I
GORK
ONIECZNYZespó³ Biologii Molekularnej, Katedra Biologii Molekularnej i Komórkowej Miêdzyuczelniany Wydzia³ Biotechnologii UG/AMG
Uniwersytet Gdañski K³adki 24, 80-822 Gdañsk e-mail: igor@biotech.univ.gda.pl
PLAZMIDY O SZEROKIM ZAKRESIE GOSPODARZY
WSTÊP
Plazmidy s¹ pozachromosomalnymi ele-mentami genetycznymi powszechnie wystê-puj¹cymi w ró¿nych gatunkach bakterii. Pod-stawowymi warunkami zapewniaj¹cymi stabil-ne utrzymywanie siê plazmidu w komórce bak-teryjnej s¹: zdolnoœæ replikacji DNA, kontrola tego procesu oraz w wielu przypadkach syste-my zapewniaj¹ce równomiern¹ segregacjê pla-zmidów w trakcie podzia³u komórkowego. Wiêkszoœæ plazmidów posiada zdolnoœæ do ko-niugacji (transferu plazmidowego DNA pomiê-dzy komórkami bakteryjnymi), co przyczynia
siê do rozprzestrzeniania ró¿norodnych cech istotnych dla metabolizmu bakterii. Miêdzy in-nymi plazmidy zapewniaj¹: opornoœæ na anty-biotyki, opornoœæ na metale ciê¿kie, produkcjê toksyn oraz degradacjê szerokiej gamy zwi¹zków toksycznych. Ze wzglêdu na ³atwoœæ izolacji, prostotê manipulacji genetycznych i stosunkowo ³atw¹ analizê w warunkach labo-ratoryjnych in vitro, systemy plazmidowe sta³y siê modelowymi w badaniach procesu replika-cji DNA.
PLAZMIDY O SZEROKIM ZAKRESIE GOSPODARZY
Wiêkszoœæ plazmidów posiada kolist¹, su-perzwiniêt¹ strukturê, natomiast liniow¹ for-mê posiadaj¹ plazmidy wyizolowane z niektó-rych gatunków bakterii z rodzaju Streptomyces sp. czy Borrelia sp. Uwa¿a siê, ¿e wiêkszoœæ zmidów nale¿y do grupy okreœlanej jako pla-zmidy o w¹skim zakresie gospodarza (ang. nar-row-host-range) i jest zdolna do replikacji DNA oraz transferu tylko w jednym, okreœlonym ga-tunku bakterii. W odró¿nieniu od tej grupy, plazmidy okreœlane jako plazmidy o szerokim zakresie gospodarzy (ang. broad-host-range)
posiadaj¹ zdolnoœæ do replikacji i stabilnego utrzymywania siê w wielu, czêsto nie spokrew-nionych gatunkach bakterii. DNA plazmidów o szerokim zakresie gospodarzy mo¿e równie¿ byæ przekazywane na drodze koniugacji z ko-mórki jednego gatunku bakterii do koko-mórki in-nego gatunku bakterii, staj¹c siê tym samym czynnikiem horyzontalnego transferu genów (THOMASi HELINSKI1989, THOMAS1996). Wy-kazano, ¿e zdolnoœæ koniugacji nie jest ograni-czona jedynie do transferu pomiêdzy komórka-mi bakteryjnykomórka-mi, ale równie¿ dotyczy transferu
Numer 3
(256)
Strony 273–281
Prowadzone przez nasz zespó³ badania nad molekularnymi mechanizmami zwi¹zanymi z metabolizmem DNA plazmidów o szerokim zakresie gospodarzy, nale¿¹cymi do grupy IncP, finansowane s¹ ze œrodków Komitetu Ba-dañ Naukowych oraz z funduszy Europejskiej Organizacji Biologii Molekularnej.
DNA z bakterii do komórek eukariotycznych (HEINEMANNi SPRAGUE1989). Kilka dobrze ge-netycznie scharakteryzowanych plazmidów z grupy niezgodnoœci IncP1 (RK2), IncQ (RSF1010), IncW (pSa) i IncN (pCU1) utrzymu-je siê stabilnie w ro¿nych gatunkach bakterii (DEL SOLAR i wspó³aut. 1993, 1996, 1998;
HELINSKI i wspó³aut. 1996). Wykazano rów-nie¿, ¿e niektóre z naturalnie wystêpuj¹cych plazmidów izolowanych w œrodowisku mor-skim s¹ w stanie utrzymywaæ siê w wielu nie spokrewnionych ze sob¹ gatunkach bakterii (SOBECKY i wspó³aut. 1998)
STRUKTURA ORIGIN I MECHANIZM REPLIKACJI DNA
Do tej pory badania replikacji plazmidowe-go DNA ograniczone by³y g³ównie do grupy plazmidów o w¹skim zakresie gospodarzy i bakterii Escherichia coli jako gospodarza dla tych plazmidów. Mimo du¿ej ró¿norodnoœci replikonów plazmidowych opisano dwa pod-stawowe schematy inicjacji replikacji kolistego plazmidowego DNA. Pierwszy zak³ada regula-cjê inicjacji replikacji poprzez antysensown¹ cz¹steczkê RNA, która poprzez hybrydyzacjê reguluje czêstoœæ inicjacji (DEL SOLAR i wspó³aut. 1998, HELINSKI i wspó³aut.1996). Przyk³ady tego typu inicjacji replikacji to pla-zmidy z grupy ColEI oraz plapla-zmidy RC (ang. rol-ling circle) takie jak pT181, pUB110 czy pMV158, których replikacja zachodzi wed³ug modelu s (tocz¹cego siê ko³a). Drugi mecha-nizm inicjacji replikacji plazmidowego DNA dotyczy plazmidów koduj¹cych w³asne bia³ka inicjatorowe (Rep), które wi¹¿¹ siê do specy-ficznych powtórzonych sekwencji (iteronów) w obrêbie miejsca startu replikacji plazmido-wego DNA (ang. origin, ori), a ich replikacja za-chodzi wed³ug modelu q. Do intensywnie ba-danych plazmidów tej grupy nale¿¹ miêdzy in-nymi P1, F, R6K, pSC101 i RK2. Zaproponowa-no dwie strategie inicjacji replikacji plazmi-dów o szerokim zakresie gospodarza: (i) inicja-cja replikacji niezale¿na od bia³ek replikacyj-nych gospodarza oraz (ii) inicjacja replikacji, podczas której dochodzi do wspó³dzia³ania re-plikacyjnych czynników plazmidowych z ko-mórkowym aparatem replikacyjnym (DEL SOLAR i wspó³aut. 1996).
