Artyku³ przegl¹dowy Review
Beztlenowe laseczki Clostridium perfringens sta-nowi¹ grupê drobnoustrojów, której przedstawiciele bytuj¹ w ró¿nych warunkach rodowiskowych. Ich szerokie rozpowszechnienie wi¹¿e siê nie tylko z obec-noci¹ w glebie, ciekach, wodzie s³odkiej/morskiej, produktach zwierzêcych i rolinnych, ale równie¿ w przewodzie pokarmowym (g³ównie w jelicie gru-bym) ludzi i zwierz¹t (8, 16, 23). Po raz pierwszy bak-terie C. perfringens zosta³y opisane w 1892 r. przez amerykañskiego patologa Williama H. Welcha pod nazw¹ Bacillus aerogenes, jako czynnik etiologiczny zgorzeli gazowej (16). W latach póniejszych nazwê zmieniono na Clostridium welchii, która funkcjonuje jako synonim równie¿ obecnie. Szczepy C. perfrin-gens posiadaj¹ zdolnoæ wytwarzania toksyn odpowie-dzialnych za wywo³ywanie szeregu chorób zarówno u ludzi, jak i u zwierz¹t (8, 37). Obraz zmian choro-bowych wykazuje cis³¹ korelacjê z typem wytwarza-nych toksyn, ich aktywnoci¹ enzymatyczn¹ i toksycz-n¹ (4).
Najwiêkszym zagro¿eniem dla zdrowia cz³owieka ze strony ¿ywnoci s¹ zatrucia pokarmowe wywo³y-wane przez szczepy nale¿¹ce do toksotypu A oraz
martwicowe zapalenie jelit, rozwijaj¹ce siê na tle szczepów uwalniaj¹cych toksynê C i niekiedy A (6, 8, 16). We wczesnych latach siedemdziesi¹tych XX w. odkryto dodatni¹ korelacjê miêdzy wytwarza-niem enterotoksyny przez szczepy C. perfringens typu A a wystêpowaniem zatruæ pokarmowych cz³owieka. Badania epidemiologiczne oparte na technikach mole-kularnych wykaza³y, i¿ tylko niewielki odsetek (1-5%) wszystkich izolowanych szczepów C. perfringens, g³ównie nale¿¹cych do toksotypu A, zdolnych jest do produkcji enterotoksyny (Clostridium perfringens en-terotoxin, CPE) odpowiedzialnej za wywo³ywanie za-truæ pokarmowych (8, 23, 27, 35). Corocznie w wielu krajach ca³ego wiata, w³¹czaj¹c w to kraje wysoko rozwiniête, zatrucia te zajmuj¹ czo³owe miejsce wród schorzeñ pokarmowych, których przyczyn¹ jest spo-¿ycie ¿ywnoci zanieczyszczonej czynnikami bakte-ryjnymi (1, 15). Drobnoustroje te posiadaj¹ bowiem wszelkie cechy umo¿liwiaj¹ce im wywo³ywanie cho-rób pochodzenia pokarmowego. S¹ szeroko rozpo-wszechnione w rodowisku, co sprzyja kontaminacji ró¿nego rodzaju ¿ywnoci oraz posiadaj¹ zdolnoæ wytwarzania ciep³oopornych przetrwalników, co
Rola szczepów Clostridium perfringens
w zaka¿eniach pokarmowych cz³owieka
AGNIESZKA CICHOÑ, KINGA WIECZOREK, JACEK OSEK
Zak³ad Higieny ¯ywnoci Pochodzenia Zwierzêcego Pañstwowego Instytutu Weterynaryjnego Pañstwowego Instytutu Badawczego, Al. Partyzantów 57, 24-100 Pu³awy
Cichoñ A., Wieczorek K., Osek J.
Role of Clostridium perfringens strains in human foodborne infections
Summary
Clostridium perfringens is an obligatorily anaerobic, Gram-positive, rod-shaped pathogen, which has the ability to form oval endospores. The microorganism is widespread in environments such as water, soil, waste water, the intestinal tract of humans and animals, as well as in raw and processed food. C. perfringens demonstrates the ability to produce a number of toxins, including enterotoxin (CPE) and major lethal toxins (á, â, å and é), which is the basis for a division into five toxinotypes (A, B, C, D, E). It was shown that CPE is encoded by the cpe gene and produced by less than 5% of C. perfringens strains, mainly belonging to type A. Production of enterotoxin is inextricably linked with the process of forming endospores. Considerable evidence implicates CPE as a virulence factor responsible for diarrhea and cramping symptoms associated with C. perfringens type A food poisoning. It is proven that this food poisoning can be caused by strains with the cpe gene located in the bacterial chromosome or on large plasmids, in contrast to other CPE-mediated diseases such as antibiotic (AAD) and sporadic diarrhea (SD), which are associated with plasmid-borne cpe-positive C. perfringens strains. Food poisoning caused by enterotoxigenic strains of C. perfringens type A is one of the most common gastrointestinal diseases in developed countries and shows a positive correlation with the growing percentage of people eating meals in catering establishments.
