G 1 Asp • — Glu - Trp G 3 C 3 101 37 95 G 2 Pro ■ Trp C 3 37 96 G 3 Val --- Glu G 3 101 140 HC 2 Tyr --- Trp C 3 37

D. K ontakt a j i 2 - dimer. Kontakt łańcucha a z fi - konfiguracja deoksy.

“ i h

Nr pozycji

Nr pozycji heliksu

Aminokwas Aminokwas Nr pozycji Nr

heliksu pozycji 1 38 41 42 91 92 93 94 95 96 140 C 3 C 6 C 7 FG 3 FG 4 FG 5 G 1 G 2 G 3 HC 2 Thr Thr Tyr Leu His FG 4 97 Val FG 5 98 Arg C 4 40 His FG 4 97 Arg C 6 40 Arg C 6 40 Trp C 3 37 Gin C 5 39 Arg C 6 40 Trp C 3 37 Trp C 3 37 Asn G 4 102 Trp C 3 37 Asp G 1 99 Glu G 3 101 Pro C 2 36 Trp C 3 37 »

Tabela 1 (cd.) E. K ontakt - dimer. Kontakt łańcucha /ł z a - konfiguracja oksy.

Pi a

Nr Nr pozycji Aminokwas Aminokwas Nr pozycji Nr

pozycji heliksu heliksu pozycji

1 2 3 4 5 6 36 37 39 40 97 98 99 101 102 C 2 C 3 C 5 C 6 FG 4 FG 5 G 1 G 3 G 4 Pro Thr Gin Val Asp Glu Asn Tyr HC 2 140 Arg FG 4 92 Val FG 5 93 Asp G 1 94 Pro G 2 95 Tyr HC 2 140 Arg FG 4 92 Thr C 6 41 Tyr C 7 42 Leu FG 3 91 Arg FG 4 92 Thr C 3 38 Thr C 6 41 Thr C 3 38 Val G 3 96 Val G 3 96 Asp G 1 94

F. Kontakt a,/?2 - dimer. Kontakt łańcucha ¡ ¡ z a - konfiguracja deoksy.

h a

Nr Nr pozycji Aminokwas Aminokwas Nr pozycji Nr

pozycji heliksu heliksu pozycji

1 2 3 4 5 6 37 40 97 C 3 C 6 FG 4 Arg FG 4 92 Asp G 1 94 Pro G 2 95 Tyr HC 2 140 Arg FG 4 92 Tyr C 7 42 Thr C 6 41 Pro CD 2 42

Tabela 1 (cd.) 98 FG 5 Val 99 G 1 Asp 100 G 2 Pro 101 G 3 Glu 145 HC 2 Tyr 146 HC 3 His 4 5 Thr C 6 41 Tyr C 7 42 Thr C 3 38 Thr C 3 38 Asp G 1 94 Val G 3 96 THr C 3 38 Pro C 2 37 Lys C 3 40 LITERATURA [1] A g a r N. S., H a r l e y J. D., C i v c a M. A., R o b e r t s J. (1977), Experimentia, 33, 275-276.

[2] A r a k i T., O k a z a k i T., K a j i t a H., S h u k u y a R. (1974), Biochim. Biophys. Acta,

351, 427-436.

[3] A r a t a Y., S e n o Y . , O t s u d a J. (1988), Biochim. Biophys. Acta, 956, 243-255. [4] A t h a D. H., R i g g s A. (1980), [w:] Symposium on Interactions beetwen Iron and Proteins in

Oxygen and Electron Transport.

[5] B u n n H. F. (1980), Amer. Zool., 20, 199-211.

[6] B u n n H. F., F o r g e t B. G., R a n n e y H. M. (1977), [w:] Human Hemoglobins, W.B. Saunders Co., Philadelphia.

[7] C o a t e s M. (1975), J. Mol. Evol., 6, 285-307.

[8] C o a t e s M„ S t o n e S. (1981), J. Mol. Evol., 150, 43-54.

[9] C r a i g C. S., R u c h m a n S. R., B e y c h o k S. (1980), Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 77, 1384-1388.

[10] D e i s s e r o t h A., N i e h u i s A., L a w r a n c e J., T u r n e r P., R u d d l e F. H., (1978), Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 75, 1456-1460.

