Artyku³ przegl¹dowy Review
Szybki rozwój technik in¿ynierii genetycznej w ostat-nich latach umo¿liwia praktycznie wszelkie manipula-cje z materia³em genetycznym in vitro. Wiele proble-mów stwarza jednak wydajne i swoiste wprowadzanie DNA do komórki. Wprowadzany do komórek kwas dezoksyrybonukleinowy jest hydrofilowym wielkocz¹s-teczkowym polimerem o ujemnym ³adunku. Przecho-dzenie takiego biopolimeru przez b³onê komórkow¹ jest mocno utrudnione. Inn¹ powa¿n¹ przeszkod¹, jak¹ na-potyka wprowadzanie DNA do komórek, jest liniowy rozmiar tych makrocz¹steczek.
Trudnoci z wprowadzaniem DNA do komórek przy-czyni³y siê do opracowania wielu nowych technik trans-fekcji, z których kilka znalaz³o szersze zastosowanie. DNA mo¿na wprowadzaæ do komórki metodami fizy-kochemicznymi, do których zalicza siê elektroporacjê, precypitacjê, mikroiniekcjê i biolistykê. Z metod biolo-gicznych powszechnie wykorzystuje siê wektory wiru-sowe i niewiruwiru-sowe. Wektory wiruwiru-sowe oparte s¹ g³ów-nie na rekombinowanych retrowirusach i adenowiru-sach. Z wektorów niewirusowych najczêciej stosuje siê liposomy.
Proces integracji egzogennego DNA zaczyna siê w momencie wprowadzenia DNA do komórki. W wiêk-szoci przypadków w jego wejciu do j¹dra poredni-cz¹ naturalne procesy komórkowe. Po wejciu do j¹dra wiêkszoæ egzogennego DNA jest szybko degradowa-na. Ponadto stê¿enie wprowadzonego DNA spada wraz z kolejnymi podzia³ami komórkowymi. Jedynie cz¹s-teczki zawieraj¹ce miejsce startu replikacji w okrelo-nych warunkach mog¹ przetrwaæ d³u¿szy okres jako
au-tonomicznie replikuj¹ce episomy. W zale¿noci od ro-dzaju komórek w oko³o jednej na tysi¹c komórek wpro-wadzony DNA integruje z chromosomalnym DNA.
Egzogenny DNA mo¿e integrowaæ z genomowym DNA na drodze rekombinacji homologicznej lub nie-homologicznej (ryc. 1). W czasie rekombinacji homo-logicznej dochodzi do wymiany fragmentu chromoso-mu komórki gospodarza z fragmentem egzogennego DNA o podobnej sekwencji nukleotydów. Rekombina-cja homologiczna jest zjawiskiem naturalnym wystêpu-j¹cym m.in. podczas wymiany chromatyd siostrzanych. Poniewa¿ w przypadku rekombinacji homologicznej miejsce integracji oraz jej skutki mo¿na przewidzieæ,
Integracja DNA w transgenezie zwierz¹t*
)
DANIEL LIPIÑSKI*, EWA MICHALAK**, RYSZARD S£OMSKI*/** *Instytut Genetyki Cz³owieka PAN, ul. Strzeszyñska 32, 60-479 Poznañ
**Katedra Biochemii i Biotechnologii Wydzia³u Rolniczego AR, ul. Wo³yñska 32, 60-637 Poznañ
Lipiñski D., Michalak E., S³omski R. DNA integration in animal transgenesis
Summary
Foreign DNA can integrate into DNA genomes via two main classes of integration mechanisms: homo-logous recombination that draws on sequence similarity between the integrating sequences and the DNA genomes and non-homologous, or, illegitimate integration. Illegitimate integration of foreign DNA facilitates the modification of a cells genetic content and produces transgenic animals but this process can have dramatic repercussions on the content, organization, and function of the recipient genome. A better under-standing of the mechanisms and factors governing illegitimate DNA integration would help reduce the risk of unforeseeable genomic alterations. The article discusses the current state of knowledge about integrating foreign DNA and its consequences.
Keywords: transgenesis, DNA integration, DNA repair
*) Praca finansowana z grantów 048/P05/2001/03 i
PBZ-KBN-048/P05/2002/04.
Rekombinacja homologiczna
Przypadkowa integracja
a
b
Ryc. 1. Jeli wprowadza-ny DNA zawiera sekwen-cje homologiczne z geno-mowym DNA, to mo¿e zintegrowaæ w genom na drodze rekombinacji ho-mologicznej. Je¿eli nato-miast egzogenny DNA nie posiada takich sekwencji, to integruje w genom w przypadkowych miejs-cach poprzez rekombina-cjê niehomologiczn¹. Zja-wisko to wykorzystywane jest do uzyskiwania zwie-rz¹t trasngenicznych
zjawisko to próbuje siê wykorzystaæ w terapii genowej chorób. Z kolei w przypadku rekombinacji niehomolo-gicznej nie mo¿na przewidzieæ miejsca integracji egzo-gennego DNA z genomowym DNA komórki gospoda-rza, a na proces integracji nie ma wp³ywu obecnoæ se-kwencji homologicznych. Istniej¹ jednak przes³anki wiadcz¹ce o tym, ¿e w przypadku rekombinacji nieho-mologicznej miejsce integracji egzogennego DNA nie jest do koñca przypadkowe. Warto dodaæ, ¿e rekombi-nacja niehomologiczna jest równie¿ procesem wystê-puj¹cym naturalnie np. podczas translokacji chromoso-mowych czy przemieszczania siê transpozonów i retro-transpozonów.
