Ziemniak Polski 2012 nr 2 1
Hodowla i genetyka
M
M
M
E
E
E
T
T
T
O
O
O
D
D
D
Y
Y
Y
E
E
E
LL
L
II
I
M
M
M
II
I
N
N
N
A
A
A
C
C
C
JJ
J
II
I
W
W
W
II
I
R
R
R
U
U
U
S
S
S
Ó
Ó
Ó
W
W
W
Z
Z
Z
R
R
R
O
O
O
Ś
Ś
Ś
LL
L
II
I
N
N
N
II
I
N
N
N
V
V
V
II
I
T
T
T
R
R
R
O
O
O
Z
Z
Z
II
I
E
E
E
M
M
M
N
N
N
II
I
A
A
A
K
K
K
A
A
A
mgr Paulina Smyda
IHAR – PIB, Oddział w Młochowie, ul. Platanowa 19, 05-831 Młochów e-mail: p.smyda@ihar.edu.pl
ośliny rozmnażające się wegetatyw-nie, do których należy ziemniak uprawny (Solanum tuberosum L.), łatwo kumulują wirusy w różnych częściach rośliny, w tym w bulwach. W wyniku tego rośliny rozmnażane z bulw z każdym rokiem są coraz bardziej porażone wirusami. Cho-roby wirusowe osłabiają wigor roślin oraz obniżają odporność ziemniaka na inne pato-geny, co prowadzi do obniżenia plonu i jako-ści bulw (Nascimento i in. 2003, Wang i in. 2008, Mahmoud i in. 2009). Dlatego też ważne jest, aby materiał służący do rozmno-żeń, szczególnie sadzeniaki, był wolny od wirusów.
Zdrowy materiał można uzyskać poprzez uwalnianie od wirusów zainfekowanych ro-ślin. Do znanych metod uwalniania roślin należy kultura in vitro merystemów wierz-chołkowych połączona z termo-, chemo- i/lub krioterapią (Mellor, Stace-Smith 1970; Mah-moud i in. 2009). Kultury in vitro pozwalają na szybkie namnożenie materiału roślinnego oraz poddanie roślin odpowiedniej terapii, prowadzącej do otrzymania zdrowych roślin o każdej porze roku (Nascimento i in. 2003). Najlepsze rezultaty daje zastosowanie co najmniej dwóch z wyżej wymienionych tech-nik.
Kultura merystemów
Rośliny przed wprowadzeniem do kultur in
vitro są sprawdzane w testach ELISA pod
kątem porażenia wirusami Y (PVY), M (PVM), X PVX), S (PVS) i liściozwoju (PLRV) ziemniaka. Sprawdzana jest także obecność wiroida wrzecionowatości bulw ziemniaka (PSTVd) i bakterii Clavibacter
michiganen-sis, które są patogenami kwarantannowymi.
Obecność patogenów kwarantannowych na ogół eliminuje formy z dalszej pracy. Spo-śród testowanych roślin wybiera się te, które są wolne od wirusów lub mają najniższą koncentrację wirusów. Z tych roślin pobiera się pędy wierzchołkowe i poddaje je steryli-zacji powierzchniowej w celu ochrony przed infekcjami. Tak przygotowane rośliny
wpro-wadza się w warunki in vitro.
Jedną z najlepszych metod odwirusowy-wania zainfekowanych roślin jest kultura merystemów wierzchołkowych ziemniaka, którą można poprzedzić termo- lub chemote-rapią (Nascimento i in. 2003, Awan i in. 2007). Kultura merystemów wierzchołko-wych pędu jest pierwszą, najwcześniej sto-sowaną techniką eliminacji wirusów z roślin. Merystem wierzchołkowy pędu jest to ma-ły, szczytowy jego obszar, który składa się z drobnych, szybko dzielących się komórek. W tych częściach rośliny nie ma wirusów lub ich koncentracja jest bardzo mała. Technika uwalniania roślin oparta na kulturze mery-stemów jest prosta, jednak ma pewne ogra-niczenia. Jest metodą długotrwałą, ponieważ czas regeneracji roślin wynosi od 6 do 8 ty-godni. Izolowane merystemy muszą być bardzo małe (nie większe niż 0,3 mm), po-nieważ efektywność eliminacji wirusów jest proporcjonalna do ich wielkości (Wang i in. 2006). W pracy tej wymagana jest duża pre-cyzja w izolacji merystemów pod binokula-rem, gdyż drobne uszkodzenia mają wpływ na procent zregenerowanych merystemów wierzchołkowych (Dewi, Slack 1994).