[11] E f s t r a d i a t i s A., P o s a k o n y J. W., M a n i a t i s T . , L a w n R. M. , O ’ C o - n e l l C., S p r i t z R. A., de R i e l J. K., F o r g e t B. G., W e i s s m a n S. M., S l i g h - t o m J. L., B l e c h l A. E., S m i t h i e s O., B a r a l l e F. E., S h o u l d e r s C. C., P r o u d f o o t N. J. (1980), Cell, 21, 653-668.

[12] E l l i R., G u i j l i a n i A., T e n t o r i L., C h i a n c o n e E., A n t o n i n i E., (1970), Comp. Biochem. Physiol. 36, 163-171.

[13] F o r g e t B. G. (1981), Texas Reports on Biology and Medicine 40, 77-86. [14] G i l b e r t W. (1978), Nature, 274, 501.

[15] G o o d m a n M. (1978), [w:] Evolution o f Protein Molecules, Japan Scientific Societies Press, Center for Academic Pub., Tokyo, 17-32.

[16] G o o d m a n M. (1981), J. Mol. Evol., 17, 114-120.

[17] H o l m q u i s t R., J u k e s T. H., M o i s e H., G o o d m a n M., M o o r e G. W. (1976), J. Mol. Biol., 105, 39-74.

[18] H u n t L. T., H u r s t - C a l d e r o n e S . , D a y h o f f M . O. (1978), [w:] Atlas Protein

Sequence and Structure 5. supp. 3, Nat. Biomed. Res. Found. Washington, 229-249.

[19] K i m u r a M. (1979), Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 76, 3440-3444.

[20] L e d e r P., H a n s e n J. N., K o n k e l D . , L e d e r A., N i s h i o k a Y . , T a l k i n g - t o n C. (1980), Science, 209, 1336-1342. [21] M a r u y a m a T„ W a t t K.. W. K„ R i g g s A. (1980), J. Biol. Chem., 255, 3285-3301. [22] N i s h i o k a Y . , L e d e r P. (1979), Cell, 18, 875-882. [23] P e r u t z M. F. (1970), Nature, 228, 726-739. [24] P e r u t z M. F., K i l m a r t i n J. V., N i s h i k u r a K., F o g g J. M., B u t l e r P. J. G., R o l l e r n a H. S. (1980), J. Mol. Biol., 138, 649-670. [25] P r o u d f o o t M. J., S h a n d l e r M. H. M. , M a n l e y J. L . , G e f t e r M. L., M a n i a - t i s T. (1980), Science, 209, 1329-1336.

[26] R i g g s A. (1972), [w:] Biology o f Lampreys, eds M.W. Hardisty, I.C. Potter, Academic Press, 261-286.

[27] R i g g s A. (1976), Fed. Proc. Amer. Soc. Exp. Biol., 35, 2115-2118. [28] R o s s m a n n M . G., A g r o s P. (1975), J. Biol. Chem., 250, 7525-7532.

[29] S a r i c h V. M., W i l s o n A. C. (1967), Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 58, 142-148. [30] S c h w a r t z R. M., D a y h o f f M. O. (1978), Science, 199, 395-403.

[31] T a k e t a F. (1973), Comp. Biochem. Physiol., 45B, 813-823.

[32] W a g e n b a c h M., O ’ R o u r k e K., V i t e z L., W i e c z o r e k A., H o f f m a n S., D u ­ r f e e S., T e d e s c o J„ S t e t l e r G. (1991), Bio/Technology, 9, 57-61.

[33] W a k a b a y a s h i S., M a t s u b a r a H., W e b s t e r D. A. (1986), Nature, 322, 481-483.

Wpłynęło do Redakcji Folii Katedra Biofizyki Skażeń Środowiska

5.06.1992 r. Uniwersytet Łódzki

Piotr Duchnowicz, Wirgiliusz Duda

FUNDAMENTAL QUESTIONS ON THE EVOLUTION OF HAEMOGLOBIN

The paper presents problems concerning the evolution of haemoglobin. The main stages of Hb evolution: globin gene evolution, formation and solubility of Hb tetramer and functional Hb regulation by allosteric effectors have been presented. The gene duplication, occuring during the formation of fetal and embryonal Hb as well as the evolution rate of vertebrate Hb were discussed. The authors presented the role of exons, introns and pseudogens in the evoluing of globin and discussed the posibility of the acceleration of evolutionary process by means of exon-intron recombinations.