Modyfikacje transgenu przed integracj¹ z chromosomowym DNA
Wprowadzony do komórki DNA jest na ogó³ bardzo szybko degradowany. Egzogenny DNA, który nie uleg-nie degradacji podlega licznym modyfikacjom (8). Li-niowa forma DNA po uprzedniej modyfikacji koñców (36) mo¿e byæ przekszta³cona w formê kolist¹, dziêki czemu unika szybkiej degradacji wynikaj¹cej z dzia³al-noci komórkowych egzonukleaz. Proces ³¹czenia koñ-ców jest niezale¿ny od stê¿enia DNA (3). Zarówno li-niowe, jak i koliste cz¹steczki egzogennego DNA mog¹ braæ udzia³ w procesie rekombinacji homologicznej wystêpuj¹cej pomiêdzy cz¹steczkami transgenu (9), co prowadzi do powstawania tzw. konkatamerów (10), czyli szeregowo po³¹czonych cz¹steczek transgenu. Najczê-ciej poszczególne kopie transgenu zorientowane s¹ w tym samym kierunku, tworz¹c tzw. tandemy proste. Znacznie rzadziej obserwuje siê cz¹steczki transgenu zorientowane w pozycji odwróconej (tandemy odwró-cone) (3). Oznacza to, ¿e rekombinacja homologiczna, która prowadzi do powstawania tandemów prostych od-grywa wa¿niejsz¹ rolê w tworzeniu konkatamerów ni¿ mechanizm ³¹czenia koñców (end-joining) (10). W miej-scu po³¹czenia siê cz¹steczek transgenu tworz¹cych kon-katamer mog¹ pojawiæ siê tzw. wype³niacze krótkie odcinki DNA nieznanego pochodzenia (36). Podobne zjawisko obserwuje siê zarówno w przypadku po³¹czeñ miêdzy transgenem a chromosomowym DNA (6, 37) jak i po³¹czeñ miêdzy genomem a regionem chromoso-mu, który uleg³ translokacji (27). Pomiêdzy cz¹steczka-mi transgenu mo¿e dochodziæ równie¿ do wycz¹steczka-miany frag-mentów DNA w procesie rekombinacji niehomologicz-nej (38). Egzogenny DNA integruje z genomowym najczêciej w postaci konkatamerów, poniewa¿ rekom-binacja pomiêdzy cz¹steczk¹ transgenu a chromosomo-wym DNA wystêpuje 106-108 razy rzadziej ni¿
pomiê-dzy cz¹steczkami transgenu (32). Ponadto przypadko-wa integracja transgenu wystêpuje ok. 1000 razy czê-ciej ni¿ rekombinacja homologiczna (29).
Od stopnia homologii sekwencji miêdzy transgenem a genomem biorcy oraz stadium cyklu komórkowego, w jakim znajduje siê komórka w momencie transfekcji, zale¿y, który z mechanizmów rekombinacyjnych zajdzie po wprowadzaniu egzogennego DNA do komórki. Re-kombinacja homologiczna zachodzi najczêciej w fazie S-G2 cyklu komórkowego, natomiast rekombinacja
nie-homologiczna wydaje siê niezale¿na od fazy cyklu ko-mórkowego (34). Wp³yw na rodzaj rekombinacji ma tak¿e postaæ transgenu. Transgen w formie liniowej ³at-wiej penetruje rodowisko komórki (4), czêciej ruje z genomowym DNA (10) i stymuluje raczej integ-racjê przypadkow¹ (20). Ponadto zajcie okrelonego rodzaju rekombinacji mo¿e stymulowaæ sekwencja wol-nych koñców transgenu wprowadzonego do komórki w formie liniowej. Z analizy DNA po³¹czeñ transgen chromosom wynika, ¿e w przypadku integracji nieho-mologicznej w miejscu po³¹czenia czêsto pojawiaj¹ siê 1-5 nukleotydowe sekwencje homologiczne (mikroho-mologiczne) niewiadomego pochodzenia (10, 29). Mo¿e to byæ rezultat czêciowego parowania zasad wystêpu-j¹cych na wystawystêpu-j¹cych jednoniciowych koñcach ³¹czo-nych fragmentów DNA (29). Od sekwencji wol³¹czo-nych koñców zale¿y, który mechanizm ³¹czenia siê wolnych koñców zostanie wykorzystany (zale¿ny od homologii lub niezale¿ny od homologii), a co za tym idzie, jaka bêdzie wydajnoæ procesu ³¹czenia.
Zwi¹zek miêdzy integracj¹ transgenu a napraw¹ dwuniciowych pêkniêæ w DNA Uwa¿a siê, ¿e w obu rodzajach rekombinacji g³ówn¹ rolê odgrywaj¹ mechanizmy naprawy dwuniciowych pêkniêæ w genomowym DNA. Pêkniêcia podwójnej he-lisy DNA pojawiaj¹ce siê w wyniku dzia³ania czynni-ków fizykochemicznych wymagaj¹ wystêpowania sys-temów monitorowania i naprawy powsta³ych uszkodzeñ. Istniej¹ce mechanizmy naprawy takich uszkodzeñ wy-korzystuj¹ wiele czynników i zjawisk dzia³aj¹cych nie¿ podczas procesów rekombinacyjnych, które s¹ rów-nie¿ inicjowane przez pojawienie siê pêkniêcia w po-dwójnej nici DNA. Niew³aciwe funkcjonowanie sys-temów naprawy DNA mo¿e prowadziæ do ró¿nego ro-dzaju zaburzeñ, a w konsekwencji do mierci komórki. Naturalne systemy naprawy i rekombinacji DNA umo¿-liwiaj¹ równie¿ integracjê egzogennego DNA w miej-scu dwuniciowego pêkniêcia. W komórkach ssaków dwuniciowe pêkniêcia DNA mog¹ byæ naprawiane za-równo przy pomocy mechanizmów wykorzystuj¹cych zjawisko rekombinacji homologicznej miêdzy uszko-dzonym DNA a DNA s³u¿¹cym jako substrat (16, 33), jak i mechanizmów wykorzystuj¹cych zjawisko rekom-binacji niehomologicznej (28).