Charakterystyczn¹ cech¹ wiêkszoœci miejsc inicjacji replikacji replikonów (autonomicz-nych jednostek replikacyj(autonomicz-nych takich jak cz¹steczki plazmidów, chromosomy, DNA wi-rusów czy bakteriofagów) jest wystêpowanie struktur bogatych w reszty tyminy i adeniny (rejony A+T). W miejscach tych dochodzi do destabilizacji dwuniciowej struktury DNA, co rozpoczyna proces replikacji i jest warunkiem zwi¹zania helikazy, która rozwija dwuniciow¹
matrycê DNA umo¿liwiaj¹c w ten sposób utworzenie i propagacjê kompleksu replikacyj-nego. Origin mo¿e równie¿ posiadaæ rejon bo-gaty w reszty guaniny i cytozyny (rejon G+C). Innym charakterystycznym elementem origin replikacji s¹ wielokrotnie powtórzone se-kwencje-iterony. Szeroka grupa plazmidów po-siada te sekwencje, które s¹ miejscami wi¹za-nia, kodowanego przez plazmid, bia³ka ini-cjuj¹cego proces replikacji DNA (Rep). Wyka-zano, ¿e iterony wystêpuj¹ w origin replikacji plazmidów o szerokim zakresie gospodarzy na-le¿¹cych miêdzy innymi do grup IncQ oraz IncP (Ryc. 1). Iloœæ sekwencji powtórzonych mo¿e wp³ywaæ na stabilnoœæ DNA plazmidu w okreœlonych gatunkach bakterii (S CHMID-HAUSER i wspó³aut. 1983). Oprócz miejsc wi¹zania plazmidowego bia³ka Rep origin mo¿e zawieraæ jedn¹ b¹dŸ kilka sekwencji spe-cyficznych dla wi¹zania bakteryjnego bia³ka DnaA (sekwencje DnaA-box). Bia³ko E. coli DnaA jest czynnikiem inicjuj¹cym replikacjê DNA chromosomalnego, jakkolwiek wykaza-no, ¿e mo¿e tworzyæ kompleksy w origin ró¿-nych plazmidów. Geny koduj¹ce bia³ko DnaA znaleziono w wiêkszoœci bakterii i wykazuj¹ one znaczny stopieñ podobieñstwa (KAGUNI 1997, MESSERi wspó³aut. 2001). Wykazano, ¿e w przypadku plazmidów IncP sekwencje Dna-A-box warunkuj¹ mo¿liwoœæ replikacji plazmi-dów w niektórych gatunkach bakterii, podczas gdy w innych gatunkach bakterii nie s¹ absolut-nie absolut-niezbêdne w procesie inicjacji replikacji DNA plazmidu (DORAN i wspó³aut. 1999a,b). W odró¿nieniu od plazmidów IncP, origin re-plikacji plazmidów IncQ (RSF1010) nie zawie-ra sekwencji DnaA-box. Inicjacja replikacji DNA tych plazmidów nie wymaga udzia³u bia³ek bakteryjnych, w tym bakteryjnego bia³ka DnaA, i zachodzi jedynie przy udziale plazmidowych bia³ek replikacyjnych wed³ug mechanizmu typu oddzielania nici (ang. strand displacement) (SCHERZINGERi wspó³aut. 1991, 1997). Plazmid RSF1010 oprócz iteronów w
re-jonie inicjacji replikacji, zawiera dwie palin-dromowe sekwencje ssiA oraz ssiB, z których niezale¿nie mo¿e zachodziæ synteza DNA. Ko-dowane przez plazmid bia³ko RepC wi¹¿¹c siê do sekwencji iteronów owiera strukturê origin (powoduje miejscow¹ destabilizacjê dwuni-ciowej helisy DNA), co pozwala na zwi¹zanie plazmidowej helikazy RepA i w konsekwencji rozwiniêcie helisy DNA, oddzielenie nici sta-nowi¹cej matrycê dla syntezy. Synteza DNA rozpoczyna siê w sposób losowy w jednych cz¹steczkach plazmidowego DNA w miejscu
ssiA, a w innych w ssiB i powoduje powstanie specyficznej struktury typu D-loop. W wyniku tego procesu powstaje jedna dwuniciowa oraz jedna jednoniciowa cz¹stka plazmidowego DNA, która zosta³a oddzielona od matrycy. Na-le¿y podkreœliæ, ¿e w inicjacji replikacji RSF1010 uczestnicz¹ jedynie bia³ka kodowane przez plazmid. Przypuszcza siê, ¿e kodowanie przez plazmid w³asnych bia³ek replikacyjnych i niezale¿noœæ inicjacji replikacji DNA RSF1010 od czynników bakteryjnych jest jednym z istot-nych elementów nadaj¹cych plazmidom z
gru-Ryc. 1. Model inicjacji replikacji DNA plazmidów o szerokim zakresie gospodarzy posiadaj¹cych wie-lokrotnie powtórzone sekwencje — iterony.
