Medycyna Weterynaryjna - Summary Medycyna Wet. 62 (7), 797-800, 2006

Medycyna Wet. 2006, 62 (7) 797

Praca oryginalna Original paper

Wed³ug zaleceñ Europejskiej Agencji Oceny Pro-duktów Medycznych (EMEA), metody analityczne s³u¿¹ce do okreœlania pozosta³oœci leków weteryna-ryjnych musz¹ byæ zwalidowane, tzn. spe³niaæ szereg wymogów potwierdzaj¹cych ich przydatnoœæ (2). Pa-rametrami charakteryzuj¹cymi przydatnoœæ metody s¹: potwierdzenie identycznoœci, selektywnoœci i specy-ficznoœci, granica wykrywalnoœci, granica oznaczenia iloœciowego, zakres roboczy i zakres liniowoœci, do-k³adnoœæ, precyzja, czu³oœæ, powtarzalnoœæ i odtwa-rzalnoœæ, niepewnoœæ pomiaru, odpornoœæ metody na zmiany warunków oraz odzysk. Ponadto procedury analityczne nie powinny byæ kosztowne. Wobec tak rygorystycznych wymogów, wszelkie uprzednio wy-konane badania z zastosowaniem niezwalidowanych metod straci³y na swym znaczeniu (1, 3, 4-6, 10, 13). Szczegó³owe za³o¿enia dotycz¹ce walidacji metod analitycznych stosowanych w badaniach farmako-kinetycznych i dostêpnoœci biologicznej obejmuj¹ (2, 8, 11, 14):

– trwa³oœæ analitu w matrycy biologicznej, tj. za-wartoœæ analitu w próbkach biologicznych w trakcie procedury analitycznej w temperaturze pokojowej oraz podczas przechowywania próbek (w temp. np. 4°C, –20°C lub –80°C) nie powinna zmieniaæ siê wiêcej ni¿ o ± 5% lub o ± 15% w przypadku derywatyzacji oraz okreœlenie wp³ywu na powy¿sz¹ zawartoœæ ana-litu co najmniej dwóch cykli zamra¿ania (np. do –20°C i/lub do –80°C) i rozmra¿ania próbek biologicznych,

– selektywnoœæ metody, która odnosi siê do meta-bolitów analitu, ewentualnie jego produktów rozk³a-du i zwi¹zków egzogennych, np. innych leków,

stoso-wanych u danego pacjenta. Wymaga to sprawdzenia metody nie tylko na próbkach materia³u biologiczne-go, nastrzykiwanego danym analitem, lecz tak¿e w od-niesieniu do próbek pobranych od chorego lub do-œwiadczalnego zwierzêcia otrzymuj¹cego dany lek,

– kierunek: metoda analityczna powinna dotyczyæ leku i/lub jego metabolitu, które decyduj¹ o dzia³aniu farmakologicznym,

– sposób wykonania krzywej: krzyw¹ wzorcow¹ nale¿y obliczyæ metodami statystycznymi, na podsta-wie 5-8 punktów doœwiadczalnych, stanowi¹cych œred-ni¹ z 2-3 próbek,

– ustalenie zakresu stê¿eñ krzywej wzorcowej. W tym celu nale¿y wyznaczyæ doln¹ granicê wykry-walnoœci (LOD) i doln¹ granicê oznaczalnoœci (LOQ). LOD jest to najmniejsze stê¿enie, którego pik mo¿na odró¿niæ od szumów. LOQ powinna co najmniej 2 razy przewy¿szaæ LOD,

– dok³adnoœæ, która okreœla odchylenie (w %) ozna-czonej wartoœci od wartoœci prawdziwej. Odzysk do-danego analitu do matrycy w zakresie oznaczanych stê¿eñ jest przewa¿nie miar¹ dok³adnoœci. Odzysk akceptowany przez ró¿nych autorów wynosi 50%, 80% lub 90%.

– precyzjê, która jest miar¹ powtarzalnoœci wyni-ków oznaczeñ wielokrotnych tej samej próbki. Zwy-kle odnosi siê j¹ do oznaczeñ w danym dniu i do ozna-czeñ w kolejnych dniach. Powinny byæ wyznaczone dla co najmniej 3 ró¿nych stê¿eñ z zakresu krzywej wzorcowej: zbli¿onych do LOQ, w pobli¿u stê¿enia œrodkowego i tu¿ poni¿ej stê¿enia maksymalnego. Œrednie wartoœci precyzji i dok³adnoœci powinny siê

Walidacja metody oznaczania 8-a-hydroksymutyliny

w materiale biologicznym

RAFA£ ZAÑ, CEZARY KOWALSKI, ARTUR BURMAÑCZUK

Zak³ad Farmakologii Katedry Przedklinicznych Nauk Weterynaryjnych Wydzia³u Medycyny Weterynaryjnej AR, ul. Akademicka 12, 20-033 Lublin

Zañ R., Kowalski C., Burmañczuk A.