znacznie zwiêksza ich prze¿ywalnoæ w niesprzyja-j¹cych warunkach (8, 16, 21). Kolejnym atutem jest mo¿liwoæ szybkiego namna¿ania siê w ¿ywnoci, co pozwala na osi¹gniêcie w krótkim czasie wysokiego miana, niezbêdnego do wywo³ania zatrucia pokarmo-wego. Maj¹ te¿ zdolnoæ produkcji enterotoksyny CPE, bêd¹cej przyczyn¹ wyst¹pienia charakterystycznych objawów ¿o³¹dkowo-jelitowych w przebiegu zatruæ pokarmowych (16, 25).
Charakterystyka morfologiczna i biochemiczna C. perfringens
C. perfringens jest bezwzglêdnie beztlenow¹, po-zbawion¹ rzêsek Gram-dodatni¹ laseczk¹, o wielko-ci 3-9 × 0,9-1,3 µm. Cechuje siê zdolnowielko-ci¹ tworze-nia owalnych endospor usytuowanych subterminalnie w komórce wegetatywnej. W preparatach bezpored-nich C. perfringens wystêpuje w postaci krótkich, gru-bych, cylindrycznych komórek z widocznymi otocz-kami polisacharydowymi. W hodowli na pod³o¿u agarowym z krwi¹ wytwarza du¿e, zielonkawe kolo-nie otoczone podwójn¹ stref¹ â-hemolizy, przy czym jasna, zewnêtrzna strefa wiadczy o ekspresji przez dany szczep toksyny è, za nieprzezroczysta strefa wewnêtrzna hemolizy jest dowodem obecnoci tok-syny á (4, 16). Szczepy C. perfringens wykazuj¹ wzrost w szerokim zakresie temperatur, obejmuj¹cym 15-50°C, jednak optymalna temperatura dla wiêkszo-ci z nich wynosi 37-45°C (15, 16).
Czynniki wirulencji zarazka
Szczepy C. perfringens maj¹ zdolnoæ produkcji szeregu toksyn (20, 23, 37). Sporód nich wyodrêb-niono grupê czterech tzw. g³ównych toksyn letalnych, oznaczonych jako: á (CPA), â (CPB), å (ETx) i é (ITx), co by³o podstaw¹ do podzia³u na piêæ typów toksyno-gennych: A, B, C, D i E (tab. 1). Ponadto, szczepy te zdolne s¹ do wytwarzania enterotoksyny CPE, od-krytej niedawno toksyny beta2 (CPB2) oraz szeregu enzymów hydrolitycznych, a w szczególnoci: lecyty-nazy, hemolizyn, hialuronidazy, kolagelecyty-nazy, DNAzy oraz amylazy (8, 16). Znaczenie wymienionych typów toksynogennych w patogenezie zaka¿eñ ludzi i zwie-rz¹t jest doæ zró¿nicowane. Toksotypy B, D i E s¹ czynnikami etiologicznymi chorób g³ównie u ma³ych prze¿uwaczy, typ A u drobiu, A i C u prosi¹t, od ludzi z przypadków chorobowych wyizolowano typy
tok-syczne A i C, w³¹czaj¹c zatrucia pokarmowe, biegun-kê poantybiotykow¹ (antibiotic-associated diarrhea, AAD), (5, 23), biegunkê sporadyczn¹ (sporadic diar-rhea, SD), (7, 23), syndrom nag³ej mierci noworod-ków (SIDS), (23, 30), zgorzel gazow¹ oraz martwi-cowe zapalenie jelit. Zatrucia pokarmowe cz³owieka wywo³ywane s¹ jednak przede wszystkim przez szcze-py nale¿¹ce do toksotypu A, sporód których czêæ wyró¿nia zdolnoæ produkcji enterotoksyny CPE. Na-le¿y podkreliæ, i¿ to w³anie ta toksyna odpowiedzial-na jest za pojawienie siê charakterystycznych objawów klinicznych w przebiegu zatruæ pokarmowych na tle C. perfringens.