Wród mechnizmów rekombinacji homologicznej bior¹cych udzia³ w naprawie dwuniciowego pêkniêcia DNA wyró¿nia siê obecnie 3 modele:
Model DSB (double-strand break) model naprawy dwuniciowych pêkniêæ DNA (33). Rekombinacja ho-mologiczna rozpoczyna siê dwuniciowym pêkniêciem, które za pomoc¹ egzonukleaz degraduj¹cych obie nici jest powiêkszane. Nastêpnie przerwa ta, uzupe³niana jest przez kopiowanie sekwencji homologicznej znajduj¹-cej siê w homologu (np. chromosomie homologicznym lub sekwencji homologicznej transgenu), poprzedzone obustronn¹ inwazj¹ na drug¹ cz¹steczkê DNA (dawcy). Mechanizm rekombinacji opisany za pomoc¹ modelu DSB jest mechanizmem konserwatywnym, poniewa¿ nie prowadzi do utraty informacji genetycznej.
Model SSA (single-strand annealing) model wy-d³u¿ania jednoniciowych odcinków DNA (16). Koñce DNA w miejscu dwuniciowego pêkniêcia s¹ degrado-wane za pomoc¹ specyficznej egzonukleazy, co prowa-dzi do ods³oniêcia sekwencji homologicznych, a nastêp-nie ich sparowania. Niehomologiczne fragmenty w miej-scu po³¹czenia zostaj¹ usuniête, a powsta³e przerwy uzu-pe³nione wg homologii drugiej nici. Poniewa¿ docho-dzi do utraty czêci sekwencji, opisany mechanizm jest mechanizmem rekombinacji niekonserwatywnej.
Model OSI (one-sided invasion) model jednostron-nej inwazji (2). W jedjednostron-nej cz¹steczce DNA (biorcy) w miejscu dwuniciowego pêkniêcia, nici 3 zostaj¹ za pomoc¹ egzonukleazy ods³oniête, a nastêpnie jedna z nich dokonuje inwazji na drug¹ cz¹steczkê DNA (daw-cy), co prowadzi do utworzenia pêtli D. Rozpoczyna siê polimeryzacja nici dokonuj¹cej inwazji i powiêk-szenie pêtli D. Nastêpnie nowo zsyntetyzowana niæ zo-staje rozwiniêta albo uwolniona po naciêciu nici stano-wi¹cej dla niej matrycê. Kolejnym etapem jest ligacja uwolnionej nici z koñcem nie dokonuj¹cym inwazji i wype³nianie powsta³ych luk. Model jednostronnej in-wazji mo¿e prowadziæ zarówno do rekombinacji kon-serwatywnej, jak i niekonserwatywnej.
W transgenezie zwierz¹t rekombinacjê homologicz-n¹ wykorzystuje siê najczêciej do inaktywacji genu. Konstrukcje genowe typu inaktywuj¹cego zawieraj¹ sek-wencjê genu, który ma byæ inaktywowany z wprowa-dzan¹ mutacj¹. Zwykle ekson koduj¹cy wa¿n¹ domenê bia³ka (lub koniec 5 tego regionu) zostaje przerwany pozytywnym markerem selekcyjnym, co uniemo¿liwia powstawanie prawid³owego mRNA. Gen mo¿e zostaæ inaktywowany równie¿ poprzez usuniêcie fragmentu lub ca³ego genu. W tym przypadku konstrukcja genowa musi zawieraæ sekwencje homologiczne do genomowego DNA, le¿¹ce bezporednio z obu stron regionu, który ma byæ usuniêty. W ten sposób mo¿na usun¹æ do 15 tysiêcy par zasad i ca³kowicie wyeliminowaæ wiele ge-nów. Podczas rekombinacji homologicznej nastêpuje wymiana genu zmutowanego z prawid³ow¹ sekwencj¹ genomowego DNA.
Prawie wszystkie konstrukcje genowe stosowane w rekombinacji homologicznej podlegaj¹ selekcji po-zytywnej na obecnoæ genu warunkuj¹cego opornoæ na antybiotyk (np. G418). Ten sam gen stosuje siê jed-noczenie do inaktywacji badanego genu. Selekcja ko-mórek antybiotykiem G418 (pochodna neomycyny) eliminuje zdecydowan¹ wiêkszoæ komórek, które nie maj¹ konstrukcji stabilnie zintegrowanej z genomem. Jednak¿e w wiêkszoci przypadków konstrukcja inte-gruje z genomem w sposób przypadkowy. Najczêciej stosowan¹ metod¹ eliminacji komórek z przypadkowo zintegrowan¹ konstrukcj¹ jest selekcja pozytywno-ne-gatywna. W tego typu konstrukcjach powy¿ej inakty-wowanego genu umieszcza siê negatywny marker se-lekcyjny, np. gen kinazy tymidyny wirusa Herpes sim-plex. W obecnoci tego genu komórki s¹ wra¿liwe na acyklovir i jego analogi (np. gancyklovir). Enzym kina-za tymidyny wprowadkina-za gancyklovir do syntetyzowa-nego ³añcucha DNA, powoduj¹c jego terminacjê i mieræ
komórki. Podczas rekombinacji homologicznej zostaj¹ utracone sekwencje le¿¹ce poza regionem homologii do genu. W przeciwieñstwie do tego, podczas przypadko-wej integracji wszystkie sekwencje w konstrukcji zo-staj¹ zachowane. Rekombinanty homologiczne s¹ opor-ne na G418 i oporopor-ne na gancyklovir, podczas gdy klony z przypadkowo zintegrowan¹ konstrukcj¹ s¹ oporne na G418, a wra¿liwe na gancyklovir. Oprócz kinazy tymi-dyny i gancykloviru zastosowanie znalaz³y tak¿e inne, równie¿ letalne dla komórek markery selekcyjne.