Model przedstawia mechanizmy inicjacji replikacji plazmidów nale¿¹cych do grupy IncP oraz IncQ. Podczas ini-cjacji replikacji plazmidów IncP dochodzi do wi¹zania inicjatorowego bia³ka plazmidowego z wielokrotnie po-wtórzonymi iteronami. Dochodzi do destabilizacji (otwarcia) dwuniciowej truktury DNA. Wi¹zanie i aktywnoœæ bakteryjnej helikazy w rozwijaniu helisy DNA wymaga udzia³u bia³ek bakteryjnych DnaA i DnaC. Bakteryjna pri-maza syntetyzuje startery do replikacji DNA która zachodzi jednokierunkowo na obydwu niciach (synteza nici wiod¹cej i opó¿nionej). W wyniku jednej rundy replikacji powstaj¹ dwie dwuniciowe cz¹steczki plazmidowego DNA. Inicjacja replikacji plazmidów IncQ nie wymaga udzia³u bia³ek bakteryjnych. Wi¹zanie plazmidowego bia³ka inicjatorowego RepC destabilizuje strukturê DNA co pozwala na wi¹zanie plazmidowych bia³ek helikazy RepA oraz primazy RepB w jednym z dwóch miejsc inicjacji replikacji. Helikaza oddziela jedn¹ z macierzystych nici DNA (ang. strand displacement) co pozwala na ci¹g³¹ syntezê DNA z wykorzystaniem bakteryjnych polime-raz DNA. W wyniku tego procesu powstaje jedna dwuniciowa opolime-raz jedna jednoniciowa cz¹stka DNA, która na-stêpnie s³u¿y jako matryca do syntezy nici komplementarnej.
py IncQ mo¿liwoœæ replikacji i utrzymywania siê w wielu gatunkach bakterii.
DNA plazmidów nale¿¹cych do grupy RC (ang. rolling circle) mo¿e zachodziæ zarówno w bakteriach Gram-dodatnich, jak i Gram-u-jemnych, zawiera dwa miejsca inicjacji (dso — ang. double-strand-origin oraz sso — ang. single strand origin) (KHAN2000). Inicjacja replikacji tych plazmidów rozpoczyna siê od wi¹zania plazmidowego bia³ka Rep w dwuniciowym origin dso (Ryc. 2). Wi¹zanie to generuje
struk-turê g³ówki od szpilki (ang. hairpin) a nastêp-nie naciêcie dso przez bia³ko Rep. Kolejnym etapem jest wi¹zanie helikazy i synteza nici wiod¹cej (z wykorzystaniem 3’OH wolego ko-ñca powsta³ego na skutek nukleolitycznej ak-tywnoœci Rep), w wyniku której powstaje jed-noniciowa cz¹steczka DNA. Ten intermediat replikacyjny zawieraj¹cy sso jest substratem dla syntezy nici opóŸnionej z udzia³em bakte-ryjnej polimerazy RNA (synteza starterów) i holoenzymu DNA polimerazy III. Ostatnio za-proponowano, ¿e specyficzne przejœcie z syn-tezy jednoniciowego intermediatu na syntezê plazmidowej cz¹steczki dwuniciowej mo¿e byæ istotnym elementem nadaj¹cym plazmi-dom RC mo¿liwoœæ replikacji w wielu gatun-kach bakterii (KHAN 2000).
Do grupy plazmidów IncP nale¿y plazmid RK2 (identyczny z plazmidem RP4), który jest du¿ym kolistym plazmidem (60kpz) wystê-puj¹cym w szeregu bakteriach z rodziny Ente-robacteriace, Agrobacterium sp., Azotobacter sp., Bordetella sp., Vibrio sp., Methophilus sp., Pseudomonas sp., Acidobacter sp., Caulobac-ter sp., Neisseria sp., Legionella sp.,
Acetobac-ter sp., Rhizobium sp., Rhodopseudomonas sp., Alcaligens sp., Azospirillum sp., Thiobacil-lus sp., Xanthomonas sp. (PANSEGRAUi LANKA 1996, THOMASi HELINSKI1989). Pierwotnie zo-sta³ zidentyfikowany jako czynnik nadaj¹cy opornoœæ na antybiotyki patogennej bakterii Pseudomonas aeruginosa wyizolowanej z ran pooparzeniowych pacjentów jednego z brytyj-skich szpitali (LOWBURY i wspó³aut.1969). Zi-dentyfikowano go równie¿ jako pozachromo-somalny element bakterii patogennych roœlin.