Enterotoksyna CPE
Enterotoksyna CPE C. perfringens zosta³a wyizo-lowana po raz pierwszy w latach 70. XX w. (8). Jest to cytotoksyna bia³kowa odpowiedzialna za wywo³y-wanie objawów ¿o³¹dkowo-jelitowych w przebiegu zatruæ pokarmowych (4). Sk³ada siê z pojedynczego ³añcucha bia³kowego o unikalnej sekwencji amino-kwasów oraz masie molekularnej 35 kDa, jest pH-i cpH-iep³olabpH-ilna (8, 35). BadanpH-ia pH-in vpH-itro wykaza³y, ¿e proteazy jelitowe (trypsyna i chymotrypsyna) powo-duj¹ 2-3-krotny wzrost aktywnoci biologicznej CPE, wynikaj¹cy z odciêcia 25-37 aminokwasów koñca N (4, 8, 27, 35). Gen cpe, koduj¹cy informacjê o entero-toksynie, mo¿e byæ zlokalizowany w chromosomie lub plazmidzie. Niegdy uwa¿ano, i¿ szczepy C. perfrin-gens typu A wywo³uj¹ce zatrucia pokarmowe u ludzi posiadaj¹ chromosomalny gen cpe, natomiast plazmi-dowa lokalizacja cpe wyró¿nia izolaty toksotypu A wywo³uj¹ce choroby niezwi¹zane z ¿ywnoci¹, a wiêc syndromy AAD lub SD (12, 26-28). W wietle ostat-nich badañ dowiedziono, i¿ zatrucia pokarmowe mog¹ byæ wywo³ywane tak¿e przez szczepy z plazmidowym genem cpe (12, 23). Potwierdza to wykrycie takich izolatów podczas epidemii w Finlandii i Niemczech, zarówno z przypadków chorobowych, jak i podejrza-nej o wywo³anie zachorowañ ¿ywnoci (23). Podobne wyniki uzyskano w Japonii podczas badania pacjen-tów z objawami zatrucia pokarmowego wywo³anego przez C. perfringens (23), jednak szczepy z chromo-somalnym cpe izolowane z przypadków klinicznych zatruæ pokarmowych u ludzi wykazuj¹ pewne ró¿ni-ce, przede wszystkim znacznie wiêksz¹ ciep³oopor-noæ, co t³umaczy ich wysok¹ prze¿ywalnoæ w ¿yw-noci poddawanej obróbce cieplnej (33). Ponadto, jak w przypadku wielu toksyn bakteryjnych, gen cpe zwi¹-zany jest z mobilnymi elementami genetycznymi. Do-tyczy to zarówno chromosomalnych, jak i plazmido-wych loci cpe (16, 25). Chromosomalne cpe zwi¹zane jest z transpozonem Tn5565 i ograniczone sekwen-cjami IS1470, podczas gdy plazmidowe ograniczone jest sekwencj¹ insercyjn¹ IS1151 lub IS1470 (8-11, 13, 20, 23). Geny te mog¹ byæ przenoszone horyzontalnie pomiêdzy szczepami C. perfringens, co pozwala na konwersjê fizjologicznej flory jelitowej w
enteropato-Tab. 1. G³ówne toksyny produkowane przez C. perfringens
p y T s n e g n ir fr e p . C y n y s k o T A P C CPB ETX ITX CPE CPB2 A + +/ +/ B + + + +/ +/ C + + +/ +/ D + + +/ +/ E + + +/ +/
geny (29). Charakterystyka genetyczna wymienionych powy¿ej dwóch subtypów C. perfringens wskazuje na znaczne ró¿nice dotycz¹ce epidemiologii, mo¿liwo-ci adaptacji oraz opornomo¿liwo-ci na warunki rodowiska (23). Zdolnoæ produkcji enterotoksyny jest nierozer-walnie zwi¹zana z formowaniem endospor. Synteza bia³ka CPE rozpoczyna siê ju¿ po 2 godzinach od chwi-li zainicjowania procesu sporulacji (4) i wzrasta stop-niowo przez co najmniej 6-8 godzin (23). Dziêki ma-powaniu promotorów genu cpe zidentyfikowano trzy funkcjonalne promotory, z których ka¿dy wykazywa³ homologiê z sekwencj¹ wi¹¿¹c¹ dla czynników sigma (SigK lub SigE) specyficznych dla sporulacji (18, 23). Dowiedziono, i¿ powy¿sze czynniki odgrywaj¹ klu-czow¹ rolê jako regulatory zarówno procesu sporula-cji, jak i produkcji enterotoksyny (18, 23). Bia³ko en-terotoksyny mo¿e stanowiæ nawet 20% wszystkich bia³ek sporuluj¹cej komórki bakteryjnej. Po zakoñcze-niu biosyntezy nie dochodzi jednak do sekrecji CPE, ale do jej akumulacji w cytoplazmie komórki. Uwal-nianie CPE do wiat³a jelita ma miejsce dopiero po zakoñczeniu procesu sporulacji, kiedy dochodzi do lizy komórki wegetatywnej i uwolnienia dojrza³ych endo-spor (4).