Validation method for determination of 8-a-hydroxymutilin in biological material Summary

A validation method is a key element in both the elaboration of reference methods and the assessment of a laboratory's competence in producing reliable analytical data. The aim of the study was to validate the GC method (according to Marcus and Sherma), which is used in determining 8-a-hydroxymutilin in a biological matrix (swine tissues: liver and muscles). The fundamental parameters for validation, including accuracy, precision, selectivity, sensivity, reproductibility and stability, were estimated. The studies confirmed the usefulness of the GC method for determining tiamulin residues in swine tissues.

Medycyna Wet. 2006, 62 (7) 798

mieœciæ w zakresie ± 15% wartoœci prawdziwej. Jedy-nie dla LOQ jest akceptowalna wartoœæ Jedy-nie przewy¿-szaj¹ca 20%.

Celem badañ by³a walidacja metody oznaczania tia-muliny w tkankach wskaŸnikowych œwiñ.

Materia³ i metody

Procedura. Walidacji poddano metodê GC wg Marcus i Sherma (9), za pomoc¹ której mo¿na okreœliæ poziom mar-kera pozosta³oœci tiamuliny w tkankach zwierzêcych. Wa-lidowana metoda sk³ada siê z wielu etapów, prowadz¹cych do otrzymania finalnej próby z analitem przystosowanym do oznaczeñ za pomoc¹ chromatografu GC wyposa¿onego w detektor wychwytu elektronów. W tym celu ka¿d¹ próbê na odzysk oraz próby œlepe poddawano identycznej proce-durze jak próby pozyskane od zwierz¹t doœwiadczalnych, tzn. homogenizacji tkanek, dwukrotnej ekstrakcji tiamuli-ny z tkanek, eliminacji t³uszczu (w temp. –80°C), etapowi hydrolizy metabolitów tiamuliny, etapowi sprzêgania me-tabolitów w celu formowania fluorowej pochodnej 8-a-hy-droksymutyliny oraz etapowi oczyszczania derywatu (9).

Trwa³oœæ analitu w matrycy biologicznej. Badania trwa³oœci analitu przeprowadzono na próbkach w¹troby i miêœni, poddanych ca³emu cyklowi analitycznemu we-d³ug Marcus i Sherma (9), rozpuszczonych w benzenie. Próbki przechowywano w szczelnie zamkniêtych kolbach w temp. 4°C, –20°C i –80°C. Poziom analitu oceniano co-dziennie przez okres 1 tygodnia, za pomoc¹ chromatografu gazowego Unicam, wyposa¿onego w detektor wychwytu elektronów (ECD).

Zakres liniowy metody. Krzyw¹ kalibracyjn¹ dla chro-matograficznego oznaczania fluorowcopochodnej 8-hy-droksymutyliny, z wykorzystaniem detektora wychwytu elektronów (ECD), wykreœlono na podstawie piêciu punk-tów kalibracyjnych (tab. 1).

Do punktów kalibracyjnych, metod¹ najmniejszych kwa-dratów, dopasowano krzyw¹ kalibracyjn¹ (ryc. 1) w

posta-ci y = ax + b, gdzie y oznacza pole po-wierzchni piku, x oznacza stê¿enie analitu. P r o c e d u r a sprawdzenia do-k³adnoœci metody GC na podstawie okreœlenia stopnia odzysku 8-a-hy-droksymutyliny z tkanek

kontrol-nych. Do próbek tkanek kontrolnych (w¹troba, miêœnie) o masie 30,0 g dodawano po 2 µg, 4µg i 6 µg/ml wzorca 8-a-hydroksymutyliny i poddawano analogicznej procedu-rze wg Marcus i Sherma (9).

Potwierdzenie specyficznoœci metody oznaczania 8-a-hydroksymutyliny przy u¿yciu GC/MS wg Marcus i Sherma (10). Po analizie na chromatografie gazowym (GC) prób na odzysk, dokonano walidacji próbki w¹troby badanej przy u¿yciu GC/MS.

