Medycyna Wet. 2008, 64 (2) 223
Praca oryginalna Original paper
Plazma nasienia jest kompleksem bia³ek, których synteza zwi¹zana jest z j¹drami, naj¹drzami i dodat-kowymi gruczo³ami p³ciowymi (14). W sk³adzie bio-chemicznym bia³ek plazmowych zidentyfikowano en-zymy, hormony (12), inhibitory proteinaz, glikoprote-iny (15). Op³aszczaj¹c siê po ejakulacji na powierzch-ni plazmolemy w obrêbie struktur biochemicznych plemników, bia³ka staj¹ siê systemami polifunkcyjny-mi warunkuj¹cypolifunkcyjny-mi zdolnoæ zap³adniaj¹c¹ plemników, decyduj¹cymi czêsto o p³odnoci samca (17). W ostat-nim okresie uzyskano interesuj¹ce rezultaty badañ wskazuj¹ce, ¿e niektóre bia³ka plazmowe determino-waæ mog¹ p³odnoæ buhajów (7), ogierów (1) i knu-rów (4). Podkrelono ich wp³yw na przydatnoæ na-sienia do kriokonserwacji (5). Niemniej za niezbêdne nale¿y uznaæ dalsze poszukiwania nowych rozwi¹zañ metodycznych pozwalaj¹cych na charakterystykê strukturaln¹ bia³ek plazmy nasienia zwi¹zanych z p³od-noci¹.
Obok rutynowo stosowanych w laboratoriach bio-chemicznych metod chromatografii powinowactwa,
chromatografii odwróconej fazy HPLC, sekwencjono-wania bia³ek, szczególne zainteresowanie dotyczy wysokorozdzielczych metod elektroforezy. Dwukie-runkowa elektroforeza w ¿elu poliakryloamidowym (2-D PAGE), obok spektrometrii masowej (MS), na-le¿y do bloku analitycznego stosowanego w proteo-mice, umo¿liwiaj¹c, miêdzy innymi, mapowanie bia-³ek (11). Termin mapowanie biabia-³ek (protein mapping) dotyczy identyfikacji pojedynczych polipeptydów w z³o¿onych mieszaninach bia³ek przy wykorzystaniu metody 2-D. Omawiana metoda stanowi po³¹czenie izoelektroogniskowania (IEF) i elektroforezy w ¿elu poliakryloamidowym w obecnoci soli sodowej siar-czanu dodecylosodowego (SDS-PAGE) (10). W ten sposób metoda 2-D pozwala na jednoczesn¹ identyfi-kacjê bia³ek na podstawie ich ³adunku elektrostatycz-nego oraz masy cz¹steczkowej. Dwukierunkowa elek-troforeza w ¿elu poliakryloamidowym zosta³a wyko-rzystana do charakterystyki plazmy nasienia ró¿nych gatunków ssaków (1-3, 7, 9).
Celem badañ by³a ocena zmiennoci liczby polipep-tydów w plazmie nasienia, identyfikowanych metod¹ elektroforezy dwukierunkowej, w zale¿noci od wie-ku knurów i sezonu, w którym pozyskiwano nasienie.
Mapowanie bia³ek plazmy nasienia knura
przy wykorzystaniu metody elektroforezy
dwukierunkowej w ¿elu poliakryloamidowym*
)
W£ADYS£AW KORDAN, JERZY STRZE¯EK, DANIEL SOLIWODA, MAREK LECEWICZ, MARZENA MOGIELNICKA
Katedra Biochemii i Biotechnologii Zwierz¹t Wydzia³u Bioin¿ynierii Zwierz¹t UWM, ul. Oczapowskiego 5, 10-718 Olsztyn Kordan W., Strze¿ek J., Soliwoda D., Lecewicz M., Mogielnicka M.