Mechanizm dzia³ania enterotoksyny CPE jest wie-loetapowy. W pierwszej kolejnoci wi¹¿e siê ona z receptorem polipeptydowym o masie cz¹steczkowej 50 kDa, tworz¹c tzw. ma³y kompleks o masie 90 kDa (8, 16, 23, 27). W nastêpnym etapie kompleks ten ulega przemianom fizykochemicznym, które mog¹ obejmowaæ albo insercjê CPE w b³onê komórkow¹ gospodarza, albo zmianê jej konformacji przestrzen-nej (16). Prowadzi to do po³¹czenia kompleksu tok-syny z receptorem polipeptydowym o masie 70 kDa, w wyniku czego powstaje du¿y kompleks bia³kowy o wielkoci 160 kDa (16, 35). W nastêpstwie opisa-nego procesu dochodzi do zmiany przepuszczalnoci b³on komórkowych dla elektrolitów i wzrostu pozio-mu jonów wapnia w enterocytach oraz wyst¹pienia bie-gunki (23).
¯ywnoæ jako potencjalny rezerwuar C. perfringens Nale¿¹ce do toksotypu A szczepy C. perfringens produkuj¹ce enterotoksynê, odpowiedzialne s¹ za wy-wo³ywanie zatruæ pokarmowych cz³owieka. Ich obec-noæ stwierdzono zarówno w glebie, rodowisku wod-nym, przewodzie pokarmowym ludzi i zwierz¹t, jak i w surowej oraz przetworzonej ¿ywnoci (8, 19, 21). ród³em zanieczyszczenia tusz zwierzêcych czy miêsa bakteriami C. perfringens mog¹ byæ: kontakt z gleb¹, odchodami zwierz¹t, a tak¿e brak przestrzegania za-sad higieny w czasie uboju i przetwórstwa miêsa (16). Co wiêcej, ryzyko kontaminacji ¿ywnoci w trakcie jej produkcji zwi¹zane jest z samym personelem za-trudnionym w przetwórstwie, gdy¿ wykazano obec-noæ szczepów C. perfringens (zarówno z plazmido-w¹, jak i chromosomaln¹ lokalizacj¹ genu cpe) w prze-wodzie pokarmowym klinicznie zdrowych ludzi (16,
20). W przeciwieñstwie do wiêkszoci drobnoustro-jów obecnych w ¿ywnoci, przetrwalniki C. perfrin-gens s¹ trudne do inaktywacji przy zastosowaniu ob-róbki cieplnej (16, 17). Spory izolowane z przypad-ków zatruæ pokarmowych cechuj¹ siê tak¿e wysokim stopniem opornoci na ró¿ne czynniki rodowiskowe, w³¹czaj¹c w to: stres osmotyczny, zmienne pH, prze-d³u¿one mro¿enie oraz wysokie cinienie hydrosta-tyczne (2, 32, 33). T³umaczy to wysok¹ prze¿ywal-noæ zarodników w ¿ywnoci, co w nastêpstwie jej nieodpowiedniego przechowywania, przetrzymywania w temperaturze pokojowej, mro¿enia zbyt du¿ych porcji czy te¿ zbyt krótkiego odgrzewania mo¿e byæ czynnikiem sprzyjaj¹cym intensywnemu namna¿aniu omawianych drobnoustrojów. Aktywacja spor w trak-cie obróbki trak-cieplnej ¿ywnoci umo¿liwia ich kie³ko-wanie w momencie, gdy temperatura osi¹gnie wartoæ korzystn¹ dla wzrostu C. perfringens, tj. 15-50°C (16). Dodatkowo ogrzewanie eliminuje tlen, co tak¿e przy-spiesza wzrost bakterii.
Nale¿y zwróciæ równie¿ uwagê, i¿ ryzyko zachoro-wania u ludzi na tle C. perfringens jest zdecydowanie wiêksze w krajach wysoko rozwiniêtych. Wi¹¿e siê to ze zmianami zachodz¹cymi w spo³eczeñstwie i w sty-lu ¿ycia, a dotyczy g³ównie rosn¹cego odsetka osób spo¿ywaj¹cych posi³ki w restauracjach, sto³ówkach i innych placówkach ¿ywienia zbiorowego (23). Zwiêkszone ryzyko zachorowania dotyczy tak¿e osób przebywaj¹cych w szpitalach oraz ludzi starszych. Corocznie w Stanach Zjednoczonych Centra Kontroli i Prewencji Chorób (Centers for Disease Control and Prevention) odnotowuj¹ ok. 250 000 przypadków za-truæ pokarmowych powodowanych przez enterotok-syczne szczepy C. perfringens typu A (22). W Nor-wegii drobnoustrój ten by³ najczêstsz¹ przyczyn¹ zatruæ pokarmowych w latach dziewiêædziesi¹tych. Podobne informacje dotycz¹ równie¿ Japonii oraz Wielkiej Brytanii (8, 21).