Okreœlenie granicy wykrywalnoœci (LOD) i oznaczal-noœci (LOQ). Z krzywej kalibracyjnej wyznaczono rów-nie¿ granicê wykrywalnoœci LOD (limit of detection) (dane tab. 2) wed³ug wzoru:

3 · s_yx LOD = _a

i granicê oznaczalnoœci LOQ (limit of quantification) we-d³ug wzoru:

3 · s_yx LOD = ._a Wyniki i omówienie

W trakcie badañ nie stwierdzono znacznych odchy-leñ (³ 15%) zawartoœci analitu w próbkach, co jest zgodne z za³o¿eniami walidacji me-tod analitycznych dotycz¹cych dery-watów.

Na podstawie procedury przepro-wadzonej dla standardu wewnêtrzne-go do wykreœlenia krzywej wzorco-wej, ustalono œredni¹ wartoœæ odzys-ku ± SD, która wynosi³a œrednio dla w¹troby 86,82% i dla miêœni 74,43%. W trakcie badañ nad stopniem odzys-ku nie stwierdzono znacz¹cego nak³a-dania siê pików w próbach, co po-twierdza dostateczn¹ procedurê oczyszczania próbek. Ponadto, pik fluorowcowej pochodnej 8-a-hydro-ksymutyliny (XP) by³ g³ównym pi-kiem stwierdzanym na chromatogra-mach, co œwiadczy o specyficznoœci i czu³oœci procedury u¿ytej do ozna-czania markera pozosta³oœci tiamuliny. Badaniem GC/MS potwierdzono wystêpowanie XP w próbce w¹troby Tab. 1. Punkty kalibracyjne s³u¿¹ce do wykreœlenia krzywej kalibracyjnej

r N Stê¿enixeanaltiu ]l m / g n [ y i n h c z r e i w o p e l o P u k i p 1 110 1174,22 2 150 1415,57 3 100 1776,98 4 200 1589,93 5 400 3225,19 Krzywa kalibracyjna Sygna³ [pole pow .] -500 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 Stê¿enie [ ng/ml ] punkty krzywa kalibracyjna – +

Ryc. 1. Równanie krzywej oraz krzywa kalibracyjna dla 8-a-hydroksymutyliny. Równanie krzywej: y = 8,0637971 x + (–9,319155) Odchylenia od krzywej -30 -20 -100 10 20 30 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 Stê¿enie [ ng/ml ]

Medycyna Wet. 2006, 62 (7) 799

badanej na odzysk z dodanym standardem 8-a-hydro-ksymutyliny, którego nie stwierdzano w próbkach tka-nek kontrolnych. Badaniem spektrometrycznym wy-kazano dla 8-a-hydroksymutyliny sprzê¿onej z

bez-wodnym pentafluoropropionianem, nastêpuj¹ce cha-rakterystyczne piki jonów cz¹steczkowych: 285, 325 i 447 (ryc. 6) dla tego standardu zgodnych z danymi w pracy Marcus i Sherma (10). Wyznaczone granice wykrywalnoœci i oznaczalnoœci wynios³y odpowiednio: LOD = 7,270872 ng/ml oraz LOQ = 23,99388 ng/ml. Nowoczesne metody chromatograficzne, dziêki za-stosowaniu odpowiednich kolumn chromatograficz-nych i czu³ych aparatów detekcyjchromatograficz-nych, pozwalaj¹ na precyzyjne okreœlanie nawet œladowych zawartoœci substancji w badanych próbkach materia³u biologicznego. Metoda oznaczeñ tiamuliny wg Marcus i Scherma (9) w modyfikacji w³asnej, dziêki zastosowaniu me-tody chromatografii gazowej cha-rakteryzuj¹cej siê stosunkowo wysokim stopniem rozdzielczoœ-ci oraz detektorowi wychwytu elektronów, który posiada zdol-noœæ detekcji 2 × 10-14 g/s (12) jest odpowiednim narzêdziem s³u¿¹cym do oznaczenia pozio-mu markera pozosta³oœci tej sub-stancji w tkankach zwierzêcych. Pozwala ona na wykrycie tej sub-stancji ju¿ przy stê¿eniach powy-¿ej 30 ng/g, co jest istotne zw³aszcza przy badaniu tkanek wskaŸnikowych pochodz¹cych od zwierz¹t leczonych tiamulin¹.