Termoterapia kultur in vitro
Ziemniak Polski 2012 nr 2
2
Termoterapia w celu eliminacji wirusów po-lega na traktowaniu roślin wysoką tempera-turą przez określony czas (Kryszczuk 1999). Traktowanie roślin in vitro ziemniaka tempe-raturą 33-45oC przez ok. 2 tygodnie
eliminu-je kilka wirusów, głównie PLRV, PVY i wirus A (PVA), oraz niektóre systemiczne bakterie. Proces termoterapii rozpoczyna się od na-mnożenia porażonych wirusami roślin in vitro w drodze kultury wierzchołków i pąków bo-cznych pędów na pożywce regeneracyjnej MS (Murashige-Skooga). Po czterech tygo-dniach kultury rośliny in vitro przenosi się do komory fitotronowej, w której przez dwa ty-godnie są poddawane wysokiej temperatu-rze, czyli termoterapii. Po termoterapii z ro-ślin izoluje się merystemy wierzchołkowe wielkości 1 mm i umieszcza na pożywce MS wzbogaconej hormonami roślinnymi.
Na efektywność termoterapii największy wpływ mają takie czynniki jak temperatura, czas trwania oraz wrażliwość genotypu na stres termiczny (Kryszczuk 1999). Rośliny niektórych genotypów na działanie wysokiej temperatury reagują stresem termicznym, pojawiają się na nich nekrozy lub dochodzi do zamierania całych roślin. Dlatego warunki termoterapii, czyli czas oraz wysokość tem-peratury, należy dostosować indywidualnie do poszczególnych genotypów.
Ograniczeniem termoterapii jest jej cza-sochłonność i brak wrażliwości niektórych wirusów (PVM, PVS, PVX) na wysokie tem-peratury. Dodanie do pożywki związków zwiększających tolerancję roślin na wysoką temperaturę (kwasu salicylowego lub nad-tlenku wodoru) indukuje termotolerancję i może zwiększyć przeżywalność roślin pod-danych procesowi termoterapii (Lopez-Del-gado i in. 1998, Lopez-Del(Lopez-Del-gado i in. 2004). W niektórych przypadkach wzrost tempera-tury wywołuje jedynie zmniejszenie koncen-tracji wirusów w tkance roślinnej, a nie ich eliminację (Paet i in. 1990).
Chemoterapia
Coraz częściej stosowaną metodą uwalnia-nia roślin ziemuwalnia-niaka od wirusów jest chemo-terapia. Jest to metoda uzupełniająca w sto-sunku do termoterapii. W chemoterapii wy-korzystuje się antymetabolity – związki che-miczne, naturalne lub syntetyczne, blokujące metabolizm wirusów oraz substancje
induku-jące odporność na dane wirusy. Najczęściej wykorzystuje się analogi nukleotydów bloku-jące syntezę wirusowego RNA lub DNA (Na-scimento i in. 2003). Antymetabolitem naj-bardziej znanym i najczęściej stosowanym do eliminacji wirusów z roślin ziemniaka jest rybawiryna (RBV). Jest to inhibitor replikacji wirusów ziemniaka, zwłaszcza PVM, PVS i PVX. Zaletą tej metody jest jej prostota. Chemoterapia połączona z kulturą meryste-mów wierzchołkowych może całkowicie eli-minować wirusy X i Y ziemniaka (Klein, Livingston 1983). Związki antywirusowe są dodawane do pożywki w czasie trwania kul-tury. Efektywność działania rybawiryny może ulec osłabieniu, gdy koncentracja wirusa w roślinie jest wysoka lub gdy roślina jest zain-fekowana kilkoma wirusami (Griffiths i in. 1990; Dewi, Slack 1994).