Chorobotwórczoæ enterotoksycznych szczepów toksotypu A C. perfringens dla cz³owieka Zatrucia pokarmowe stanowi¹ jedno z najczêciej wystêpuj¹cych schorzeñ pochodzenia pokarmowego w krajach rozwiniêtych (23). Epidemie te odznaczaj¹ siê du¿ym odsetkiem chorych i zwi¹zane s¹ ze spo-¿ywaniem, najczêciej w placówkach ¿ywienia zbio-rowego, dañ zawieraj¹cych w swym sk³adzie miêso wieprzowe lub drobiowe, a tak¿e konserw miêsnych, warzywnych, sosów czy zup (8). Spo¿ycie ¿ywnoci zanieczyszczonej du¿¹ liczb¹ komórek wegetatywnych (> 106 jtk/g) enterotoksycznych szczepów C. perfrin-gens typu A prowadzi do rozwoju zatrucia pokarmo-wego (16). Nale¿y zaznaczyæ, i¿ wiêkszoæ komórek ginie w kwanym rodowisku ¿o³¹dka, pozosta³e tra-fiaj¹ jednak do jelita cienkiego, co wi¹¿e siê z roz-poczêciem sporulacji w jego wietle, a tym samym produkcj¹ CPE (23, 26). Pierwsze objawy kliniczne pojawiaj¹ siê po 8-24 godzinach od spo¿ycia
zanie-czyszczonej ¿ywnoci i obejmuj¹ wyst¹pienie biegunki oraz ostrego bólu brzucha. Zdecydowanie rzadziej do³¹czaj¹ siê nudnoci, gor¹czka i wymioty (16, 21). Zazwyczaj choroba wykazuje ³agodny przebieg, nie wymaga leczenia i ustêpuje samoistnie w ci¹gu 12-24 godzin (36). Z tego powodu wiêkszoæ chorych nie kontaktuje siê ze s³u¿b¹ zdrowia, co mo¿e sugerowaæ, i¿ wiele przypadków zatruæ pokarmowych wywo³y-wanych przez ten drobnoustrój nie podlega rejestracji. Ewentualne zejcia miertelne mog¹ byæ spowodowane odwodnieniem organizmu, co dotyczy g³ównie osób w podesz³ym wieku oraz najm³odszych pacjentów (8).
Biegunki poantybiotykowe (antibiotic-associated diarrhea, AAD) i sporadyczne (sporadic diarrhea, SD)
Enterotoksyczne szczepy C. perfringens typu A s¹ tak¿e czynnikiem etiologicznym ok. 15% przypadków AAD i SD u ludzi (3, 20, 23). Podczas gdy rozwój AAD jest zwykle konsekwencj¹ terapii antybioty-kowej, ze szczególnym uwzglêdnieniem stosowania penicylin, cafalosporyn, trimetoprimu lub kotrimoksa-zolu, wystêpowanie SD jest niezale¿ne od leczenia przeciwbakteryjnego (23). W przeciwieñstwie do za-truæ pokarmowych wywo³ywanych spo¿yciem du¿ej liczby komórek wegetatywnych, uwa¿a siê, i¿ rozwój AAD oraz SD mo¿e byæ wywo³any niskim poziomem C. perfringens, cechuj¹cym siê plazmidow¹ lokaliza-cj¹ genu cpe. W nastêpstwie transferu plazmidowego cpe do bytuj¹cych w jelicie jako flora fizjologiczna cpe-negatywnych szczepów C. perfringens dochodzi do rozwoju choroby (14, 23), jednak¿e pierwotne ród-³o komórek o plazmidowej lokalizacji cpe, pe³ni¹cych rolê donorów tego markera, nie zosta³o jednoznacznie zidentyfikowane. W oparciu o aktualny stan wiedzy mo¿na za³o¿yæ, i¿ szczepy odpowiadaj¹ce za rozwój AAD i SD mog¹ byæ przenoszone za porednictwem ¿ywnoci (23). Ponadto wiêkszoæ szczepów C. per-fringens izolowanych z przypadków klinicznych AAD i SD wykazuje obecnoæ genu cpb2, koduj¹cego in-formacjê o syntezie toksyny beta2 (23, 24). Toksyna ta ³¹czona jest z wystêpowaniem objawów ¿o³¹dko-wo-jelitowych u zwierz¹t. Przypuszcza siê, ¿e mo¿e ona odgrywaæ dodatkowo rolê czynnika potêguj¹cego w³aciwoci patogenne enterotoksyny (23, 24).