Celem eliminacji komórek z przypadkowo zintegro-wanym genem stosuje siê równie¿ konstrukcje, w któ-rych umieszcza siê region koduj¹cy marker selekcyjny pozbawiony promotora. Sekwencja koduj¹ca marker przerywa ekson badanego genu i jest zgodna z ramk¹ odczytu. Wprowadzenie do konstrukcji sekwencji IRES pozwala unikn¹æ potrzeby umieszczania genów selek-cyjnych zgodnie z ramk¹ odczytu, co znacznie uprasz-cza budowê konstrukcji. W ten sposób ekspresja mar-kera selekcyjnego jest uzale¿niona od promotora endo-gennego i zachodzi tylko w przypadku rekombinacji ho-mologicznej. W tym przypadku rekombinanty homolo-giczne s¹ oporne na antybiotyk G418, a komórki z przy-padkowo zintegrowan¹ konstrukcj¹ wra¿liwe na ten an-tybiotyk. Mo¿liwe jest równie¿ zastosowanie markera selekcyjnego pozbawionego sygna³u poli(A), co czyni jego transkrypt bardzo nietrwa³ym. Konstrukcjê geno-w¹ przygotowuje siê w taki sposób, aby po integracji konstrukcji, w przypadku rekombinacji homologicznej pojawi³ siê sygna³ poli(A). W ten sposób transkrypt genu selekcyjnego staje siê bardziej trwa³y, co umo¿liwia se-lekcjê pozytywn¹.
W przypadku genów, które s¹ niezbêdne dla rozwoju wczesna inaktywacja uniemo¿liwi³aby uzyskanie osob-nika doros³ego. Opónienie inaktywacji genu do czasu, a¿ zwierzê stanie siê doros³e umo¿liwi³oby jego nor-malny rozwój, a inaktywacja genu mog³aby nast¹piæ u doros³ego osobnika. System rekombinazy Cre-loxP umo¿liwia inaktywacjê genu ograniczon¹ czasowo, po-przez kontrolê aktywnoci lub ekspresji rekombinazy, jak i przestrzennie, dla okrelonego typu komórek lub tkanek, dziêki zastosowaniu promotorów komórkowo specyficznych lub promotorów indukowanych. System Cre-loxP pochodzi z bakteriofaga P1. Rekombinaza Cre dzia³a na miejsca loxP w DNA. Miejsce loxP sk³ada siê z dwóch palindromowych, 13 nukleotydowych sekwen-cji, rozdzielonych sekwencj¹ 8 nukleotydow¹. Je¿eli dwa miejsca loxP o tej samej orientacji znajduj¹ siê blisko siebie, rekombinaza mo¿e utworzyæ pêtlê z sekwencji le¿¹cej pomiêdzy dwoma takimi miejscami i usun¹æ j¹, pozostawiaj¹c jedno miejsce loxP w genomowym DNA, a drugie na kolistym fragmencie DNA zawieraj¹cym se-kwencjê wyciêt¹, szybko ulegaj¹c¹ degradacji. Je¿eli miejsca loxP znajduj¹ siê w przeciwnej orientacji, re-kombinaza Cre powoduje inwersjê sekwencji le¿¹cej pomiêdzy nimi. W obu przypadkach reakcja jest odwra-calna. W³aciwie zaprojektowana konstrukcja zawiera-j¹ca miejsca loxP mo¿e zostaæ zastosowana do wpro-wadzania subtelnych mutacji lub do czasowo albo prze-strzennie kontrolowanej inaktywacji. Poza
z¹ Cre równie¿ inne rekombinazy, takie jak rekombina-za FLP rozpoznaj¹ca na DNA miejsca FRT, mog¹ zo-staæ w podobny sposób wykorzystane.
Rekombinaza Cre mo¿e z powodzeniem zostaæ za-stosowana do usuwania markerów selekcyjnych, któ-rych obecnoæ w genomowym DNA mo¿e powodowaæ liczne niepo¿¹dane skutki. Konstrukcja genowa musi zawieraæ markery selekcyjne le¿¹ce pomiêdzy dwoma miejscami loxP, które maj¹ t¹ sam¹ orientacjê. Ekspres-ja rekombinazy Cre mo¿e nast¹piæ albo poprzez trans-fekcjê do komórek wektora ekspresyjnego produkuj¹-cego enzym Cre, albo przez lipofekcjê enzymu do ko-mórek. Po wyciêciu markera selekcyjnego w genomo-wym DNA pozostaje jedno miejsce loxP, ale konstruk-cja mo¿e byæ zaprojektowana w taki sposób, aby pozo-stawa³o w miejscu mniej istotnym, takim jak intron.