Najlepszym sposobem eliminacji wirusów z roślin ziemniaka jest połączenie obydwu technik, termoterapii i chemoterapii, prowa-dzonych w warunkach in vitro (Griffiths i in. 1990, Nascimento i in. 2003).
Krioterapia
Krioterapia merystemów wierzchołkowych to stosunkowo nowa technika uwalniania roślin od wirusów, oparta na technice zamrażania merystemów w ciekłym azocie o temperatu-rze -196oC (Wang, Valkonen 2009). Po po-traktowaniu zainfekowanych merystemów ciekłym azotem odmraża się je, a następnie regeneruje (Wang i in. 2009). W zregenero-wanych roślinach nie ma wirusów lub ich koncentracja jest obniżona. Technika ta nie jest skomplikowana i można jednocześnie uwolnić od wirusów dużą liczbę próbek. Zop-tymalizowana procedura krioterapii pozwala na efektywne uwalnianie roślin ziemniaka od wirusów, szczególnie od PVY i PLRV (Wang i in. 2009). Efektywność regeneracji roślin z merystemów po krioterapii wynosi od 10 do 85% w zależności od genotypu (Wang i in. 2006, Smyda 2011) i może być niższa w porównaniu z regeneracją z kultury mery-stemów. Jednak liczba roślin uwolnionych od wirusów metodą krioterapii jest większa, 83- -95% dla PLRV i PVY, niż w metodzie kultur merystemów – 56-62% dla tych samych wi-rusów (Wang i in. 2006).
Ziemniak Polski 2012 nr 2 3
Zastosowanie metod odwirusowywania roślin w oddziale IHAR-PIB w Młochowie
W Młochowie prowadzi się prace mające na celu uwalnianie od wirusów cennych genoty-pów ziemniaka. Po uwolnieniu genotypy te zabezpiecza się w banku genów in vitro i/lub zostają one wprowadzone do ciekłego azotu i w takich warunkach są długoterminowo przechowywane (kriokonserwacja). Rośliny ziemniaka uwalnia się od wirusów w kultu-rach merystemów za pomocą uzupełniają-cych się metod termo- i chemoterapii. Wprowadzone do kultur in vitro rośliny wyse-lekcjonowanych genotypów namnaża się na pożywce MS. Po uzyskaniu odpowiedniej liczby kopii roślin przystępuje się do procesu termoterapii. Czterotygodniowe, ukorzenione rośliny (ok. 20 z genotypu) umieszcza się w komorze fitotronowej z regulowaną tempera-turą na 2 tygodnie. W czasie termoterapii wprowadza się fotoperiod: w ciągu dnia (16 godzin) temperatura wynosi 37oC, a podczas ośmiogodzinnej nocy jest obniżona do 35o
C. Po zakończeniu termoterapii z roślin izoluje się merystemy wierzchołkowe i umieszcza je na pożywce MS wzbogaconej hormonami roślinnymi. Zregenerowane rośliny dzieli się na dwie kopie i ukorzenia na pożywce MS. Po ok. 4 tygodniach przeprowadza się test serologiczny ELISA w celu wykrycia wiru-sów. W wypadku stwierdzenia nieobecności któregokolwiek z wirusów w roślinie jej kopia zostaje przekazana do banku genów in vitro. Jeżeli nie uzyskano roślin wolnych od wiru-sów, stosuje się kolejny cykl termoterapii.
Ponieważ w wyniku termoterapii usuwane są głównie PLRV i PVY, po cyklu termotera-pii przeprowadza się proces chemoteratermotera-pii, skierowany szczególnie na PVM, PVS i PVX. Jako środek przeciwwirusowy wykorzystuje się rybawirynę. Na pożywce MS z dodatkiem rybawiryny następuje namnożenie materiału roślinnego. Po 4 tygodniach izoluje się me-rystemy wierzchołkowe i umieszcza na po-żywce MS z hormonami. Po ukorzenieniu dzieli się każdą z roślin na dwie kopie. Po ok. 4 tygodniach przeprowadza się test ELI-SA i podobnie jak to ma miejsce w termote-rapii zdrowe rośliny zostają wprowadzone do banku genów in vitro.