Syndrom nag³ej mierci noworodka (sudden infant death syndrome, SIDS)
Ofiarami SIDS s¹ niemowlêta przed osi¹gniêciem pierwszego roku ¿ycia (23, 30). Wykazano, i¿ entero-toksyczne szczepy C. perfringens typu A s¹ powszech-nie obecne w treci jelitowej chorych powszech-niemowl¹t (23, 31). W przeciwieñstwie do innych chorób wywo³ywa-nych przez szczepy produkuj¹ce CPE, w przebiegu SIDS enterotoksyna wytwarzana w wietle jelita wch³a-niana jest do uk³adu kr¹¿enia, co w konsekwencji pro-wadzi do gwa³townego zgonu. Objawy kliniczne po eksperymentalnym, do¿ylnym podaniu CPE
charakte-ryzuj¹ siê spowolnieniem i przed³u¿eniem ruchów klat-ki piersiowej, zwolnieniem akcji serca, obni¿eniem cinienia krwi i liczby oddechów, a nastêpnie prowa-dz¹ do wyst¹pienia nag³ych zejæ miertelnych (23, 34). Badania prowadzone w Finlandii wykaza³y obecnoæ szczepów C. perfringens typu A z plazmidow¹ lokali-zacj¹ cpe w jelitach 24% niemowl¹t chorych na SIDS (23). Dla porównania, przedmiotem badañ zosta³y objête tak¿e próbki ka³u zdrowych dzieci, jednak oka-za³y siê one wolne od cpe-dodatnich szczepów C. per-fringens. Powy¿sze wyniki stanowi¹ potwierdzenie istotnej roli enterotoksycznych szczepów C. perfrin-gens z genem cpe zlokalizowanym na plazmidzie w patogenezie SIDS (23).
Metody identyfikacji
Tradycyjna diagnostyka C. perfringens opiera siê na izolacji charakterystycznych kolonii otoczonych czar-n¹ stref¹ precypitatu, powsta³¹ w wyniku redukcji siar-czanów (IV) do siarczków, w selektywnej po¿ywce agarowej z siarczanem i cykloseryn¹. Wstêpnie roz-poznane kolonie poddawane s¹ dalszym potwierdze-niom, obejmuj¹cym badanie zdolnoci ruchu, testy na redukcjê azotanów i zdolnoæ fermentacji laktozy. Wykonanie powy¿szych badañ pozwala jedynie na stwierdzenie obecnoci C. perfringens w badanym materiale, jednak bez mo¿liwoci identyfikacji po-szczególnych typów toksynogennych, a tym bardziej wyodrêbnienia szczepów enterotoksycznych. Klasycz-n¹ diagnostykê utrudnia dodatkowo fakt istnienia szczepów o zmienionych w³aciwociach biochemicz-nych i morfologiczbiochemicz-nych, co mo¿e byæ przyczyn¹ uzy-skiwania wyników fa³szywie ujemnych. Standardowo do typowania C. perfringens wykorzystuje siê odczyn seroneutralizacji toksyn, ale metoda ta jest czaso-ch³onna i wymaga udzia³u zwierz¹t laboratoryjnych. Wzbogacenie diagnostyki o technikê PCR w znacz-nym stopniu zast¹pi³o identyfikacjê tych drobnoustro-jów testem seroneutralizacji, pozwalaj¹c na wykry-wanie genów odpowiedzialnych za syntezê toksyn C. perfringens oraz enterotoksyny. Zalet¹ metody jest mo¿liwoæ wykorzystania, jako materia³u wyjciowe-go, DNA wyizolowanego z komórek wegetatywnych C. perfringens, co eliminuje koniecznoæ wprowadze-nia badanych szczepów w stan sporulacji in vitro, jak ma to miejsce w przypadku badañ serologicznych (4). Wród innych metod immunologicznych, umo¿liwia-j¹cych wykrywanie toksyn, w tym enterotoksyny CPE, nale¿y wymieniæ m.in. test ELISA, aglutynacjê latek-sow¹ czy te¿ odwrotn¹ biern¹ aglutynacjê cz¹stek la-teksu (RPLA). Natomiast w celu porównania pokre-wieñstwa szczepów wyizolowanych od pacjentów ze szczepami uzyskanymi z zanieczyszczonej ¿ywnoci przeprowadza siê elektroforezê pulsacyjn¹ w ¿elu aga-rozowym (PFGE) (8). Je¿eli uzyskane profile makro-restrykcyjne oka¿¹ siê identyczne, a liczba komórek wegetatywnych w badanym kale i ¿ywnoci osi¹gnie min. 105 jtk/ml, wiadczy to o wyst¹pieniu zatrucia
pokarmowego, którego czynnikiem etiologicznym jest C. perfringens.