RK2 jest wiêc nie tylko atrakcyjny jako modelo-wy system w badaniach podstawomodelo-wych, ale równie¿ badania nad RK2 mog¹ doprowadziæ do uzyskania wyników o walorach aplikacyj-nych. Ostatnie lata przynosz¹ coraz wiêcej in-formacji dotycz¹cych molekularnych mechani-zmów czyni¹cych plazmid RK2 zdolnym do utrzymywania siê i propagacji w ró¿nych ga-tunkach bakterii. W przypadku plazmidu RK2 jedynie dwa czynniki kodowane w DNA pla-zmidowym uczestnicz¹ w inicjacji replikacji jego DNA. S¹ to: rejon inicjacji replikacji (oriV) oraz bia³ko inicjatorowe TrfA (FIGURSKI i HELINSKI 1979, THOMAS i wspó³aut. 1980). Bia³ko inicjatorowe TrfA syntetyzowane jest w dwóch formach: o d³ugoœci 44kDa (TrfA-44) oraz 33kDa (TrfA-33). Krótka forma bia³ka (TrfA-33) jest wystarczaj¹ca do inicjacji repli-kacji RK2 w E. coli i szeregu innych bakterii. Inicjacja replikacji RK2 w P. aeruginosa wyma-ga d³u¿szej formy TrfA-44 (DURLANDi HELINSKI 1987). W obrêbie minimalnej sekwencji origin RK2 znajduje siê piêæ miejsc wi¹zania bia³ka TrfA: cztery miejsca wi¹zania bakteryjnego bia³ka DnaA oraz rejon bogaty w pary A+T i
re-Ryc. 2. Model replikacji DNA plazmidów RC.
DNA plazmidów o szerokim zakresie gospodarzy nale¿¹cych do grupy RC (ang. rolling circle) zawieraj¹ dwa rejo-ny inicjacji replikacji. Inicjacja replikacji DNA rozpoczyna siê poprzez wi¹zanie bia³ka inicjatorowego w rejonie dso (ang. double strand origin), naciêcie jednej z nici DNA i syntezê nici potomnej wed³ug modelu tocz¹cego siê ko³a. W wyniku tej syntezy powstaje jedna dwuniciowa cz¹steczka plazmidu oraz jedna jednoniciowa, której re-plikacja zachodzi przy udziale polimeraz RNA i DNA z rejonu sso (ang. single strand origin).
jon bogaty w pary G+C (KONIECZNYi wspó³aut. 1997). Minimalna sekwencja origin RK2 jest wystarczaj¹ca do inicjacji replikacji w E. coli oraz innych bakteriach Gram-ujemnych. Pozo-sta³e bia³ka niezbêdne w procesie replikacji to bia³ka bakteryjne (PINKEY i wspó³aut. 1988, KITTELLi HELINSKI1991). Uda³o siê zrekonstru-owaæ in vitro, z wykorzystaniem oczyszczo-nych enzymów, reakcjê replikacji RK2 (KONIECZNYi HELINSKI1997a). Proces ten wy-maga matrycy DNA zawieraj¹cej oriV, oczysz-czonego bia³ka inicjatorowgo TrfA oraz bia³ek E.coli: DnaA, helikazy DnaB, bia³ka DnaC, pri-mazy DnaG, gyrazy, SSB — bia³ka wi¹¿¹cego po-jedyncz¹ niæ DNA i holoenzymu polimerazy DNA III. Podczas inicjacji replikacji RK2 do-chodzi do wi¹zania bia³ka inicjatorowego TrfA do iteronów (PERRIi wspó³aut. 1991). Powsta-je kompleks inicjacyjny. Podobnie jak inne pla-zmidowe bia³ka inicjatorowe, TrfA wystêpuje w postaci dimeru, jednak do DNA wi¹¿e siê jako monomer. Wykazano, ¿e bia³ko opiekuñ-cze E. coli ClpX aktywuje TrfA podczas inicjacji replikacji (KONIECZNYi HELINSKI1997b). Akty-wacja ta polega na monomeryzacji dimerycz-nej formy bia³ka TrfA. Podobne wyniki otrzy-mano dla bia³ka inicjatorowego plazmidu P1 (RepA), które jest aktywowane przez bia³ka opiekuñcze DnaK, DnaJ, GrpE oraz ClpP (KONIECZNY i ¯YLICZ 1999). Ostatnio stwier-dzono, ¿e inne bia³ko ClpB (nale¿¹ce do rodzi-ny Hsp100) wraz z bia³kami opiekuñczymi DnaK, DnaJ i GrpE tworzy alternatywny system aktywuj¹cy TrfA (KONIECZNYi LIBEREK2002). Wydaje siê, ¿e proces aktywacji nie jest ograni-czony jedynie do bakterii E. coli i aktywacja TrfA w innych gatunkach bakterii zachodzi z udzia³em homologicznych lub/i analogicznych systemów bia³ek opiekuñczych.