Mechanizm integracji niehomologicznej wydaje siê znacznie prostszy ni¿ przedstawione mechanizmy re-kombinacji homologicznej. Wykorzystuje system napra-wy pêkniêæ dwunicionapra-wych zwany ³¹czeniem koñców niehomologicznych (NHEJ nonhomologous end--joining). Proces ten mo¿e byæ wykorzystany nie tylko do naprawy pêkniêæ dwuniciowych powstaj¹cych w wy-niku dzia³ania promieniowania jonizuj¹cego oraz mu-tagenów chemicznych, ale równie¿ do ³¹czenia fragmen-tów egzogennego DNA z wolnymi koñcami DNA genomowego (8). W proces zaanga¿owane s¹ 4 grupy genów koduj¹ce z³o¿ony kompleks bia³kowy kieruj¹cy ligazê DNA do miejsca pêkniêcia. W sk³ad kompleksu wchodzi bia³ko Ku zbudowane z dwóch podjednostek Ku70 oraz Ku80, które wi¹¿¹ siê z DNA wraz z kinaz¹ bia³kow¹ zwan¹ DNA-PKCS, aktywuj¹c¹ trzecie bia³ko
XRCC4. Bia³ko XRCC4 oddzia³uje z ligaz¹ DNA IV, kieruj¹c j¹ w miejsce dwuniciowego pêkniêcia. Bia³ka naprawcze mog¹ równie¿ najpierw po³¹czyæ siê z wol-nymi koñcami wprowadzonego do komórki transgenu i skierowaæ je w pobli¿e dwuniciowego pêkniêcia DNA. W warunkach laboratoryjnych mo¿na zwiêkszyæ czês-toæ integracji stymuluj¹c powstawanie dwuniciowych pêkniêæ poprzez zastosowanie inhibitorów topoizome-raz, enzymów restrykcyjnych, czynników mutagennych czy promieniowania UV.
Efekty integracji egzogennego DNA
Integracja egzogennego DNA z genomowym DNA komórki biorcy mo¿e prowadziæ do ogólnej niestabil-noci genomu wystêpuj¹cej w miejscu wbudowania transgenu. Miejsce integracji staje siê podatne na muta-cje, które w zale¿noci od rodzaju komórek, jak i meto-dy transfekcji mo¿e byæ przyczyn¹ licznych zaburzeñ.
W przypadku mikroiniekcji DNA do zap³odnionego oocytu obserwuje siê wysok¹ miertelnoæ zarodków na bardzo wczesnym etapie rozwoju w porównaniu z gru-p¹ kontroln¹. Przyczyn¹ wysokiej letalnoci mog¹ byæ delecje genomowego DNA (7, 19) lub translokacje wza-jemne (18) w miejscu lub pobli¿u miejsca integracji transgenu. Mo¿liwe jest te¿ zaburzenie przez transgen ekspresji kluczowego dla rozwoju zarodka genu (37).
Uwa¿a siê, ¿e podobne zjawiska zachodz¹ w liniach komórkowych po transfekcjach (19). W liniach
komór-kowych obserwuje siê delecje genomowego DNA w po-bli¿u miejsca integracji egzogennego DNA (13), for-mowanie chromosomów dicentrycznych (25), tworze-nie kruchego miejsca w chromosomie (26). Jednak o wiele trudniej oceniæ miertelnoæ w liniach komórek hodowanych in vitro. Stosunkowo czêstym zjawiskiem w liniach komórkowych po transfekcjach sekwencjami wirusowymi (np. adenowirusami) jest transformacja nowotworowa, której przyczyn¹ jest niestabilnoæ ge-nomowa komórek (11). Ponadto zjawiska rearan¿acji genomowego DNA po integracji egzogennego DNA mog¹ sprzyjaæ transpozycji (przemieszczaniu siê) en-dogennych protoonkogenów, co równie¿ prowadzi do transformacji nowotworowej (23). Powsta³e mutacje (delecje, duplikacje, insercje) mog¹ utrzymywaæ siê w linii komórkowej (20).
Zjawiskiem czêsto pojawiaj¹cym siê w zwi¹zku z in-tegracj¹ egzogennego DNA w komórkach ssaków jest, pomimo stwierdzenia stabilnego wbudowania transge-nu w chromosom, wyciszenie ekspresji trasngetransge-nu. Od-kryto, ¿e miejsce wbudownia ulega metylacji de novo (22). Prawdopodobnie jest to swoista obrona komórki przed egzogennym DNA. Szczególnie podatne na zmia-ny w metylacji s¹ sekwencje powtarzalne (22). Ponie-wa¿ egzogenny DNA integruje najczêciej w postaci szeregów tandemowych, prowadzi to do ich metylacji i zablokowania ekspresji transgenu. Wraz ze wzrostem liczby kopii transgenu w szeregu tandemowym maleje poziom ekspresji transgenu (21). Wyniki przeprowadzo-nych dotychczas badañ nie s¹ dostatecznie wyczerpuj¹-ce, aby wyjaniæ, czy metylacjê stymuluje liczba kopii transgenu, czy te¿ jest to efekt wywo³any przez po³o¿e-nie transgenu w chromosomie. Dowiedziono rówpo³o¿e-nie¿, ¿e metylacja takiego szeregu transgenicznego mo¿e pro-wadziæ do lokalnego tworzenia heterochromatyny (14). W miejscu tym zbiegaj¹ siê trzy zjawiska: powtarzal-noci sekwencji (szereg tandemowy trasngenu), mety-lacji i heterochromatynizacji. Wyznaczenie wzajemnych relacji przyczynowo-skutkowych miêdzy nimi by³oby niezmiernie wa¿ne dla wyjanienia mechanizmów kie-ruj¹cych przebiegiem integracji egzogennych sekwen-cji z genomowym DNA oraz przewidywania skutków ich integracji.
Ponadto istnieje tak¿e fenomen zwany efektem po-zycji w chromosomie (PEV position effect variega-tion). Miejsce wbudowania transgenu ma wp³yw zarów-no na poziom ekspresji transgenu oraz czas jego akty-wacji, jak i na podatnoæ na ró¿nego typu rearan¿acje. Transgen nie bêdzie ulega³ ekspresji, je¿eli w³¹czy siê do transkrypcyjnie nieaktywnego regionu chromatyny. Aby temu zapobiec, mo¿na zastosowaæ w konstrukcjach genowych sekwencje regulacyjne typu MAR (matrix attachment regions) (30) i LCR (locus control region) (1) umo¿liwiaj¹ce, poprzez utrzymywanie otwartej struktury chromatyny, niezale¿n¹ od pozycji ekspresjê genu. Niezale¿n¹ od pozycji ekspresjê genu mo¿na rów-nie¿ osi¹gn¹æ za pomoc¹ wektorów episomalnych, sztucznych chromosomów lub wprowadzaj¹c transgen w specyficzne miejsca w genomie wykorzystuj¹c zja-wisko rekombinacji homologicznej.