Podsumowanie
Zatrucia pokarmowe wywo³ywane przez enterotok-syczne szczepy C. perfringens typu A charakteryzuj¹ siê stosunkowo ³agodnym przebiegiem. Z tego powodu wiele przypadków chorobowych nie podlega rejestra-cji, co w znacz¹cy sposób przyczynia siê do zani¿enia danych epidemiologicznych. Jak wynika z raportów, ryzyko zachorowania jest zdecydowanie wiêksze w kra-jach wysoko rozwiniêtych i wykazuje pozytywn¹ ko-relacjê z rosn¹cym odsetkiem osób spo¿ywaj¹cych posi³ki w placówkach ¿ywienia zbiorowego. Bior¹c powy¿sze pod uwagê, nale¿y liczyæ siê w przysz³oci z ryzykiem wzrostu liczby przypadków zachorowañ na tle C. perfringens tak¿e w naszym kraju, spowodo-wanych spo¿yciem zanieczyszczonej ¿ywnoci przez osoby korzystaj¹ce z us³ug placówek gastronomicz-nych. W celu zapobiegania zagro¿eniom zdrowia cz³o-wieka nale¿y podj¹æ dzia³ania zmierzaj¹ce do popra-wy higieny przygotopopra-wywania posi³ków, kontroli za-kresu temperatur ich przechowywania oraz w³aciwej obróbki termicznej przed spo¿yciem. Niezmiernie istotnym aspektem jest w tej sytuacji w³aciwy nadzór weterynaryjny nad ubojem zwierz¹t, rozbiorem tusz miêsnych, przetwórstwem, przechowywaniem oraz transportem surowców i produktów finalnych. Dzia-³anie to zapewnia w³aciwie pojêt¹ profilaktykê zagro-¿eñ zdrowia publicznego.
Pimiennictwo
1.Adak G. K., Long S. M., OBrien S. J.: Trends in indigenous foodborne disease and deaths, England and Wales: 1992 to 2000. Gut 2002, 51, 832--841.
2.Akhtar S., Paredes-Sabja D., Torres J. A., Sarker M. R.: Strategy to inactivate Clostridium perfringens spores in meat products. Food Microbiol. 2009, 26, 272-277.
3.Asha N. J., Wilcox M. H.: Laboratory diagnosis of Clostridium perfringens antibiotic-associated diarrhoea. J. Med. Microbiol. 2002, 51, 891-894. 4.Augustynowicz E.: Molekularne podstawy patogennego dzia³ania Clostridium
perfringens. Post. Mikrobiol. 1999, 38, 257-275.
5.Borriello S. P., Larson H. E., Welch A. R., Barclay F., Stringer M. F., Bartho-lomew B. A.: Enterotoxigenic Clostridium perfringens: a possible cause of antibiotic-associated diarrhoea. Lancet 1984, 1, 305-307.
6.Bos J., Smithee L., McClane B., Distefano R. F., Uzal F., Songer J. G., Mallonee S., Crutcher J. M.: Fatal necrotizing colitis following a foodborne out break of enterotoxigenic Clostridium perfringens type A infection. Clin. Infect. Dis. 2005, 40, 78-83.
7.Brett M. M., Rodhouse J. C., Donovan T. J., Tebbutt G. M., Hutchinson D. N.: Detection of Clostridium perfringens and its enterotoxin in cases of sporadic diarrhoea. J. Clin. Pathol. 1992, 45, 609-611.
8.Brynestad S., Granum P. E.: Clostridium perfringens and foodborne infec-tions. Int. J. Food Microbiol. 2002, 74, 195-202.
9.Brynestad S., Granum P. E.: Evidence that Tn5565, which includes the entero-toxin gene in Clostridium perfringens, can have a circular form which may be a transposition intermediate. FEMS Microbiol. Lett. 1999, 170, 281-286. 10.Brynestad S., Sarker M. R., McClane B. A., Granum P. E., Rood J. I.: The enterotoxin (CPE) plasmid from Clostridium perfringens is conjugative. Infect. Immun. 2001, 69, 3483-3487.
11.Brynestad S., Synstad B., Granum P. E.: The Clostridium perfringens entero-toxin gene is on a transposable element in type A human food poisoning strains. Microbiol. 1997, 143, 2109-2115.
12.Carman R. J., Sayeed S., Li J., Genheimer C. W., Hiltonsmith M. F., Wilkins T. D., McClane B. A.: Clostridium perfringens toxin genotypes in the feces of healthy North Americans. Anaerobe 2008, 14, 102-108.
13.Cornillot E., Saint-Joanis B., Daube G., Katayama S., Granum P. E., Canard B., Cole S. T.: The enterotoxin gene (cpe) of Clostridium perfringens can be chromosomal or plasmid-borne. Mol. Microbiol. 1995, 15, 639-647. 14.Fisher D. J., Miyamoto K., Harrison B., Akimoto S., Sarker M. R., McClane B. A.: Association of beta2 toxin production with Clostridium perfringens type A human gastrointestinal disease isolates carrying a plasmid entero-toxin gene. Mol. Microbiol. 2005, 56, 747-762.
15.Garcia J. S., Heredia N. L.: Foodborne pathogens and toxins: an overview, [w:] Heredia, Wesley, Garcia (Eds): Microbiologically Safe Foods. Wiley--Blackwell, New York, USA 2009, 24-25.
16.García S., Heredia N.: Clostridium perfringens: A dynamic foodborne pathogen. Food Bioprocess Technol. 2011, 4, 624-630.