Bia³ko TrfA wi¹¿¹c siê z sekwencjami itero-nów powoduje destabilizacjê podwójnej helisy DNA w obrêbie rejonu bogatego w pary A+T (KONIECZNYi wspó³aut. 1997). W odró¿nieniu od inicjacji replikacji w oriC, bia³ko DnaA E. coli nie jest czynnikiem odpowiedzialnym za powstanie kompleksu otwartego RK2, a jedy-nie stabilizuje t¹ strukturê. Nasze badania wy-kaza³y, ¿e równie¿ bia³ka homologiczne DnaA wyizolowane z bakterii Pseudomonas sp. stabi-lizuj¹ strukturê kompleksu otwartego oriV. W odró¿nieniu, bia³ka DnaA Bacillus subtilis i Streptomyces lividans nie stabilizuj¹ tej struk-tury (CASPIi wspólaut. 2000). Przypuszcza siê, ¿e mo¿e to byæ jeden z czynników uniemo¿li-wiaj¹cych inicjacjê replikacji DNA RK2 w
bak-teriach Gram dodatnich. Otwarcie struktury origin jest warunkiem zwi¹zania helikazy, któ-ra po utworzeniu kompleksu z jedn¹ z nici DNA rozwija dwuniciow¹ helisê DNA.
Mechanizm wi¹zania helikazy i aktywacji kompleksu helikazy niesie wiele pytañ i to bez wzglêdu na badany system. Praktycznie dla ¿adnego modelu badawczego, prokariotyczne-go czy eukariotyczneprokariotyczne-go, nie poznano w pe³ni mechanizmu tworzenia kompleksu preprimo-somu — wi¹zania helikazy do DNA (BAKER i BELL 1998, EGELMAN 1998). Nie wiadomo w jaki sposób najczêœciej pierœcieniowe, heksa-meryczne struktury helikaz replikacyjnych wi¹¿¹ siê z DNA. Obecnie za najbardziej praw-dopodobne uwa¿a siê otwarcie struktury pierœ-cienia i ponowne jej zamkniêcie z jednonicio-wym DNA znajduj¹cym siê w œrodku heksame-ru. W ostatnich latach uda³o siê uzyskaæ pierw-sze opisy struktury niektórych helikaz replika-cyjnych (PATELi PICHA2000). Co ciekawe, do tej pory znajomoœæ budowy krystalicznej nie spowodowa³a prze³omu w rozumieniu bioche-micznego mechanizmu rozwijania podwójnej helisy DNA. W badaniach replikacji chromoso-mu E. coli oraz plazmidowych systemów specy-ficznych dla tej bakterii, opisano szereg istot-nych oddzia³ywañ bia³ek replikacyjistot-nych z heli-kaz¹ DnaB E. coli. Wykazano, ¿e helikaza E. coli tworzy kompleks z bia³kiem inicjatorowym DnaA (MARSZA£EK i KAGUNI 1994). Od-dzia³ywanie to jest istotne dla powstania kom-pleksu preprimosomu i w konsekwencji po-zwala na wi¹zanie helikazy z jednoniciowym DNA w rejonie A+T w obrêbie kompleksu otwartego oriC. Równie¿ bia³ka inicjatorowe plazmidów, pSC101 i R6K, tworz¹ kompleksy z helikaz¹ (RATNAKAR i wspó³aut. 1996, LU i wspólaut.1998, DATTA i wspólaut. 1999). Od-dzia³ywania te s¹ niezbêdne w inicjacji replika-cji DNA tych plazmidów, jednak rola bakteryj-nego bia³ka DnaA na tym etapie inicjacji repli-kacji pozostaje nie wyjaœniona. Sugeruje siê, ¿e oddzia³ywanie bia³ek DnaA-DnaB nie jest kry-tyczne dla replikacji plazmidowego DNA pSC101 i R6K w E. coli.
Wykazano ponadto, ¿e w odró¿nieniu od plazmidów pSC101 i R6K, w przypadku RK2 inicjacja replikacji DNA tego plazmidu w ko-mórkach bakteii E. coli jest zale¿na od od-dzia³ywania DnaA-DnaB (KONIECZY i HELINSKI 1997a). Etapem poœrednim jest kompleks heli-kazy DnaB, zawieraj¹cy równie¿ bia³ka DnaA i DnaC, obserwowany w rejonie sekwencji Dna-A-box (PACEKi wspó³aut. 2001). Helikaza DnaB
przy udziale TrfA ulega translokacji do rejonu otwartego A+T. Interesuj¹ce okaza³y siê badania z wykorzystaniem helikaz wyizolowanych z bakterii P. putida i P. aeruginosa. W odró¿nie-niu od helikazy E. coli bia³ka te wi¹¿¹ siê w oriV i s¹ aktywne w rozwijaniu matrycy RK2 bez udzia³u dodatkowego czynnika ATP-azy DnaC (CASPI i wspó³aut. 2001). Do tej pory uwa¿ano, ¿e udzia³ bia³ek posiadaj¹cych aktywnoœæ ATP-a-zy podczas wi¹zania replikacyjnych helikaz do DNA jest uniwersalny i zachowany w toku
ewo-lucji. Co wiêcej, badania nasze wykaza³y, ¿e w odró¿nieniu od helikazy E. coli, helikazy Pseu-domonas sp. tworz¹ kompleks z d³u¿sz¹ form¹ bia³ka TrfA zwi¹zan¹ z iteronami, a utworzenie takiego kompleksu oraz aktywnoœæ helikazy nie wymaga udzia³u bia³ka DnaA (Ryc. 3). Wyniki te
s¹ zgodne z obserwacjami in vivo, w których mutanty delecyjne rejonu DnaA-box oriV wyka-zywa³y aktywnoœæ replikacyjn¹ w P. aerugino-sa, ale nie w E. coli (DORANi wspólaut. 1999b), a replikacja RK2 w P. aeruginosa wymaga udzia³u d³u¿szej formy TrfA i, w odró¿nieniu od replikacji w E. coli nie jest inicjowana przez krótk¹ formê TrfA. Plazmid RK2, w zale¿noœci od gatunku bakterii, wykorzystuje odmienne mechanizmy inicjacji replikacji. Wydaje siê wiêc, ¿e zdolnoœæ inicjacji replikacji DNA RK2
w ró¿nych gatunkach bakterii wynika z uniwer-salnoœci struktur origin tego plazmidu i wyko-rzystywaniu ró¿nych typów gatunkowo-specy-ficznych oddzia³ywañ pomiêdzy dwoma forma-mi plazforma-midowego bia³ka TrfA a bakteryjnyforma-mi bia³kami replikacyjnymi.