W ostatnim czasie, stosując połączone metody termo- i chemoterapii, uwolniono od
wirusów 24 genotypy ziemniaka i zabezpie-czono je w kolekcji in vitro. Proces uwalnia-nia roślin ziemuwalnia-niaka od wirusów wymaga ciągłej optymalizacji metod, uwzględniania indywidualnych reakcji poszczególnych ge-notypów, by zwiększyć efektywność terapii i uzyskać oczekiwane efekty.
Literatura
1. Awan A. R., Mughal S. M., Iftikhar Y., Khan H. Z. 2007. In vitro elimination of potato leaf roll polerovirus
from potato varieties. – Eur. J. Sci. Res. 18: 155-164;
2. Dewi I. S., Slack S. A. 1994. Therapy cycling to
eliminate high-titered, multiple virus infection in vitro
potato plantlets. – Bull. Agron. 22(2): 35-43; 3.
Grif-fitths H. M., Slack S. A., Dodds J. H. 1990. Effect of
chemical and heat therapy in virus concentrations in
vitro potato plantlets. – Can. J. Bot. 68: 1515-1521;
4. Klein R. E., Livingston C. H. 1983. Eradication of
potato viruses X and S from potato shoot tip cultures with ribavirin. – Phytopathology 65: 826-828; 5.
Krysz-czuk A. 1999. Termoterapia i kultura merystemów jako
jedna z metod uzyskiwania roślin ziemniaka wolnych od wirusów. – Biul. IHAR 212: 151-157; 6. Lopez-
-Delgado H., Dat J. F., Foyer C. H., Scott I. M. 1998.
Induction of thermotolerance in potato microplants by
acetylsalicylic acid and H2O2. – J. Exp. Bot. 49(321):
713-720; 7. Lopez-Delgado H., Mora-Herrera M. E.,
Zavaleta-Mancera H. A., Cadena-Hinojosa M., Scott I. M. 2004. Salicylic acid enhanced heat tolerance and
Potato Virus X (PVX) elimination during thermotherapy
of potato microplants. – Am. J. Potato Res. 81: 171-
-176; 8. Mahmoud S. Y. M., Hosseny M. H., Abdel-
-Ghaffar M. H. 2009. Evaluation of some therapies to
eliminate potato Y potyvirus from potato plants. – Int. J. Virol. 5(2): 64-76; 9. Mellor F. C., Stace-Smith R.
1970. Virus strain differences in eradication of potato
virus X and S. – Phytopathology 60: 1587-1590;
10. Nascimento C. L., Pio-Ribeiro G., Willadino L., Andrade G. P. 2003. Stock indexing and potato virus
Y elimination from potato plants cultivated in vitro. –
Sci. Agric. 60(3): 525-530; 11. Paet C. N., Zamora A.
B. 1990. Efficacy of thermotherapy and group culture
of isolated potato meristems for elimination of single and mixed infections of Potato Virus Y, Potato Virus S and Potato Leaf Roll Virus. – Philipp J. Crop Sci. 15(2): 113-118; 12. Smyda P. 2011. Zastosowanie kriokon-serwacji do przechowywania zasobów genowych
ziemniaka. – Ziemn. Pol. 2: 12-15; 13. Wang Q., Liu
Y., Xie Y., You M. 2006. Cryotherapy of potato shoot
tips for efficient elimination of Potato Leafroll Virus
(PLRV) and Potato Virus Y (PVY). – Potato Res. 49:
Ziemniak Polski 2012 nr 2
4
Hirata Y., Valkonen J. P. T. 2008. Combined
thermo-therapy and cryothermo-therapy for efficient virus eradication: relation of virus distribution, subcellular changes, cell survival and viral RNA degradation in shoot tips. – Mol. Plant Path. 9(2): 237-250; 15. Wang Q. C., Panis B.,
Engelmann F., Lambardi M., Valkonen J. P. T. 2009.
Cryotherapy of shoot tips: a technique for pathogen
eradication to produce healthy planting materials and prepare healthy plant genetic resources for
cryopres-ervation. – Ann. Appl. Biol. 154: 351-363;
16. Wang Q., Valkonen J. P. T. 2009. Cryotherapy of
shoot tips: novel pathogen eradication method. –