Mapping of boar seminal plasma proteins by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis Summary
An attempt was made to use a modified 2-D PAGE technique to analyze seminal plasma proteins and their polymorphisms in relation to boar age and season. The 2-D PAGE analysis of seminal plasma proteins was performed using a buffer pH gradient of 3 to 10. Modifications to the 2-D PAGE procedure included substituting mercaptoethanol (ME) with dithiothreitol (DTT) and the use of a specific reagent assay (Plus One 2-D Clean-Up Kit, Amersham Biosciences), which markedly improved the resolution of the electrophoregrams. Polymorphisms by polypeptide mapping of boar seminal plasma were dependent on the animal age and season. Furthermore, the amount of polypeptides detected in the seminal plasma was significantly lower in 12 month-old boars compared with 3 year-olds. Additionally, the seminal plasma polypeptides were markedly lower in the summer than in the autumn. The results of the study showed that mapping seminal plasma proteins may be used as a marker for the secretor activity of boar accessory sex glands, and as a selection criterion for male reproduction.
Keywords: boar, seminal plasma, polyacrylamide gel electrophoresis
*) Badania wykonane w ramach tematu badañ statutowych UWM w
Medycyna Wet. 2008, 64 (2) 224
Materia³ i metody
Materia³ dowiadczalny. Ejakulaty pobierano metod¹ manualn¹ od trzech knurów rasy wbp i pbz stacjonuj¹cych w Laboratorium Biologii Rozrodu Katedry Biochemii i Biotechnologii Zwierz¹t UWM w Olsztynie. Analizie poddano 24 ejakulaty. Uzyskano zgodê Lokalnej Komisji Etycznej w Olsztynie na pobieranie nasienia.
Przygotowanie próbek plazmy nasienia do rozdzia-³ów elektroforetycznych metod¹ 2-D PAGE. Do badañ stosowano plazmê nasienia uzyskan¹ po dwukrotnym wi-rowaniu nasienia przez 20 minut, odpowiednio, przy 900 × g i 10 000 × g, w temperaturze pokojowej. Przed wykona-niem rozdzia³u elektroforetycznego w próbach oznaczano zawartoæ bia³ka (18). Zastosowano oryginaln¹, zmodyfi-kowan¹, procedurê przygotowania prób plazmy nasienia do rozdzia³ów elektroforetycznych. Próby rozcieñczano do koñcowej koncentracji 0,1 mg bia³ka/ml i preinkubowano w obecnoci specyficznego zestawu odczynnikowego (Plus One 2-D Clean-Up Kit, Amersham Biosciences) zgodnie z procedur¹ podan¹ przez producenta. Po preinkubacji próby zawieszano w 100 µl zmodyfikowanego buforu lizuj¹cego (9,5 M mocznik Amersham Biosciences, 2% Triton X-100 Sigma, 65 mM (0,65 × 101 M) DTT Serva, 2%
roztwór amfolitów w zakresie pH 3-10 Amersham Bio-sciences) i poddawano elektroforezie dwukierunkowej.
Elektroforeza dwukierunkowa (2-D PAGE) bia³ek plazmy nasienia. Przeprowadzono j¹ zgodnie z metod¹ po-dan¹ przez OFarrel i wsp. (10), w gradiencie pH 3-10.
Izoelektroogniskowanie (IEF). ¯ele do izoelektroognis-kowania (9,2 M mocznik, 4% poliakryloamid Sigma, 20% Triton X-100, 2% roztwór amfolitów w zakresie pH 3-10) poddawano wstêpnej preelektroforezie z zastosowaniem zmiennych wartoci napiêcia (200 V 10 min., 300 V 15 min., 400 V 15 min.). Zasadniczy rozdzia³ elektrofo-retyczny, poprzedzony elektoforez¹ wstêpn¹ (500 V 10 min.) prowadzono w temperaturze pokojowej (850 V 4,5 godziny).