Miejsce integracji czy w pe³ni losowe? Miejsca integracji egzogennego DNA w czasie rekom-binacji niehomologicznej nie mo¿na przewidzieæ i w zwi¹zku z tym uwa¿a siê je za losowe. Istniej¹ jednak przes³anki wiadcz¹ce o tym, ¿e nie s¹ to miejsca ca³ko-wicie przypadkowe.
Z danych literaturowych wynika, ¿e miejscem szcze-gólnie podatnym na integracjê niehomologiczn¹ s¹ sek-wencje powtórzone (13). Poniewa¿ jednak genom ssa-ków sk³ada siê w znacznej czêci z sekwencji powta-rzalnych, jest to stwierdzenie dosyæ ogólne. Znacznie bardziej interesuj¹ce s¹ doniesienia o integracji egzo-gennych sekwencji DNA w okrelone sekwencje powtó-rzone. Sekwencje wirusowe (w tym przypadku wirusa HIV) szczególnie czêsto integruj¹ w obrêbie dwóch naj-bardziej powtarzalnych sekwencji w genomie cz³owie-ka, tj. sekwencji L1 i Alu (31). Sekwencje L1 nale¿¹ do rodziny LINES i wystêpuj¹ w genomie w ok. 100 tysiê-cy kopii, natomiast Alu to sekwencje z rodziny SINES i liczba ich mo¿e dochodziæ do 900 tysiêcy. W innym dowiadczeniu stwierdzono czêstsz¹ integracjê transge-nu w indukowane chemicznie (specjalne warunki ho-dowli) miejsca kruche w chromosomie (26). Najbardziej poznane jest miejsce kruche chromosomu X u cz³owie-ka, w którym stwierdzono wystêpowanie powtórzeñ CGG (im wiêcej takich tripletów tym objawy niedoroz-woju umys³owego s¹ bardziej widoczne) (24).
Wykonano tak¿e szereg dowiadczeñ, gdzie transge-nem by³y sekwencje powtarzalne. Transfekcja komórek CHO sekwencjami a-satelitarnymi lub syntetycznym
polimerem poli(dGdT)200 powodowa³a liczne rearan¿a-cje chromosomowe w komórkach, prowadz¹ce do nie-stabilnoci genomu (12). Eksperyment, w którym wpro-wadzano sekwencje telomerowe wykaza³, ¿e integro-wa³y one w pobli¿u telomerów wystêpuj¹cych w ko-mórce (15). Nie stwierdzono jednak, jak¹ rolê w inte-gracji transgenu, w zwi¹zku z podobieñstwem jego sek-wencji do seksek-wencji miejsca, w którym nast¹pi³a jego integracja, odegra³y mechanizmy zwi¹zane z zjawiskiem rekombinacji homologicznej.
Inne doniesienia wskazuj¹, ¿e oprócz specyficznoci sekwencji, preferowan¹ cech¹ miejsca wbudowania transgenu mo¿e byæ jego topologia. Ogólnie mówi siê o zagiêtej strukturze DNA (bent DNA) jako struktu-rze sprzyjaj¹cej rekombinacji niehomologicznej. Obec-noæ takich struktur zaobserwowano w czasie replika-cji, transkrypcji i rekombinacji homologicznej, ale od-naleziono je tak¿e w odleg³oci ok. 1 kb od miejsca po-³¹czenia transgenchromosom po zajciu rekombinacji niehomologicznej (21). W zwi¹zku z tym powsta³a hi-poteza, ¿e miejsca aktywne transkrypcyjnie s¹ miejsca-mi podatnymiejsca-mi na integracjê niehomologiczn¹ (11), a na-wet ¿e wysoka aktywnoæ transkrypcyjna u³atwia pro-ces integracji (35). Oczko replikacyjne, a wiêc otwarta struktura DNA tworz¹ca siê podczas replikacji, czêsto jest uwa¿ana za czynnik sprzyjaj¹cy integracji nieho-mologicznej (3).
Stwierdzono, ¿e zarówno topoizomeraza I (wprowa-dzaj¹ca jednoniciowe naciêcia w DNA), jak i topoizo-meraza II (dwuniciowe naciêcia) mog¹ uczestniczyæ w przebiegu rekombinacji niehomologicznej. Topoizo-meraza II rozpoznaje sekwencje typu MAR wi¹¿¹ce DNA ze szkieletem j¹drowym. Niektórzy autorzy uwa-¿aj¹, ¿e sekwencje MAR s¹ miejscem czêstego wbudo-wywania transgenu (30). Doniesiono równie¿ o prefe-rencyjnym integrowaniu sekwencji wirusa SV40 w po-bli¿e miejsca rozpoznawanego przez topoizomerazê I (5). Ca³kowicie unikalne miejsce integracji transgenu – Aktywne geny
– Region po³¹czenia z matriks – Region kontroluj¹cy locus Ryc. 2. W obrêbie euchromatyny zawieraj¹cej aktywne geny obserwuje siê pêtle w³ókna chromatynowego 30 nm po³¹czo-ne z matriks j¹drow¹ za pomoc¹ regionów bogatych w AT, zwanych rejonami po³¹czenia z matriks (MAR). Tego typu sekwencje chroni¹ jednostki transkrypcyjne le¿¹ce w obrê-bie jednej pêtli DNA przed wp³ywem elementów regulatoro-wych, takich jak wzmacniacze czy wyciszacze, kontroluj¹cych ekspresjê genów w s¹siaduj¹cych pêtlach DNA oraz zapobie-gaj¹ heterochromatynizacji. Pêtle DNA po³¹czone z matriks j¹drow¹ nazwano domenami strukturalnymi. W obrêbie do-men strukturalnych wystêpuj¹ obszary DNA otaczaj¹ce gen lub grupê genów ulegaj¹cych ekspresji, tworz¹ce domeny funkcjonalne. W utworzeniu i utrzymaniu otwartej domeny funkcjonalnej mog¹ braæ udzia³ sekwencje DNA, zwane re-gionami kontroluj¹cymi locus (LCR)
Ryc. 3. Lokalizacja transgenu metod¹ FISH na chromoso-mach metafazowych transgenicznego królika 5K7 (pokole-nie F1 po króliku NT20). Transgen WAP(6xHisThr):hGH zmapowano w uk³adzie heterozygotycznym w chromosomie 7q26-27
zaobserwowano podczas spontanicznego pobierania eg-zogennego DNA przez spermatocyty myszy. Sugeruje siê jednak, ¿e wp³yw na przebieg procesu integracji ma proces retranspozycji (17).