SYSTEMY ZAPEWNIAJ¥CE RÓWNOMIERNY ROZDZIA³ CZ¥STEK PLAZMIDOWYCH ORAZ PLAMIDOWE SYSTEMY PROGRAMOWANEJ ŒMIERCI KOMÓRKI
Inicjacja replikacji i synteza DNA nie s¹ je-dynymi procesami zapewniaj¹cymi
plazmi-dom o szerokim zakresie gospodarzy bytowa-nie w ró¿nych gatunkach bakterii. Jak ju¿
Ryc. 3. Mechanizm inicjacji replikacji plazmidu RK2 w bakteriach Escherichia coli i Pseudomonas
ae-ruginosa.
Plazmid wykorzystuje odmienne, gatunkowo specyficzne mechanizmy wi¹zania bakteryjnej helikazy. Podczas inicjacji replikacji RK2 w E. coli niezbêdne jest oddzia³ywanie helikazy DnaB z bia³kiem DnaA. Utworzenie kom-pleksu helikazy w origin plazmidu wymaga te¿ udzia³u bia³ka DnaC. Podczas inicjacji replikacji RK2 w P. aerugi-nosa wi¹zanie helikazy jest DnaA i DnaC niezale¿ne. Helikaza tworzy kompleks z d³u¿sz¹ form¹ plazmidowego bia³ka TrfA zwi¹zanego w rejonie iteronów.
wspomnia³em, jednym z procesów niezbêd-nych do rozprzestrzeniania siê plazmidowych cz¹steczek DNA w populacji bakterii tego sa-mego gatunku lub pomiêdzy ró¿nymi gatunka-mi bakterii jest proces koniugacji. Procesagatunka-mi niezbêdnymi do stabilnej propagacji plazmido-wego DNA jest rozdzia³ multimerycznych cz¹steczek plazmidowych (ang. multimer reso-lution systems, mrs), rozdzia³ plazmidów do komórek potomnych (ang. partitioning) oraz plazmidowe systemy programowanej œmierci komórki (post segregational killing, psk). Obecnie procesy zwi¹zane z dynamik¹ plazmi-dowego DNA s¹ intensywnie analizowane przez wiele grup badawczych (HIRAGA 2000, GORDON i WRIGHT 2000, MOLLER-JENSEN i wspó³aut. 2000). Okaza³o siê, ¿e cz¹steczki
pla-zmidowe zgrupowane s¹ w œciœle okreœlonych miejscach w komórce bakteryjnej i ulegaj¹ par-tycji w trakcie cyklu komórkowego. Molekular-ny mechanizm tych procesów nie jest w pe³ni poznany. Systemy psk, oparte zazwyczaj na ko-dowanych przez plazmid toksynie i antytoksy-nie, eliminuj¹ z populacji komórki bakteryjne, które utraci³y plazmid zapewniaj¹c w ten spo-sób stabilne utrzymywanie plazmidu w popu-lacji bakterii. Nale¿y podkreœliæ, ¿e systemy partitioning, mrs czy psk kodowane przez pla-zmidy o szerokim zakresie gospodarza, takie jak RK2, doskonale spe³niaj¹ swoj¹ rolê w wie-lu gatunkach bakterii. Molekularny mecha-nizm czy mechamecha-nizmy tych procesów nie zo-sta³y w pe³ni poznane.
PODSUMOWANIE
Plazmidy o szerokim zakresie gospodarzy ze wzglêdu na sw¹ specyfikê stanowi¹ bardzo interesuj¹cy obiekt badawczy. Dopiero teraz zaczynamy poznawaæ kompleksowoœæ tych po-zachromosomalnych elementów genetycz-nych. Co wiêcej, mo¿liwe staje siê wykorzysta-nie zdobywanej wiedzy w biotechnologii. Pla-zmidy o szerokim zakresie gospodarzy s¹ wy-korzystywane jako wektory pomiêdzy komór-kami prokariotycznymi i eukariotycznymi. Sto-suje siê je równie¿ jako systemy ekspresji ge-nów, w których precyzyjnie regulowana jest iloœæ kopii matrycy DNA. Poznanie
mechani-zmów replikacji DNA w wielu gatunkach bak-terii, oprócz aspektu czysto poznawczego, mo¿e pozwoliæ na konstrukcjê nowych leków antybakteryjnych. Interesuj¹ca wydaje siê mo-¿liwoœæ wykorzystania plazmidowych syste-mów programowanej œmierci komórki w wal-ce z patogennymi drobnoustrojami. Plazmidy o szerokim zakresie gospodarzy mog¹ stwo-rzyæ mo¿liwoœci konstruowania uniwersal-nych, specyficznych wzglêdem wielu gatun-ków bakterii, œrodgatun-ków farmakologicznych no-wej generacji.