Elektroforeza denaturuj¹ca (SDS-PAGE). Po izoelek-troogniskowaniu, ¿ele poddawano inkubacji w buforze ekwilibruj¹cym (0,0625 M Tris-HCl, pH 6,8; 2,3% SDS, 5,0% 2-merkaptoetanol Serva, 10% glicerol POCH, Gliwice, 0,05% b³êkit bromofenolowy, metanol POCH, Gliwice) przez 10 minut. Rozdzia³y elektroforetyczne pro-wadzono w 15% ¿elu poliakryloamidowym w obecnoci (SDS) oraz przy zastosowaniu buforu Tris-glicyna-SDS (pH 8,3) (8), wykorzystuj¹c aparat Mini Protean II (Bio-Rad).
Detekcja próbek po elektroforezie 2-D PAGE. ¯ele poliakryloamidowe barwiono metod¹ srebrow¹ z wykorzy-staniem zestawu odczynników Silver staining kit (Amer-sham Biosciences) (6). Analizê elektroforegramów prze-prowadzono z zastosowaniem programu komputerowego PD QuestTM (Bio-Rad). Program ten pozwala na
jednoczes-ne i precyzyjjednoczes-ne wyznaczenie masy cz¹steczkowej oraz ³a-dunków elektrostatycznych analizowanych bia³ek.
Wp³yw wieku i pory roku na profil elektroforetycz-ny polipeptydów plazmy nasienia knura. Próbki plazmy nasienia stosowane w badaniach elektroforetycznych uzyskiwano z ejakulatów 3 knurów spe³niaj¹cych kryteria normospermii, w odniesieniu do wybranych wskaników makroskopowych, mikroskopowych, morfologicznych oraz
zawartoci bia³ka ca³kowitego (tab. 1). Po pobraniu ejaku-laty s¹czono przez steryln¹ gazê w celu usuniêcia frakcji galaretowatej, a nastêpnie poddawano wirowaniu przy 10 000 × g w ci¹gu 15 minut, w temperaturze pokojowej. Uzyskan¹ w ten sposób plazmê nasienia przechowywano w temperaturze 80°C (193,2 K) do czasu dalszych analiz. Uwzglêdniono 12-miesiêczne przedzia³y wiekowe knurów. Badaniami profili elektroforetycznych objêto plazmy na-sienia uzyskane od knurów w wieku: 12 miesiêcy, 24 mie-siêcy, 36 miesiêcy i dodatkowo 42 miesiêcy. Uwzglêdnia-j¹c zmiany d³ugoci dnia wietlnego oraz wp³yw tego zja-wiska na w³aciwoci biologiczne nasienia wyodrêbniono cztery okresy, w których wykonano badania profili elek-troforetycznych, tj. wiosenny (obejmuj¹cy miesi¹ce: kwie-cieñ, maj, czerwiec), letni (obejmuj¹cy miesi¹ce: lipiec, sierpieñ, wrzesieñ), jesienny (obejmuj¹cy miesi¹ce: pa-dziernik., listopad, grudzieñ) oraz zimowy (obejmuj¹cy miesi¹ce: styczeñ, luty, marzec).
Analizê statystyczn¹ przeprowadzono przy pomocy pro-gramu komputerowego Statistica 6.0 (statsoft). Stosowano test Dunnetta.
Wyniki i omówienie
Bia³ka plazmy nasienia knura wykazuj¹ tendencjê do agregacji powodowanej, miêdzy innymi, ich gliko-proteinowym charakterem (15), co w znacznym stop-niu utrudnia ich analizê elektroforetyczn¹. Stosowa-nie klasycznej metody elektroforezy dwukierunkowej (2-D) do analizy omawianych substancji nie daje za-dowalaj¹cych rezultatów, co przejawia siê nisk¹ roz-dzielczoci¹ otrzymanych ektroforegramów i w koñ-cowym efekcie nie pozwala na ich obiektywn¹ analizê. W niniejszych badaniach podjêto próbê adaptacji me-tody (2-D) do analizy bia³ek plazmy nasienia knura.