Podsumowanie
Zjawisko nieuprawnionej integracji egzogennego DNA umo¿liwia modyfikacjê genetyczn¹ organizmów. Skutki takiej integracji s¹ na dzieñ dzisiejszy nieprze-widywalne. Egzogenny DNA integruje z genomem bar-dzo rzadko. Zintegrowany z genomowym DNA trans-gen mo¿e nie ulegaæ ekspresji albo poziom jego eks-presji mo¿e byæ niewystarczaj¹cy. Ponadto ekspresja transgenu mo¿e siê pojawiaæ w niew³aciwych tkankach lub niew³aciwym stadium rozwoju organizmu. Uzyska-nie linii zwierz¹t transgenicznych o odpowiednio wy-sokim poziomie ekspresji transgenu, ograniczonej do jednego typu tkanki i odpowiedniego stadium rozwoju, wymaga wyprodukowania i zbadania wielu linii trans-genicznych zwierz¹t. Zrozumienie mechanizmów kie-ruj¹cych integracj¹ egzogennego DNA z genomowym DNA komórki gospodarza umo¿liwi opracowanie me-tod, które pozwol¹ przewidzieæ skutki integracji. Mo¿-liwe stanie siê równie¿ opracowanie substancji bloku-j¹cych proces ³¹czenia koñców niehomologicznych, co w przysz³oci pozwoli zastosowaæ terapie genowe w le-czeniu chorób o pod³o¿u genetycznym.
Pimiennictwo
1.Antoniou M., Harland L., Mustoe T., Williams S., Holdstock J., Yague E., Mulcahy T., Griffiths S., Edwards S., Ioannou P. A., Mountain A., Crombie R.: Transgenes encompassing dual-promoter CpG islands from the human TBP and HNRPA2B1 loci are resistant to heterochromatin-mediated silencing. Genomics 2003, 82, 269-279.
2.Belmaaza A., Wallenburg J. C., Brouillette S., Gusew N., Chartrand P.: Genetic exchange between endogenous and exogenous LINE-1 repetitive elements in mouse cells. Nucleic Acids Res. 1990, 18, 6385-6391. 3.Bishop J. O.: Chromosomal insertion of foreign DNA. Reprod. Nutr. Dev.
1996, 36, 607-618.
4.Bishop J. O., Smith P.: Mechanism of chromosomal integration of micro-injected DNA. Mol. Biol. Med. 1989, 6, 283-298.
5.Bullock P., Champoux J. J., Botchan M.: Association of crossover points with topoisomerase I cleavage sites: a moel for nonhomologous recombina-tion. Science 1985, 230, 954-958.
6.Chen C. M., Choo K. B., Cheng W. T.: Frequent deletions and sequence aber-rations at the transgene junctions of transgenic mice carrying the papilloma-virus regulatory and the SV40 TAg gene sequences. Transgenic Res. 1995, 4, 52-59.
7.Covarrubias L., Nishida Y., Terao M., DEustachio P., Mintz B.: Cellular DNA rearrangements and early developmental arrest caused by DNA inser-tion in transgenic mouse embryos. Mol. Cell. Biol. 1987, 7, 2243-2247. 8.Dellaire G., Yan J., Little K. C., Drouin R., Chartrand P.: Evidence that
extrachromosomal double-strand break repair can be coupled to the repair of chromosomal double-strand breaks in mammalian cells. Chromosoma 2002, 111, 304-312.
9.Folger K. R., Thomas K., Capecchi M. R.: Nonreciprocal exchanges of infor-mation between DNA duplexes coinjected into mammalian cell nuclei. Mol. Cell. Biol. 1985, 5, 59-69.
10.Folger K. R., Wong E. A., Wahl G., Capecchi M. R.: Patterns of integration of DNA microinjectes into cultured mammalian cells: evidence for homo-logous recombination between onjectes plasmid DNA molecules. Mol. Cell. Biol. 1982, 2, 372-1387.
11.Heller H., Kammer C., Wilgenbus P., Doerfler W.: Chromosomal insertion of foreign (adenovirus type 12, plasmid, or bacteriophage l) DNA is associated with enhanced methylation of cellular DNA segments. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995, 92, 5515-5519.
12.Heartlein M. W., Knoll J. H., Latt S. A.: Chromosome instability associated with human alphoid DNA transfected into the chinese hamster genome. Mol. Cell. Biol. 1988, 8, 3611-3618.