BROAD-HOST RANGE PLASMIDS
S u m m a r y Broad-host-range plasmids are model systems for
exploring replication mechanisms in diverse bacterial species and can extend our understanding of univer-sal rules guiding DNA metabolism. Despite extensive work carried out in many laboratories, several critical aspects of the plasmid DNA metabolism still remain unclear. This review is restricted to specification of the molecular events during theta replication initia-tion of the iteron containing broad-host-range
plasmids. The discussion concerns RC (rolling circle) broad-host-range plasmids replicating via sigma mode and the well biochemically characterized initiation of replication at Escherichia coli oriC. Recent extensive biochemical investigations of replication initiation of narrow-host-range plasmids: pSC101, R1, P1, F, R6K, and broad-host- range plasmids RSF1010 and RK2 al-low us to discuss the specificity of DNA replication ini-tiation at broad-host- range origins.
LITERATURA
BAKERT. A., BELLS. P., 1998. Polymerases and the repli-some: Machines within machines. Cell 92, 295–305.
CASPIR., HELINSKID. R., PACEKM., KONIECZNYI., 2000. Interactions of DnaA proteins from distantly rela-ted bacteria with the replication origin of the
bro-ad host range plasmid RK2. J. Biol. Chem. 275, 18454–18461.
CASPI R., PACEK M., CONSIGLIERI G., HELINSKI D. R., TOUKDARIANA., KONIECZNYI., 2001. A broad host range replicone with diffrent requirements for re-plication initiation in three bacterial species. EMBO J. 20, 3262–3271.
DATTAH. J., KHATRIG. S., BASTIAD., 1999. Mechanism of recruitment of DnaB helicase to the replication origin of the plasmid pSC101. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 73–78.
DELSOLARG., MOSCOSOM., ESPINOSAM., 1993. Rolling circle–replicating plasmids from Gram-positive and Gram-negative bacteria: A wall falls. Mol. Microbiol. 8, 789–796.
DELSOLARG., ALONSOJ. C., ESPINOSAM., DIAZ-OREJASR., 1996. Broad-host-range plasmid replication: An open question. Mol. Microbiol. 21, 661–666. DEL SOLAR G., GIRALDO R., RUIZ-ECHEVARRIA M. J.,
ESPINOSAM., DIAZ-OREJASR., 1998. Replication and control of circular bacterial plasmids. Microbiol. Molec. Biol. Rev. 62, 434–464.
DORANK. S., HELINSKID. R., KONIECZNYI., 1999a. A criti-cal DnaA box directs the cooperative binding of the Escherichia coli DnaA protein to the plasmid RK2 replication origin. J. Biol. Chem. 274, 17918–17923.
DORAN K. S., HELINSKID. R., KONIECZNYI., 1999b. Ho-st-dependent requirement for specific DnaA boxes for plasmid RK2 replication. Mol. Microbiol. 33, 490–498.
DURLANDR. H., HELINSKID. R., 1987. The sequence enco-ding the 43-kilodalton trfA protein is required for efficient replication or maintenance of minimal RK2 replicons in Pseudomonas aeruginosa. Pla-smid 18, 164–9.
EELMANE. H., 1998. Bacterial Helicases. J. Struct. Biol. 124, 123–128.
FIGURSKID. H., HELINSKID. R., 1979. Replication of an origin-containing derivative of plasmid RK2 de-pendent on a plasmid function provided in trans. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 1648–52.
GORDONS., WRIGHTA., 2000. DNA Segregation in Bac-teria. Ann. Rev. Microbiol. 54, 681–708
HEINEMANN J. A., SPRAGUE Jr. G. F., 1989. Bacterial conjugative plasmids mobilize DNA transfer be-tween bacteria and yeast. Nature 340, 205–209. HELINSKID. R., TOUKDARIANA. E., NOVICKR. P., 1996. Re-plication control and other stable maintenance mechanisms of plasmids. [W:] Excherichia coli and Salmonella, cellular and molecular biology. NEIDHARDT, F. C. (red.). ASM Press, Washington, D. C., 2, 2295–2324.
HIRAGA S., 2000. Dynamic Localyzation of Bacterial and Plasmid Chromosomes. Ann. Rev. Genet. 34, 21–59.
KAGUNIJ. M., 1997. Escherichia coli DnaA protein: the replication initiator. Mol. Cell. 7, 145–157. KHANS. A., 2000. Plasmid rolling-circle replication:
re-cent developments. Mol. Microbiol. 37, 477–484. KITTELLB. L., HELINSKID. R., 1991. Iteron inhibition of plasmid RK2 replication in vitro: evidence for in-termolecular coupling of replication origins as a mechanism for RK2 replication control. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 1389–93.
KONIECZNYI., HELINSKID. R., 1997a. Helicase delivery and activation by DnaA and TrfA proteins during the initiation of replication of the broad host ran-ge plasmid RK2. J. Biol. Chem. 272, 33312–33318. KONIECZNYI., HELINSKID. R., 1997b. The replication
ini-tiation protein of the broad-host-range plasmid
RK2 is activated by the ClpX chaperone. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 14378–14382.