W wyniku modyfikacji metody 2-D PAGE, polega-j¹cej na zastosowaniu specyficznego zestawu odczyn-nikowego (Plus One 2-D Clean-Up) do preinkubacji prób, otrzymano wzrost rozdzielczoci elektroforegra-mów. Zastosowanie preinkubacji w znacznym stop-niu redukowa³o ingerencjê substancji niepo¿¹danych, takich jak: kwasy nukleinowe, detergenty, sole, lipidy, fenole. Dodatkowo zast¹pienie w buforze lizuj¹cym 2-merkaptoetanolu DTT (ditiotreitolem), posiadaj¹cym wiêksz¹ zdolnoæ redukcji mostków disiarczkowych ze wzglêdu na obecnoæ w sk³adzie dwóch grup tiolo-wych (-SH), wp³ywa³o pozytywnie na rozdzielczoæ elektroforetyczn¹ bia³ek plazmy nasienia knura.
Ob-a k s W kni x Norwmgos(p1e6r)mia m c ( u t a l u k a j e æ o t e j b O 3) 248,78 100-400 0 1 ( w ó k i n m e l p a j c a rt n e c n o K 6/cm3) 580,44 150-600 ) % ( w ó k i n m e l p æ o w il h c u R 68,17 >50 h c y n o i n e i m z w ó k i n m e l p k e t e s d O ) % ( e i n z c i g o l o fr o m 7,80 <20 m c / g m ( e ti w o k ³ a c o k ³ a i B 3) 36,33 oko³o38,00
Medycyna Wet. 2008, 64 (2) 225
serwowane zjawisko pozwoli³o na zastosowanie me-tody 2-D do analizy map polipeptydowych plazmy nasienia z uwzglêdnieniem wieku knurów i pory roku. W obrêbie analizowanych elektroforegramów wyod-rêbniono trzy grupy polipeptydów, przyjmuj¹c za kry-terium podzia³u ich masê cz¹steczkow¹, tj.: £ 20,1 kDa grupa I; 20,1-40 kDa grupa II; 40-90 kDa grupa III.
Jak wynika z danych przedstawionych na ryc. 1, wraz z up³ywem wieku knura obserwowano zmiany ilocio-we i jakocioilocio-we w sk³adzie map polipeptydowych. Zjawisko to przejawia³o siê szczególnie wzrostem ogólnej liczby polipeptydów u analizowanego
osob-nika, odpowiednio, od 52 w wieku 12 miesiêcy do 131 w wieku 36 miesiê-cy. Dynamiczny wzrost liczby poli-peptydów obserwowano szczególnie w przedziale 20-40 kDa, od 16 u knu-ra w wieku 1 roku do 53 u osobnika w wieku 3 lat oraz w grupie polipep-tydów o masie cz¹steczkowej 40-90 kDa, od 24 w wieku 12 miesiêcy do 49 w wieku 36 miesiêcy. Zmianom ilociowym frakcji polipeptydowych towarzyszy³o pojawienie siê bia³ek o nowych w³aciwociach bioche-micznych, których przejawem by³y wartoci pI bia³ek w zakresie pH obo-jêtnego, a szczególnie zasadowego. Dotyczy³o to zw³aszcza polipeptydów w przedziale mas cz¹steczkowych od 20 do 40 kDa i od 40 do 90 kDa.
Rezultaty analiz ilociowych pro-fili polipeptydowych plazmy nasienia z uwzglêdnieniem wieku knurów przedstawia ryc. 2A. W analizowa-nych próbkach plazmy nasienia ob-serwowano, potwierdzony statystycz-nie, wzrost ogólnej liczby polipepty-dów wraz z up³ywem wieku knurów, odpowiednio, od 72 w wieku 1 roku do 125 w wieku 3 lat. U osobników w wieku 3,5 roku stwierdzono tylko nieznaczny wzrost liczby polipepty-dów. Na podkrelenie zas³uguje fakt istotnego wzrostu liczby polipepty-dów u osobników 3-letnich, szczegól-nie w przedziale mas cz¹steczkowych od 20 do 40 kDa. Równie¿ w pozo-sta³ych grupach (> 20 kDa, 40-90 kDa) najwy¿sz¹ liczbê polipeptydów obserwowano u osobników w wieku 3-3,5 roku.