13.Kato S., Anderson R. A., Camerini-Otero R. D.: Foreign DNA introduced by calcium phosphate is inetgrated into repetitve DNA elements of the mouse L cell genome. Mol. Cell. Biol. 1986, 6, 1787-1795.
14.Keshet I., Lieman-Hurwitz J., Cedar H.: DNA methylation affects the forma-tion of active chromatin. Cell 1986, 44, 535-543.
15.Kilburn A. E., Shea M. J., Sargent R. G., Wilson J. H.: Insertion of a telomere repeat sequence into a mammalian gene causes chromosome instability. Mol. Cell. Biol. 2001, 21, 126-135.
16.Lin F. L., Sperle K., Sternberg N.: Model for homologous recombination during transfer of DNA into mouse L cells: role for DNA ends in the recom-bination process. Mol. Cell. Biol. 1984, 4, 1020-1034.
17.Magnano A. R., Giordano R., Moscufo N., Baccetti B., Spadafora C.: Sperm/ DNA interaction: integration of foreign DNA sequences in the mouse sperm genome. J. Reprod. Immunol. 1998, 41, 187-196.
18.Mahon K. A., Overbeek P. A., Westphal H.: Prenatal lethality in a transgenic mouse line is the result of a chromosomal translocation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988, 85, 1165-1168.
19.Mark W. H., Signorelli K., Blum M., Kwee L., Lacy E.: Genomic structure of the locus associated with an insertional mutation in line 4 transgenic mice. Genomics 1992, 13, 159-166.
20.Merrihew R. V., Marburger K., Pennington S. L., Roth D. B., Wilson J. H.: High-frequency illegitimate integration of transfected DNA at preintegrated target sites in a mammalian genome. Mol. Cell. Biol. 1996, 16, 10-18. 21.Milot E., Strouboulis J., Trimborn T., Wijgerde M., de Boer E., Langeveld A.,
Tan-Un K., Vergeer W., Yannoutsos N., Grosveld F., Fraser P.: Heterochro-matin effects in the frequency and duration of LCR-mediated gene transcrip-tion. Cell 1996, 87, 105-114.
22.Muller K., Heller H., Doerfler W.: Foreign DNA integration. J. Biol. Chem. 2001, 276, 14271-14278.
23.Murnane J. P.: Inducible gene expression by DNA rearrangements in human cells. Mol. Cell. Biol. 1986, 6, 549-558.
24.Oostra B. A., Willemsen R.: The X chromosome and fragile X mental retar-dation. Cytogenet. Genome Res. 2002, 99, 257-264.
25.Randal J. K., Sharp P. A., Latt S. A.: Evolution of chromosomal regions containing trasnfected and amplified dihydrolate reductase sequences. Mol. Cell. Biol. 1983, 3, 699-711.
26.Rassool F. V., McKeithan T. W., Neilly M. E., van Melle E., Espinoza III R., Le Beau M. M.: Preferential integration of marker DNA into the chromoso-mal fragile site at 3p12: an approach to cloning fragile sites. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991, 88, 6657-6661.
27.Roth D. B., Chang X. B., Wilson J. H.: Comparison of filler DNA at immune, nonimmune, and oncogenic rearrangements suggests multiple mechanisms of formation. Mol. Cell. Biol. 1989, 9, 3049-3057.
28.Roth D., Wilson J.: [w:] Kucherlapati R., Smith G. R. (red.): Genetic Recom-bination. American Society for Microbiology, Washington DC 1988, 621--653.
29.Roth D. B., Wilson J. H.: Nonhomologous recombination in mammalian cells: role for short sequence homologies in the joining reaction. Mol. Cell. Biol. 1986, 6, 4295-4304.
30.Sperry A. O., Blasquez V. C., Garrard W. T.: Dysfunction of chromosomal loop attachement sites: illegitimate recombination linked to matrix associa-tion regions and toposomerase II. Proc. Natl Acad. Sci. USA 1989, 86, 5497--5501.
31.Stevens S. W., Griffith J. D.: Human immunodeficiency virus type 1 may preferentially integrate into chromatin occupied by L1Hs repetitive elements. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994, 91, 5557-5561.
32.Subramani S., Rubnitz J.: Recombination events after transient infection and stable integration and stable integration of DNA into mouse cells. Mol. Cell. Biol. 1985, 5, 659-666.
33.Szostak J. W., Orr-Weaver T. L., Rothstein R. J., Stahl F. W.: The double--strand break repair model of recombination. Cell 1983, 33, 25-35. 34.Takata M., Sasaki M. S., Sonoda E., Morrison C., Hashimoto M., Utsumi H.,
Yamaguchi-Iwai Y., Shinohara A., Takeda S.: Homologous recombination and non-homologous end-joining pathways of DNA double-strand break repair have overlapping roles in the maintenance of chromosomal integrity in vertebrate cells. EMBO J. 1998, 17, 5497-5508.
35.Thyagarajan B., Johson B. L., Campbell C.: The effect of target site trascrip-tion on gene targeting in human cells in vitro. Nucleic Acids Res. 1996, 23, 2784-2790.
36.Wake C. T., Gudewicz T., Porter T., White A., Wilson J. H.: How damaged is the biologically active subpopulation of transfected DNA? Mol. Cell. Biol. 1984, 4, 387-398.
37.Wilkie T. M., Palmiter R. D.: Analysis of the integrant in MyK-103 trans-genic mice in which male fails to transmit the integrant. Mol. Cell. Biol. 1987, 7, 1646-1655.
38.Wilson J.H., Berget P. B., Pipas J. M.: Somatic cells efficiently join unrela-ted DNA segments end-to-end. Mol. Cell. Biol. 1982, 2, 1258-1269. Adres autora: dr Daniel Lipiñski, ul. Strzeszyñska 32, 60-479 Poznañ; e-mail: lipin1@poczta.onet.pl