KONIECZNYI.,¯YLICZM., 1999. Role of bacterial chape-rones in DNA replication. Kluwer Academic/Ple-num Publishers, New York.
KONIECZNYI., LIBEREKK., 2002. Cooperative action of Escherichia coli ClpB protein and DnaK chapero-ne in the activation of a replication initiation pro-tein. J. Biol. Chem. 277, 18483–18488.
KONIECZNYI., DORAN K. S., HELINSKID. R., BLASINAA., 1997. Role of TrfA and DnaA proteins in origin opening during initiation of DNA replication of the broad host range plasmid RK2. J. Biol. Chem. 272, 20173–20178.
LOWBURYE. J. L., KIDSONA., LILLYH. A., AYLIFFEEG. A. J., JONESR. J., 1969. Sensitivity of Pseudomonas aeru-ginosa to antibiotics: emergence of strains highly resistant to carbenicillin. Lancet 448–452. LUY. -B., DATTAH. J., BASTIAD., 1998. Mechanistic
stu-dies of initiator-initiator interaction and replica-tion initiareplica-tion. EMBO J. 17, 5192–5200.
MARSZA£EKJ., KAGUNIJ. M., 1994. DnaA Protein Directs
the Binding of DnaB Protein in Initiation of DNA Replication in Escherichia coli. J. Biol. Chem. 269, 4883–4890.
MESSERW., BLAESINGF., JAKIMOWICZD., KRAUSEM., MAJKA J., NARDMANN J., SCHAPER S., SEITZ H., SPECK C., WEIGELC., WEGRZYNG., WELZECKM., ZAKRZEWSKA -CZERWINSKA J., 2001. Bacterial replication initia-tor DnaA. Rules for DnaA binding and roles of DnaA in origin unwinding and helicase loading. Biochimie 83, 5–12.
MOLLER-Jansen J., JENSENR. B., Gerdes K., 2000. Plasmid and chromosome segregation in prokaryotes. Trends Microbiol. 8, 313–320.
PACEKM., KONOPA G., KONIECZNYI., 2001. DnaA Box Sequences as the Site for Helicase Delivery during Plasmid RK2 Replication in Escherichia coli. J. Biol. Chem. 276, 23639–23644.
PANSEGRAUW., LANKA E., 1966. Enzymology of DNA transfer by conjugative mechanisms. Prog. Nucle-ic Acid. Re. Mol. Biol. 54, 197–251.
PANSEGRAUW., LANKA E., BARTH P. T., FIGURSKI D. H., GUINEYD. G., HAASD., HELINSKID. R., SCHWABH., STANISICHV. A., THOMASC. M., 1994. Complete nuc-leotide sequence of Birmingham IncP-alpha pla-smids: Compilation and comparative analysis. J. Molec. Biol. 239, 623–663.
PATELS. S., PICHAK. M., 2000. Structure and function of hexameric helicases. Annu. Rev. Biochem. 69, 651–697.
PERRIS., HELINSKID. R., TOUKDARIANA., 1991. Interac-tions of plasmid-encoded replication initiation proteins with the origin of DNA replication in the broad host range plasmid RK2. J. Biol. Chem. 266, 12536–43.
PINKNEYM., DIAZR., LANKAE., THOMASC. M., 1988. Re-plication of mini RK2 plasmid in extracts of Escherichia coli requires plasmid-encoded prote-in TrfA and host-encoded proteprote-ins DnaA, B, G DNA gyrase and DNA polymerase III. J. Molec. Biol. 203, 927–938.
RATNAKARP. V., MOHANTYB. K., LOBERTM., BASTIA D., 1996. The replication initiator protein pi of the
plasmid R6K specifically interacts with the ho-st-encoded helicase DnaB. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 5522–5526.
SCHERZINGERE., HARINGV., LURZR., OTTOS., 1991. Pla-smid RSF1010 DNA replication in vitro promoted by purified RSF1010 RepA, RepB and RepC prote-ins. Nucleic Acid Res. 19, 1203–1211.
SCHERZINGERE., ZIEGELING., BARCENAM., CARAZOJ. M., LURZR., LANKAE., 1997. The RepA protein of pla-smid RSF1010 is a replicative DNA helicase. J. Biol. Chem. 272, 30228–30236.
SCHMIDHAUSERT. J., FILUTOWICZM., HELINSKID. R., 1983. Replication of derivatives of the broad host range plasmid RK2 in two distantly related bacteria. Pla-smid 9, 325–30.
SOBECKYP. A., MINCERT. J., CHANGM. C., TOUKDARIANA., HELINSKID. R., 1998. Isolation of broad-host-range
replicons from marine sediment bacteria. App. and Environment. Microbiol. 64, 2822–2830. THOMASC. M., 1996. Bacterial diversity and the
envi-ronment: (Bacterial Genetics and Ecology, Naf-plion, Greece, May 25–29, 1996). Trends in Bio-technology 14, 327–329.
THOMASC. M., HELINSKID. R., 1989. Vegetative replica-tion and stable inheritance of IncP plasmids. [W:] Promiscous plsmids of gram-negative bacteria. THOMASC. M. (red.). Academic Press, San Diego, 1–25.
THOMASC. M., MEYERR., HELINSKID. R., 1980. Regions of broad-host-range plasmid RK2 which are essen-tial for replication and maintenance. J. Bacteriol. 141, 213–22.