Wyniki badañ wskazywaæ mog¹ na osi¹gniêcie pe³nej zdolnoci sekrecyj-nej dodatkowych gruczo³ów p³cio-wych knura w wieku oko³o 3 lat. Zja-wisko to zapewne dotyczy szczegól-nie gruczo³ów pêcherzykowych, które u knura s¹ g³ów-nym ród³em bia³ek plazmy nasienia (15).
Jak wynika z danych przedstawionych na ryc. 2B, najwy¿sz¹, potwierdzon¹ statystycznie, liczbê polipep-tydów obserwowano w okresie jesiennym 122, naj-ni¿sz¹ w letnim 84. W okresie zimowym i wiosen-nym zanotowano wartoci porednie. Wyniki takie dotyczy³y wszystkich grup analizowanych polipepty-dów, niezale¿nie od ich masy cz¹steczkowej. Tym nie-mniej istotny wzrost liczby polipeptydów w okresie jesiennym stwierdzono w grupach w przedziale mas cz¹steczkowych 20-40 kDa i 40-90 kDa, odpowied-nio: 55 i 56. Natomiast dla okresu letniego wartoci te
7,4 7,4 3 5 7 9 10 40-90 kDa (24*) 40-90 kDa (49*) 20-40 kDa (16*) 20-40 kDa (53*) £ 20 kDa (12*) £ 20 kDa (29*) 3 5 7 9 10 94,0 67,0 45,0 30,0 20,1 14,4 14,4 94,0 67,0 45,0 30,0 20,1 Mr (kDa) Mr (kDa) pH pH A. B.
Ryc. 1. Elektroforeza dwukierunkowa (2-D) bia³ek plazmy nasienia knura w wie-ku 12 miesiêcy (A) i 36 miesiêcy (B)
Medycyna Wet. 2008, 64 (2) 226
wynosi³y, odpowiednio, 36 i 37 poli-peptydów. Obserwowane zjawisko wskazywaæ mo¿e na sezonow¹ zmiennoæ w zakresie aktywnoci translacyjnej dodatkowych gruczo³ów p³ciowych knura. Nale¿y nadmieniæ, i¿ ejakulaty kolekcjonowane w mie-si¹cach letnich charakteryzuj¹ siê ob-ni¿on¹ jakoci¹, natomiast jesieni¹ wykazuj¹ najwy¿sz¹ wartoæ biolo-giczn¹ (16).
W posumowaniu nale¿y stwierdziæ, ¿e zmodyfikowana metoda elektrofo-rezy dwukierunkowej (2-D) mo¿e byæ z powodzeniem stosowana w anali-zie bia³ek plazmy nasienia knura. Z kolei uwarunkowany wiekiem knu-rów i por¹ roku polimorfizm map po-lipeptydowych plazmy nasienia knu-ra mo¿e byæ wykorzystany jako mar-ker molekularnych zmian aktywnoci sekrecyjnej dodatkowych gruczo³ów p³ciowych. Stanowiæ mo¿e zarazem istotny wyznacznik kwalifikacji sam-ców do rozrodu.
Pimiennictwo
1.Brandon C. I., Heusner G. L., Caudle A. B., Fayrer--Hosken R. A.: Two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis of equine seminal plasma proteins and their correlation with fertility. Theriogenology 1999, 52, 863-873.
2.Desnoyers L., TherienI., Manjunath P.: Characteri-zation of the major proteins of bovine fluid to two--dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. Mol. Reprod. Dev. 1994, 37, 425-435.
3.Cardozo J. A., Fernandez-Juan M., Forcada F., Abecia A., Muini-Blanco T., Cebrian-Perez J. A.: Monthly variations in ovine seminal plasma pro-teins analyzed by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. Theriogenology 2006, 66, 841--850.
4.Flowers W. L.: Relationships between seminal plasma proteins and boar fertility. Ann. Swine Rep. 2001, 1-4.