Tak¿e metody walidacyjne, m.in. badanie z zasto-sowaniem spektrometru masowego, potwierdzaj¹ traf-noœæ w wyborze techniki chromatograficznej oraz

po-Ryc. 3. Chromatogram – standard

ze-wnêtrzny 100 ng Ryc. 4. Chromatogram – standard ze-wnêtrzny 200 ng Ryc. 5. Chromatogram – standard ze-wnêtrzny 400 ng Tab. 2. Parametry wyznaczone za pomoc¹ regresji liniowej

) e i n e l y h c a n ( y w o k n u r e i k k i n n y z c ³ ó p s W a 8,0637971 y n l o w z a r y W b –9,319155 ij c a l e r o k k i n n y z c ³ ó p s W r_xy 0,9999093 .r e i k .³ ó p s w e w o d r a d n a t s e i n e l y h c d O s_a 0,0627249 o g e n l o w u z a r y w e w o d r a d n a t s e i n e l y h c d O s_b 12,93411 y d o t e m e w o d r a d n a t s e i n e l y h c d O s_yx ) u r a i m o p o g e z c n y d e j o p d ¹ ³ b ( (p1o9l,e54p3o6w1).

Tab. 3. Sprawdzenie dok³adnoœci metody chromatograficznej /GC/ na podstawie pro-centu odzysku markera tiamuliny – 8-a-hydroksymutyliny z tkanek kontrolnych œwiñ

i k b ó r p r N _oznD_aa_czta_enia wStêtk¿aennciee ) g n ( a i n d e r Œ x ±SD RSD% Odzysk% Odxzysk O±dzSyDsk M₁ 09.04.03 103,876 4 9 7 , 3 0 1 2,862075 2,75745 7 5 9 4 , 4 7 3 4 , 4 7 2,052 M₂ 11.04.03 105,072 75,3536 M₃ 13.04.03 198,842 70,8854 M₄ 16.04.03 105,314 75,5272 M₅ 18.04.03 105,866 75,9229 W₁ 20.04.03 120,445 4 7 0 , 1 2 1 3,312366 2,73581 4 8 7 3 , 6 8 2 8 , 6 8 2,375 W₂ 22.04.03 117,960 84,5963 W₃ 24.04.03 117,940 84,5784 W₄ 27.04.03 124,165 89,0466 W₅ 29.04.03 124,867 89,5496

Objaœnienia: M – próbka miêœni, W – próbka w¹troby

Medycyna Wet. 2006, 62 (7) 800

prawnoœæ wstêpnego procesu obróbki tkanek przy oznaczaniu poziomu zawartoœci tiamuliny i jej meta-bolitów w organizmie zwierzêcym. Spektrometria mas (MS) jest jedn¹ z najskuteczniejszych metod analizy jakoœ-ciowej i analizy strukturalnej zwi¹zków orga-nicznych, a tak¿e odgrywa znacz¹c¹ rolê w iloœciowej analizie œladów ró¿nych zwi¹zków.

Po³¹czenie chromatografii gazowej ze spektrome-tri¹ mas stworzy³o jedno z najbardziej skutecznych narzêdzi w analizie skomplikowanych mieszanin zwi¹zków organicznych, gdy¿ chromatograf gazowy rozdziela mieszaniny i wprowadza do spektrometru mas czyste zwi¹zki o odpowiedniej lotnoœci, z szyb-koœci¹ dostosowan¹ do szybkoœci procesów zachodz¹-cych w MS. Natomiast spektrometr mas identyfikuje dany zwi¹zek (pe³ni zatem funkcjê detektora jakoœcio-wego) i oznacza poszczególne sk³adniki iloœciowo (12).

Ka¿da nowa metoda badawcza wymaga przeprowa-dzenia procesu walidacji w laboratorium wykonuj¹-cym dane oznaczenia. Taka procedura pozwala sku-tecznie oceniæ trafnoœæ w doborze odczynników che-micznych, dostroiæ aparaturê analityczn¹ oraz doko-naæ modyfikacji w metodzie podyktowanych specyfi-k¹ oœrodka badawczego.