17.Grant K. A., Kenyon S., Nwafor I., Plowman J., Ohai C., Halford-Maw R., Peck M. W., McLauchlin J.: The identification and characterization of Clostridium perfringens by real-time PCR, location of enterotoxin gene, and heat resistance. Foodborne Pathog. Dis. 2008, 5, 629-639.
18.Harry K. H., Zhou R., Kroos L., Melville S. B.: Sporulation and enterotoxin (CPE) synthesis are controlled by the sporulation-specific sigma factors SigE and SigK in Clostridium perfringens. J. Bacteriol. 2009, 191, 2728-2742. 19.Heikinheimo A.: Diagnostics and molecular epidemiology of cpe-positive
Clostridium perfringens type A. PhD Thesis. Department of Food and Envi-ronmental Hygiene, University of Helsinki, Finland 2008.
20.Heikinheimo A., Lindström M., Granum P. E., Korkeala H.: Humans as reservoir for enterotoxin gene-carrying Clostridium perfringens type A. Emerg. Infect. Dis. 2006, 12, 1724-1729.
21.Heredia N. L., Labbé R. G.: Clostridium perfringens, [w:] Garcia-Alvarado J. S., Labbé R. G. (Eds): Guide to foodborne pathogens. New York, USA: John Wiley and Sons 2001, 133-142.
22.Lynch M., Painter J., Woodruff R., Braden C.: Surveillance for foodborne--disease outbreaks United States, 1998-2002. Morbid. Mort. Weekly Report 2006, 55, 1-34.
23.Lindström M., Heikinheimo A., Lahti P., Korkeala H.: Novel insights into the epidemiology Clostridium perfringens type A food poisoning. Food Microbiol. 2011, 28, 192-198.
24.Mage D. T., Cohen M., Donner M.: Sudden infant death syndrome. N. Engl. J. Med. 2009, 24, 2581.
25.McClane B. A.: Clostridial enterotoxins, [w:] Durre P. (Ed.): Handbook on Clostridia. Florida, USA: Taylor and Francis 2005, 385-406.
26.McClane B. A.: Clostridium perfringens, [w:] Doyle M. P., Beuchat L. R., Montville T. J., (Eds): Food microbiology: fundamentals and frontiers. Washington, DC: ASM Press 2001, 351-372.
27.McClane B. A., Chakrabarti G.: New insights into the cytotoxic mecha-nisms of Clostridium perfringens enterotoxin. Anaerobe 2004, 10, 107-114. 28.McClane B. A., Rood J. I.: Clostridial toxins involved in human enteric and histotoxic infections, [w:] Bahl H., Duerre P., editors. Clostridia: biotechno-logy and medical applications. Weinheim: Wiley-VCH 2001, 169-209. 29.Modi N., Wilcox M. H.: Evidence of antibiotic induced Clostridium
perfrin-gens diarrhoea. J. Clin. Pathol. 2001, 54, 748-751.
30.Murrell T. G., Ingham B. G., Moss J. R., Taylor W. B.: A hypothesis concer-ning Clostridium perfringens type A enterotoxin (CPE) and sudden infant death syndrome (SIDS). Med. Hypotheses 1987, 22, 401-413.
31.Murrell W. G., Stewart B. J., ONeill C., Siarakas S., Kariks S.: Enterotoxi-genic bacteria in the sudden infant death syndrome. J. Med. Microbiol. 1993, 39, 114-127.
32.Paredes-Sabja D., Gonzales M., Sarker M. R., Torres J. A.: Combined effects of hydrostatic pressure, temperature and pH on the inactivation of spores of Clostridium perfringens type A and Clostridium sporogenes in buffet solutions. J. Food. Sci. 2007, 72, M202-M206.
33.Sarker M. R., Shivers R. P., Sparks S. G., Juneja V. K., McClane B. A.: Comparative experiments to examine the effects of heating on vegetative cells and spores of Clostridium perfringens isolates carrying plazmid genes versus chromosomal enterotoxin genes. Appl. Environ. Microbiol. 2000, 66, 3234-3240.
34.Siarakas S., Damas E., Murrell W. G.: Is cardiorespiratory failure induced by bacterial toxins the cause of sudden infant death syndrome? Studies with an animal model (the rabbit). Toxicon 1995, 33, 635-649.
35.Smedley J. G., Fisher D. J., Sayeed S., Chakrabarti G., McClane B. A.: The enteric toxins of Clostridium perfringens. Rev. Physiol. Biochem. Pharma-col. 2004, 152, 183-204.
36.Songer J. G.: Clostridia as agents of zoonotic disease. Vet. Microbiol. 2010, 140, 399-404.
37.Uzal F. A., McClane B. A.: Recent progress in understanding the pathogene-sis of Clostridium perfringens type C infections. Vet. Microbiol. 2011, 153, 37-43.
Adres autora: dr Kinga Wieczorek, Al. Partyzantów 57, 24-100 Pu³awy; e-mail: kinga.wieczorek@piwet.pulawy.pl