5.Fraser L., Dziekoñska A., Strze¿ek J., Strze¿ek R.: Dialysis of boar semen prior to freezing-thawing: Its effect on post-thaw sperm characteristics. Theriogenology 2007 (w druku).
6.Heukeshoven J., Dernick R.: Simplified method for silver staining of pro-teins in polyacrylamide gels and the mechanism of silver staining. Electro-phoresis 1985, 6, 103-112.
7.Killian G. J., Chapman D. A., Rogowski L. A.: Fertility-associated proteins in Holstein bull seminal plasma. Biol. Reprod. 1993, 49, 1202-1207. 8.Laemmli U. K.: Cleavage of structural proteins during the assembly of the
head bacteriophage T4. Nature 1970, 277, 680-685.
9.Mc Dowell K. J., Little T. V., Timoney P. J., Adams M. H.: Characterization of proteins in the seminal plasma of stallions, geldings and geldings supple-mented with testosterone. Res. Vet. Sci. 61, 33-37.
10.OFarrel P. Z., Goodman H. M., OFarrel P. H.: High resolution of two--dimensional electrophoresis of basic as wall as acidic proteins. Cell 1977, 12, 113-142.
11.Panisko E. A., Conrads T. P., Goshe M. B., Veenstra T. D.: The postgenomic age: Characterization of proteomes. Exp. Hemat. 2002, 30, 97-107. 12.Shivaji S., Scheit K. H., Bhargava P. M.: Proteins of Seminal Plasma.
A Willey-Interscience Publications, New York 1990.
13.Strze¿ek J.: Nasienie i u¿ytkowanie rozp³odowe knura, [w:] Wierzbowski S. (red.): Andrologia. Platan-Kryspinów 1996, 201-217.
14.Strze¿ek J.: Plazma nasienia a niektóre funkcje biologiczne plemników. Post. Biol. Kom. 1999, 26, 59-68.
15.Strze¿ek J.: Secretory activity of boar seminal vesicle glands. Biol. Reprod. 2002, 2, 243-266.
16.Strze¿ek J., Demianowicz W., Luberda Z., Torska J.: The effect of season on acrosin activity and plasmolemma susceptibility of boar spermatozoa. Proc. 12th Int. Congess Anim. Reprod. The Hague, Netherlands 1992, 4, 532-534.
17.Strze¿ek J., Wysocki P., Kordan W., Kukliñska M., Mogielnicka M., Soli-woda D., Fraser L.: Proteomics of boar seminal plasma current studies and possibility of their application in biotechnology of animal reproduction. Reprod. Biol. 2005, 5, 279-290.
18.Weichselbaum T. E.: An accurate and rapid method for the determination of proteins in small amounts of blood serum and plasma. Am. J. Clin. Path. Techn. Sekt. 1946, 10, 40.
Adres autora: dr hab. W³adys³aw Kordan, prof. nadzw. UWM, ul. Ocza-powskiego 5, 10-718 Olsztyn; e-mail: w³adys³aw.kordan@uwm.edu.pl
Ryc. 2. Wp³yw wieku knurów (A), (n = 12) oraz pory roku (B), (n = 12) na liczbê polipeptydów plazmy nasienia knura po elektroforezie 2D
Objanienia: a, b, A, B, C rednie oznaczone ró¿nymi literami ró¿ni¹ siê istotnie: ma³ymi przy p £ 0,05; du¿ymi przy p £ 0,01
A. 0 10 20 30 40 50 60 70 100 130 160 Liczba polipeptydów Liczba polipeptydów Liczba polipeptydów Liczba polipeptydów 0 10 20 30 40 50 60 70 100 130 160
>20 kDa 20-40 kDa 40-90 kDa
a b a a b b b b a S B. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 120 160 0 10 20 30 40 50 60 70 80 120 160
>20 kDa 20-40 kDa 40-90 kDa
A B A A A C C B B B B B B B B B S jesieñ zima wiosna lato 12 miesiêcy 24 miesi¹ce 36 miesiêcy 42 miesi¹ce