Wg zaleceñ EMEA, poziom pozosta³oœci tiamuliny u œwiñ nale¿y przeprowadziæ na dwóch tkankach wskaŸnikowych – w¹trobie i miêœniach (7). Natomiast procedury opisane w metodzie Marcus i Sherma, na które powo³uj¹ siê organizacje odpowiedzialne za re-jestracjê leków, dotycz¹ oznaczania fluorowcopochod-nych metabolitów tiamuliny tylko w w¹trobie œwiñ. Z tego powodu zaistnia³a koniecznoœæ adaptacji i sprawdzenia przydatnoœci ww. metody w stosunku

do tkanki miêœniowej. Metodê walidacji dla miêœni przeprowadzono na 30 g homoge-natu tkanki, dodaj¹c takie same iloœci mar-kera pozosta³oœci tiamuliny jak w przypad-ku w¹troby. Analiza GC próbek miêœni do-wiod³a, ¿e próbki sporz¹dzone z takiej sa-mej iloœci tkanki (30 g), jak próbki z w¹tro-by, daj¹ zbli¿one pod wzglêdem pola po-wierzchni piki. Tkanka miêœniowa przesz³a taki sam wstêpny proces przygotowania do analizy za pomoc¹ GC. W trakcie badañ stwierdzono, ¿e podczas etapu g³êbokiego wymra¿ania, maj¹cego za zadanie usuniê-cie t³uszczu, z próbek miêœni wytr¹ca siê jego wiêksza iloœæ. Dlatego te¿ proces wy-mra¿ania (–80°C) wyd³u¿ono z 10 do 20 min. Metoda wg Marcus i Sherma (9) mówi o dowolnoœci w zastosowaniu powietrza b¹dŸ azotu podczas usuwania par rozpusz-czalników z kolb po procesie odparowywa-nia. Podczas badañ stwierdzono jednak, ¿e zastosowanie powietrza do ww. celu, nie-korzystnie wp³ywa³o na dalsze etapy przy-gotowania próbek do analizy tzn. etap de-rywatyzacji. Zwi¹zane by³o to najprawdopodobniej z zawartoœci¹ œladowych iloœci pary wodnej w stoso-wanym powietrzu, które uniemo¿liwia tworzenie fluo-rowych pochodnych tiamuliny.

Piœmiennictwo

1.Anon.: Freedom of Information Office, Center for Veterinary Medicine, Sup-plement to NADA 139-472, Environmental Assessment, Denagard® (tia-mulin) Premixes, July 1988.

2.Anon.: Guidance for Industry, Bioanalytical Method Validation. FDA, Cen-ter for Drug valuation and Research, CVM, May 2001.

3.Anon.: Joint FAO/WHO Expert on Food Additives: Evaluation of certain veterinary drug residues in food. World Health Organisation, Technical Re-port, Geneva, Series 763 (32), 1988.

4.Anon.: Komisja Rejestracji Œrodków Farmaceutycznych i Materia³ów Me-dycznych. Materia³y, Wyd. I, Warszawa 1997.

5.Anon.: Note for Guidance: Approach Towards Harmonisation of Withdrawal Periods. EMEA/CVMP/036/95-Final, March 1996.

6.Anon.: Note for guidance on the risk analysis approach for residues of vete-rinary medicinal products in food of animal origin. EMEA/CVMP/187/00--Final, 2001.

7.Anon.: Tiamulin Summary Report (3). Committee for Veterinary Medicinal Products EMEA/MRL/747/00-Final, July 2000.

8.Hibbert D.: Method validation of modern analytical techniques. Accred Qual Assur, 1999, 4, 352-356.

9.Marcus J., Sherma J.: Method IV. Gas chromatographic determination of tiamulin residues in swine liver. J. AOAC Int. 1993, 76, 451-458. 10.Marcus J., Sherma J.: Method V. Gas chromatographic/ mass spectro metric

confirmation of 8-hydroxymutilin, a tiamulin metabolite, in swine liver extracts. J. AOAC Int. 1993, 76, 459-460.

11.Piskorska-Pliszczyñska J.: Walidacja metod badawczych – wymagania, za-lecenia i praktyka. Medycyna Wet. 2002, 58, 827-831.

12.Rödel W., Wölm G.: Chromatografia gazowa. Wyd. Nauk. PWN, Warszawa 1992.

13.Shah V., Midha K., Findlay J., Hill H., Hulse J., McGilveray I., McKay G., Miller K., Patnaik R., Powell M., Tonelli A., Viswanathan C., Yacobi A.: Bioanalytical method validation – a revisit with a decade of progress. Phar-maceut. Res. 2000, 17, 1551-1557.

14.Trullols E., Ruisanchez I., Ruis F.: Validation of qualitative analytical me-thods. Trends Anal. Chem. 2004, 23, 137-145.

Adres autora: dr Rafa³ Zañ, ul. Akademicka 12, 20-033 Lublin; e-mail: rafal.zan@ar.lublin.pl

Ryc. 6. Widmo masowe dla 8-a-hydroksymutyliny – markera pozosta³oœci tiamuliny